生物细胞分析范文1
[关键词] 肝细胞癌；血清；代谢物组；LC-MS；主成分分析；模式识别
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] C[文章编号] 1674-4721（2011）06（a）-085-02
目前，临床上诊断肝癌的主要方法为病理、影像和血清AFP检查。这些检测手段中，病理法属于有创性检查，对患者造成组织损伤，不能作为常规检查方法；B超、CT、磁共振成像对小肝癌灶检出率较低；血清AFP检查诊断肝癌灵敏度低，因此，建立一种无损、准确、灵敏的肝癌诊断方法具有重要的临床价值。代谢组学是一种通过考察生物体系受刺激或扰动后代谢产物随时间的变化，并以此来研究生物体系代谢途径的新技术[1-2]。代谢组学作为新兴的学科，已成功应用于疾病诊断、药物作用模型的鉴别和确证、药物作用机制研究等领域[3-6]。目前代谢组学分析中常用的两种检测手段是核磁共振（NMR）技术和质谱（MS）及其联用技术。相比于NMR灵敏度低、检测动态范围窄等弱点，现代MS技术的优势是具有很高的灵敏度和专属性，可以实现对多个化合物的同时快速分析与鉴定，现已成为生物分析中的首选方法。本研究采用LC-MS法检测肝癌患者和健康人血清中代谢物，比较分析两组血清代谢物组的差异，同时利用PCA对MS数据进行模式识别，以期建立肝癌的诊断模型。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
Agilent 1100型高效液相色谱仪，Agilent LC/MSD Trap XCT Plus 型质谱仪、高压二元梯度泵、二极管检测器、自动进样器、柱温箱、Chemstations化学工作站等（美国Agilent公司），日立20PR-52D型高速冷冻离心机，电热真空干燥箱（上海申光仪器仪表有限公司），KQ- 250 DE型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司），Milli-Q纯化水制备系统(Millipore公司)。甲醇、乙腈均为色谱纯（美国fisher公司）。
1.2 样品的采集
分别采集30份男性肝癌患者以及30份健康男性 （无相关病史的健康人群)受试者静脉血5 ml 至促凝管中，室温下静置1 h后在4℃、13 000 g离心10 min），置-80℃贮存备用。采血前禁食12 h。肝癌诊断标准按照2001年中国抗癌协会肝癌专业委员会修订的肝癌临床诊断标准[8]，上清液LC-MSn分析。
1.3 LC-MS 条件
反向液相色谱（RP-LC），色谱柱：Prevail C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相A：10mM甲酸铵缓冲液（甲酸调PH 4.0）；B：0.1%甲酸乙腈，A与B梯度洗脱：0～5 min，B%10～30，5～9 min，B% 30～60，9～20 min，B%60～70，20～25 min，B%70～100；柱温：25°C；流速：0.8 ml/min；质谱条件：ESI离子源，离子源温度350℃，毛细管电压3.5 kV，雾化压力285.8 kPa，雾化压力60.0 Psi，干燥气流速11.0 L/min，质谱扫描范围75～800 m/z，正离子检出模式。
2 结果
2.1 血清样品检测总离子流图
按照以上实验方法，对血清样本进行了分析测定，图1中A、B分别是健康人和肝癌患者血清典型的LC-MS总离子流谱，图中可见，正常人血清样本的总离子流图与肝癌患者血清样本的总离子流图有明显区别。
A为健康人血清；B为肝癌患者血清
转贴于
2.2 肝癌的生物标记物
通过LC-MS检测，与正常人相比，肝癌患者血清中牛磺酸和组氨酸含量减少，而苯丙氨酸、酪氨酸含量增加。牛磺酸是重要的抗氧化物质，曾有研究报道，其在肝硬化患者血清中含量增加，而肝癌患者血清中牛磺酸含量没有改变[7]，但笔者研究发现牛磺酸在肝癌患者血清中含量减少，推测牛磺酸的含量与肝癌病情程度有关，需要进一步研究。
2.3 模式识别分析
利用PCA对正常人和肝癌患者两组血清LC-MS数据进行模式识别分析，得到相应血清标本的PCA得分图（3D PCA Scores plot)。得分图中每一个点代表了一个标本，见图2。从图2中可以直观地看出各血清标本在空间上的位置以及相互聚合程度，图2中肝癌和健康人标本显著分离，说明两者血清代谢物组确实存在显著差异。
3 讨论
为了探讨利用代谢组学技术结合模式识别分析诊断肝癌的可行性，对肝癌患者血清LC-MS数据进行PCA分析。结果表明肝癌患者可与健康人标本100%区分开来，利用基于LC-MS代谢组学技术结合PCA的模式识别方法诊断肝癌诊断结果可靠。有利于临床早期诊断、早期治疗肝癌。此外，由于代谢组学反应的是基因和蛋白表达终端的变化、是对基因组学和蛋白组学在代谢物研究上的放大，因此利用此技术诊断疾病更灵敏、快速。
[参考文献]
[1]罗和古，丁杰，岳广欣，等.大鼠肝郁脾虚证的代谢组学研究[J].中西医结合学报，2007，5(3):307-313.
[2]Jeffrey R，Idle1，Frank J，Gonzalez．Metabolomics[J].Cell Metabolism，2007， 12(6):348-350.
[3]Clayton，T.A，Lindon，J.C，Cloarec，O，et al.Pharmacometabonomic phenotyping and personalized drug treatment[J].Nature，2006，440(7087):1073-1077.
[4]黄成钢.中药研究的必然趋势—中药复方系统研究[J].中国药学杂志，2000，35(7):4331.
[5]周宏伟，谭凤仪，钟音，等.代谢组学及其在微生物领域的研究进展[J].分析化学，2007，35(2):309-314.
生物细胞分析范文2
关键词 动物科学专业；细胞分子生物学；实验教学改革；能力培养
中图分类号 G642.0 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）11-0270-02
Exploration on Experimental Teaching Reform of Cell Molecular Biology for Animal Science Major
ZHAO Jia-fu 1，2 DUAN Zhi-qiang 1，2 ZHANG Yi-yu 1，2 NI Meng-meng 1，2 RUAN Yong 1，2
（1 Key Laboratory of Animal Genetics Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region，Ministry of Education，Guiyang Guizhou 550025； 2 College of Animal Science，Guizhou University）
Abstract As an essential course，cell molecular biology plays an important role in the training of high-quality innovative talents in the field of life science.Along with the rapid development of life science，more and more attention to the cultivation of students′ ability to operate experiments need to be improved，especially as an agricultural subject with extensive application.In order to improve students′ interest in experiment course of molecular biology and promote the students′ ability of experiment operation，this paper discussed the reform of experiment teaching content，experiment teaching methods，teaching evaluation ways of animal science，and put forward the concrete reform plan，based on the experimental teaching experiences of cell molecular biology.In conclusion，this article has important guiding significance to the cultivation of the students′ practical ability and research quality.
Key words animal science major；cell molecular biology；experimental teaching reform；ability training
细胞分子生物学是研究细胞内核酸、蛋白质等生物大分子的结构与功能，并从分子水平上阐述它们之间相互作用的关系及基因表达调控机理的学科[1]，现已广泛应用于生物医学、农林牧渔等学科领域。我国是畜牧业生产和消费大国，需要大量基础理论扎实、创新实践能力强的畜牧科技人才。因此，重视畜牧兽医类本科生细胞分子生物学的理论与实践教学工作，引导学生发现问题、分析问题、解决问题，并进一步加强其动手能力和创新能力的培养，对培养畜牧兽医领域的复合型创新人才具有重要意义。动物科学专业作为生命科学领域一门实践性较强的学科，毕业生应具备牢固的专业理论知识和较强的实践动手能力[2]。以贵州大学为例，该校动物科学专业一直以来没有分子生物学这门基础课程，然而为培养学生基本的分子生物学实验操作能力，又区别于生物学相关专业，因而学校增加了细胞分子生物学这门课程供学生选修。P者结合具体实践教学经验，从实验教学内容、教学方法、组织形式、考核方式等方面进行论述。
1 实验教学内容的改革
1.1 增加实验教学课时比例
在贵州大学2016版动物科学专业培养方案中，与分子生物学实验相关的专业课程只有动物分子遗传学和细胞分子生物学2门课程。动物分子遗传学为专业个性选修课，占2学分，共36学时，其中理论课28学时，实验课8学时；细胞分子生物学为学科大类选修课，占4学分，其中理论课72学时，实验课时。从基本的课时设置上不难看出，细胞分子生物学实验课时与理论课时比例严重失调，许多重要的实验难以开设，培养学生分子生物学实践操作能力的效果大大折扣。因此，亟须调整本校动物科学专业教学方案，增加细胞分子生物学实验课时所占比例。
1.2 编写适于动物科学专业的实验教学指导
目前，大部分高校细胞分子生物学课程均采用现成的实验教学指导，实验内容大同小异，并未体现出生物科学、生物技术、生物工程等理学类相关专业和动物科学、动物医学、水产养殖、草业科学等农学类相关专业在教学对象上的区别，均以大肠杆菌这类模式生物为实验对象，没有体现出不同专业研究对象的区别。因此，需要编写适合动物科学专业的细胞分子生物学实验教学指导，将动物组织中RNA的提取、不同组织中mRNA的表达差异检测、细胞中总蛋白的提取与分离鉴定等实用性、针对性强的实验编入教学指导。
1.3 改单个实验为综合性设计实验
根据贵州大学动物科学专业细胞分子生物学培养方案中实验课时的规定，同时为加强贵州大学动物科学专业细胞分子生物学实验课程的针对性和实用性，目前该实验课程只能安排4 个单个实验项目共时，分别是目的基因的扩增与连接、细胞的培养与冻存、细胞蛋白的提取与鉴定、细胞蛋白的免疫荧光染色。由于每节课只有2 h，所以对于许多实验项目学生只能参与其中的部分内容，有些实验的来龙去脉很多学生还没有搞清楚。为达到开设这门课程的目的，尝试将单个实验全部设计为综合性实验，每个综合性实验融合了多个单个实验[3]，如猪GH基因原核表达载体的构建及表达、猪LPL基因的亚细胞定位研究、猪MSTN基因在不同组织的表达差异研究、猪APOA1基因在HEK-293T细胞中的免疫荧光检测、HEK-293T细胞总蛋白的提取、纯化与鉴定等综合性实验，这些实验学生只要参与完成其中一个项目，就基本上掌握了分子生物学的常用实验操作技能。
2 实验教学方法的改革
2.1 现有实验教学方法的弊端
一是教师课堂上讲授，学生到实验室验证，这种教学方式没有发挥学生的主观能动性，学生处于被动接受的状态，很难引起学生学习的积极性；二是教师准备好实验，学生只完成验证的那部分实验，这种方法无法培养学生发现问题、分析问题和解决问题的能力，更难以培养学生基本实验的操作能力；三是针对部分实验，存在教师操作、学生观看的现象，如与细胞培养相关的实验，由于本科教学与研究生教学相比，参加实验人数多，易造成细胞室污染，所以很多实验都由任课教师亲自完成，学生基本上采用观摩的形式参与其中。以上教学方法上的弊端，严重影响了本专业学生实验动手能力的培养，不利于学生自身的发展。
2.2 实验教学方法改革的具体方案
“翻转课堂”是一种新型的教学理念，最早由教育学者萨尔曼・汗创造性地提出，该模式提出了混合使用技术和亲自动手活动的教学环境[4]。它把传统的“灌输式”教学完全翻转，转变成学生课前预习、提前领会知识要点的教学方式，是一种强调自主性和针对性的教学理念[5-6]，对提高实验教学水平，培养出基础知识扎实、具有应用性和开拓性的创新型人才具有重要意义。为达到培养学生实践动手能力的目的，细胞分子生物学实验课程也引进“翻转课堂”的教学理念，转变师生角色，以学生为主体，发掘学生的个人潜力，培养学生的团队协作精神。按照“翻转课堂”的教学模式，在充分发挥学生主观能动性的前提下，制定细胞分子生物学实验教学方法改革具体方案。一是教师设计好综合性实验项目名称，提前供学生选择（至少10个综合性性实验项目名称）；二是按项目分组（每组7～10人），选出组长，分工进行资料查询、方案设计和PPT制作；三是每组20 min进行PPT汇报，任课教师随堂对方案进行点评修改；四是参照实验方案开展研究，学生不必受实验课程时间的限制，在实验教师的参与下，根据各自时间安排完成整个实验项目；五是撰写实验项目报告，并写出个人体会和相关收获。
3 实验教学考核方式的改革
3.1 现有实验教学考核方式的弊端
以往的实验教学考核方式过于简单，且没有统一的标准，只注重是否来上课、是否交了实验报告、实验结果是否合理等方面，忽略了学生在发现问题、主动思考、团队协作、解决问题和语言表达等环节综合能力的考核。因此，实验教学考核方式的改革，应更重视学生综合运用所学知识分析问题和解决问题等方面能力的考察[7]。
3.2 实验教学考核方式改革的具体方案
考核标准和考核方式对教师和学生都具有指挥棒的作用。考核什么、怎么考核直接影响到教师如何教、教什么和学生怎么学、学什么的问题。本实验课本着对学生发现问题、分析问题、解决问题及实验操作等方面能力的培养，特制定如下考核方案：按百分制，其中实验方案设计和PPT报告占40%，实验技能操作和实验报告占30%，实验技术提问和团队协作占20%，考勤和纪律占10%。这样的考核标准不仅可以公正、公平地衡量学生的实验成绩，更重要的是调动了学生学习的积极性和自主性，锻炼了学生发现问题、分析问题和解决问题的能力。
4 结语
通过对动物科学专业细胞分子生物学实验内容、教学方法和考核方式的改革，进一步打破了实验教学与科学研究之间的界限，使学生能够根据自己的兴趣开展实验研究，充分体现了学生作为实验教学的主体地位，不仅锻炼了学生发现问题、分析问题和解决问题的能力，还锻炼了学生实验操作、文献检索、PPT制作、团队协作及语言表达等方面的能力，达到了实验教学与科研素质培养的有机结合，为其今后从事相关研究工作或进一步深造奠定了坚实基础。
5 参考文献
[1] 聂俊，杨冬芝，杨晶.细胞分子生物学[M].北京：化学工业出版社，2009.
[2] 孙淑霞，闫峰，杨月春，等.动物科学专业实践教学模式研究与实践[J].黑龙江畜牧兽医，2014（10）：188-190.
[3] 郑小坚，何俊，贡成良，等.多学科融合分子生物学实验网络教学平台的设计与实现[J].实验技术与管理，2016（1）：140-142.
[4] 吴玲.融合翻转课堂理念教学凸显创新高效[N].中国教育报，2015-04-29（007）.
[5] 王丽君，李萌，阳小华.翻转课堂中学习绩效提升研究[J].扬州大学学报（高教研究版），2016（2）：80-84.
生物细胞分析范文3
【摘要】
为了研究多发性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）病人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSC）的病理生物学特性，以探讨MSC在MM骨损伤发生中的作用，取11例初治MM病人和5例正常人骨髓，用贴壁法体外分离培养MSC 。应用流式细胞术分析MM骨髓MSC表型，MTT法检测MSC增殖能力，组织化学染色测定细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化能力。应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）测定细胞培养上清液中白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor， SCF）浓度。收集MSC培养上清作为条件培养液，按梯度浓度加入人SKO007骨髓瘤细胞系培养体系中，MTT法测定细胞增殖能力差异。结果表明：与正常人骨髓MSC比较，MM患者骨髓MSC的表型无改变，均一表达CD29、CD73、CD166和HLA-ABC，不表达CD45和CD31； MM患者骨髓MSC增殖和分化能力正常，且具有相似的成骨和成脂肪分化功能； MM骨髓MSC分泌IL-6和SCF的水平均明显高于正常； MM来源的MSC培养上清显著促进SKO007细胞的增殖。结论： MM患者骨髓MSC的增殖分化功能正常，MM时骨损伤可能与MSC分化功能无关，而IL-6和SCF高表达为骨髓瘤细胞提供了必要的生存信号。
【关键词】 间充质干细胞; 多发性骨髓瘤; 细胞因子
Biological Properties of Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow of Patients with Multiple Myeloma
AbstractThe study was purposed to explore the role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the pathogenesis of bone disease particularly observed in multiple myeloma (MM)， the biological features of marrow derived MSCs from patients with MM have been investigated. Marrow aspirates were harvested from 11 newly diagnosed patients with MM and 5 normal adults and MSCs were isolated and culture-expanded by the cell properties of adherence to plastic flasks， The phenotype was analyzed by flow cytometric technique. The proliferation of MSCs was observed by MTT assay and their differentiation capacities into osteoblasts and adipoblasts were assessed with lineage-specific histochemical staining. The concentrations of IL-6 and SCF in the culture supernatant were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). MSC culture supernatants were collected and MTT assay was performed to evaluate their support on the proliferation of an MM cell line SKO007 cells. The results showed that bone marrow-derived MSCs from MM patients were homogenously positive for CD29， CD73， CD166 and HLA-ABC and negative for hematopoietic cell marker CD45 and endothelial cell marker CD31， the phenotype of which was similar to that of marrow counterparts from normal adults. MTT assay indicated that MSCs from MM patients or normal adults proliferated at similar rates. MSCs from MM patients occupied in vitro osteogenic and adipogenic capacity as those from normal adults. The levels of IL-6 and SCF in culture supernatant were greatly up-regulated in MM patients by ELISA assay. Furthermore， MSC culture supernatants from MM bone marrow displayed enhanced activity to promote the proliferation of SKO007 cells. It is concluded that marrow-derived MSCs from bone marrow of MM patients are normal in their proliferation and differentiation capacities， and myeloma bone disease may not be ascribed to the differentiation of MSCs while the elevated secretion of IL-6 and SCF may provide necessary cues for the survival of malignant myeloma cells.
Key wordsmesenchymal stem cell; multiple myeloma; cytokine
多发性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）患者呈现特征性的骨质破坏。这种骨质损伤与破骨细胞数量增加，成骨细胞数减少，从而导致骨吸收与成骨之间失平衡有关［1］。间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSC）是存在于骨髓的结缔组织干细胞，不但可以向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化，而且是骨髓基质细胞的前体细胞［2］。骨髓基质细胞为骨髓瘤细胞提供了必需的生存和增殖支持，并由此促进破骨细胞的增殖分化，导致溶骨性损伤［3］；而骨髓瘤细胞可通过细胞因子分泌和(或)细胞间的直接接触，引起成骨细胞的凋亡［4］。但是，以上这些病理改变是否涉及MSC本身，抑或MSC的某些改变促进了疾病进程尚不清楚。为此，我们对骨髓瘤MSC的特性进行了研究。
材料和方法
材料来源
11例MM均为初治患者，男7例，女4例，平均年龄59.4岁; IgG型6例， IgA型3例， κ轻链型2例。对照骨髓来源于骨髓象和血象检查正常的健康人，共5例，其中男3例，女2例，平均年龄51.7岁。SKO007 MM细胞株为本研究所传代的细胞株。
骨髓MSC的分离和培养
按参考文献［2］的方法，取肝素抗凝的骨髓，α-MEM稀释2倍后Percoll梯度密度离心收获单个核细胞。将细胞接种于含10%人骨髓MSC专用培养血清的α-MEM中（血清为Stem Cells公司产品），培养48小时后去除非贴壁细胞，继续培养至贴壁细胞约80%融合，收集培养上清于-70℃冻存备用。0.05%胰蛋白酶消化传代培养。第3代细胞用于以下实验。
细胞免疫表型分析
胰蛋白酶消化收集MSC，加入FITC或PE标志的小鼠源抗人CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CD166、HLA-ABC和HLA-DR单克隆抗体（eBioscience公司产品），室温下避光反应30分钟。用PBS洗涤2次后，FACSCalibur (Becton Dickinson， USA)收集细胞参数，用流式细胞仪检测，WinMDI 2.9软件分析结果。
增殖能力的MTT法测定
收集MSC，按750个细胞/孔接种于含MSC完全培养液的96孔培养板中，每组6孔；将SKO007细胞按1000/孔接种于不含血清的RPMI 1640 培养液的96孔培养板中，培养体系中分别加入10%、20%和40%的MSC培养上清，每组4孔。细胞培养72小时后加入10 μl MTT（1 g/L），继续培养4小时。离心去除培养液，加入二甲亚砜裂解细胞，以未加MTT孔为本底，570 nm波长下测定OD值。
多系分化的鉴定
成骨分化将细胞按5×104/孔接种于6孔培养板，或1×104/孔接种于24孔培养板中，加入地塞米松（10-7mol/L）、维生素C（50 mg/L）和β-磷酸甘油（10 μmol/L），培养12天，期间换液2次。应用白细胞ALP染色试剂（Sigma公司产品）进行碱性磷酸酶原位染色。
成脂肪分化将细胞按2×104/孔接种于24孔培养板中，次日加入地塞米松（10-6mol/L）、IBMX（0.5 mmol/L）和消炎痛（10 μmol/L），连续培养7天后去除培养基，用PBS洗涤2次后多聚甲醛室温固定1小时，1%油红O染色，光学显微镜下观察。
MSC的细胞因子分泌功能测定
消化传代细胞培养至贴壁层致密时，更换无血清的α-MEM，培养48小时后收集培养上清，于-70℃冻存备用。按照试剂盒（Bio-Rad产品）操作说明，应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）测定，依据由重组人白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor， SCF）（Peprotech产品）所作的标准曲线，测定培养上清IL-6和SCF浓度。
统计学处理
试验数据以平均值±标准差（±SD）表示，以t检验进行数据分析，P值
结果
MM患者与正常人骨髓MSC免疫表型的比较
体外培养的MM患者和正常人骨髓MSC均一地表达间充质细胞标志CD73和CD166，表达黏附分子CD29，不表达造血细胞标志CD45和内皮细胞标志CD31。此外，细胞表达HLA-I类分子(HLA-ABC)，不表达HLA-DRII类分子。MM骨髓MSC表型与正常人来源MSC相似， MM患者骨髓MSC表型无改变（图1）。
MM患者骨髓MSC增殖能力分析
利用MTT法检测第3代细胞增殖速率。MM患者骨髓MSC与正常人骨髓MSC组比较没有显著差异，OD值分别为0.46±0.11与0.39±0.08 (P>0.10) ，MM患者骨髓MSC增殖能力正常（图2）。
MM患者与正常人骨髓MSC体外成骨和成脂肪能力比较
MM患者和正常人骨髓MSC经成骨诱导体系培养后，细胞形态均发生了明显的变化，部分细胞由纺锤形转变为多边形或不规则形状；12天后经NBT-BCIP染色显示细胞碱性磷酸酶（ALP）活性，MM患者骨髓与正常人骨髓组细胞显色强度比较无明显差别（图3A、B），显示MM患者骨髓MSC成骨能力并没有减低。应用成脂肪诱导体系作用7天，油红O染色显示两组细胞体外成脂肪性能未见明显差别，MM患者骨髓MSC体外成骨和成脂肪能力正常（图3C、D）。
MM患者与正常人骨髓MSC的IL-6和SCF表达量比较
1×106 MM患者骨髓MSC细胞48小时分泌的IL-6总量显著高于正常人骨髓MSC，分别为(9.36±2.11)ng 和(4.72±1.64)ng（P
MSC培养上清对SKO007细胞的增殖支持作用
将SKO007细胞用无血清体系培养，加入不同浓度的MSC培养上清，72小时后MTT法测定细胞活力。结果表明：未加条件培养液组大部分细胞死亡；加入10%和20%条件培养液后，两组细胞增殖能力无差别；浓度升至40%时，MM患者骨髓MSC培养上清明显促进SKO007细胞增殖，两组比较差异有统计学意义（P
讨论
MM是B细胞克隆性疾病，肿瘤细胞刺激骨吸收，促进血管形成，导致溶骨性骨损伤，即使化疗成功实施后，骨损伤仍然存在，提示骨髓中成骨细胞的干细胞—MSC可能存在本质的异常。MSC是存在于骨髓的结缔组织干细胞，是骨髓基质细胞的前体细胞。骨髓基质细胞与骨髓瘤细胞相互影响，促进破骨细胞的增殖分化和成骨细胞凋亡。为此，我们分离培养了初治MM骨髓MSC，并与来自年龄相近正常人骨髓的MSC比较，观察MM患者骨髓MSC是否存在生物学特性的异常。结果表明，体外培养的这两种来源MSC表型一致，均不表达造血细胞和内皮细胞的标志，提示MM血管形成可能与MSC向内皮细胞的分化无关。MM患者骨髓MSC不表达HLA-DR，提示MM病人骨髓微环境中炎性因子或相关的调控因素使MSC维系了固有的表型。MSC具有很强的体外增殖和多向分化能力。MM病人骨髓中成骨细胞数量减少［4］，可能与 MM骨髓MSC的增殖分化能力有关。本研究采用MTT法检测MSC细胞增殖速率，结果显示MM骨髓源MSC增殖能力与正常骨髓源MSC比较没有显著差异，提示MM病人的MSC增殖能力正常。在体外，MM骨髓MSC经成骨诱导体系培养后，具有正常的体外成骨能力，且与正常人骨髓MSC相似; MSC体外成脂肪能力与正常骨髓MSC亦相当。本研究表明，MM病人MSC体外增殖分化能力维持在正常水平，骨髓瘤细胞没有改变MSC固有的自我更新和多向分化能力。然而研究已发现，骨髓瘤细胞与成骨细胞系共培养后成骨细胞株Runx-2基因表达下调，从而抑制成骨细胞向骨细胞分化成熟［5-7］。因此，骨髓瘤骨疾病涉及的病理改变可能发生于成骨细胞阶段，而与MSC分化能力无关。研究已经表明，MSC和骨髓基质细胞可分泌G-CSF、GM-CSF、VEGF、SCF及IL-6等多种细胞因子［3，8， 9］，这些因子相互影响，形成网络调节骨髓瘤细胞的生物学特性［10］，促进骨髓瘤细胞增殖和存活。人骨髓瘤细胞也表达成骨细胞特异性转录因子Runx2，并分泌骨桥蛋白（osteopontin， OPN）［7］。研究发现OPN也与胃癌的侵袭转移有关［11］。骨髓基质细胞分泌IL-6等细胞因子，促进骨髓瘤细胞分泌与成骨发育相关的因子，以抑制成骨新生，促进骨溶性损伤［3，12］。骨髓瘤细胞是骨髓中碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor， bFGF）的主要来源。bFGF促进骨髓组织新生血管形成、刺激基质细胞分泌IL-6［13］。人骨髓MSC也表达bFGF受体。骨髓瘤病人MSC细胞分泌异常可能与体内异常细胞因子网络调节有关。本研究发现，在体外，MM患者骨髓MSC分泌的IL-6和SCF量明显高于正常人骨髓MSC，而细胞培养上清促进骨髓瘤细胞SKO007增殖。MM患者骨髓MSC表型和增殖分化功能与正常MSC相当，这提示骨髓MSC在MM病人体内受到骨髓瘤细胞的直接刺激作用后，高表达IL-6和SCF，并以旁分泌的形式维系瘤细胞的恶性表征，从而间接影响成骨和骨吸收过程，这可能是骨髓瘤并发骨疾病的原因之一。
总之，多发性骨髓瘤病人骨髓MSC生物学性状与正常骨髓MSC比较无明显变化，而其高表达IL-6与SCF可能与骨髓瘤细胞的直接作用有关。本实验研究了骨髓瘤MSC的表型、增殖分化、功能等特征，其结果为MM骨损伤的发生机制及其干预治疗等的研究提供了重要信息。
【参考文献】
1 Barille-Nion S， Bataille R. New insights in myeloma-induced osteo- lysis. Leuk Lymphoma， 2003; 44:1463-1467
2 Guo Z， Yang J， Liu X， et al. Biological features of mesenchymal stem cells from human bone marrow. Chin Med J（Engl）， 2001; 114:950-953
3 Roodman GD. Role of the bone marrow micro environment in multiple myeloma. J Bone Miner Res，2002; 17:1921-1925
4 Silvestris F， Cafforio P， Calvani N， et al. Imparied osteoblastogenesis in myelomal bone disease: role of upregulated apoptossis by cytokines and malignant plasma cells. Br J Haematol， 2004; 126:475-486
5 Giuliani N， Colla S， Sala R， et al. Human myeloma cells stimulate the receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) in T lymphocytes: a potential role in multiple myeloma bone disease. Blood， 2002; 100:4615-4621
6 Giuliani N， Colla S， Morandi F， et al. Myeloma cells block RUNX2/CBFA1 activity in human bone marrow osteoblast progenitors and inhibit osteoblast formation and differentiation. Blood， 2005; 106:2472-2483
7 Colla S， Morandi F， Lazzaretti M， et al. Human myeloma cells express the bone regulating gene Runx2/Cbfa1 and produce osteopontin that is involved in angiogenesis in multiple myeloma patients. Leukemia， 2005; 19:2166-2176
8 Tocci A， Forte L. Mesenchymal stem cell: use and perspectives. Hematol J， 2003; 4:92-96
9 林如峰， 陆化， 刘澎等. 蛋白酶体抑制剂PS-341对多发性骨髓瘤骨髓间充质干细胞多种细胞因子表达的影响. 中国实验血液学杂志，2006；14：61-64.
10 Lauta VM. A review of the cytokine network in multiple myeloma: diagnostic， prognostic， and therapeutic implications. Cancer， 2003; 97:2440-2452
11 张东涛，袁静，杨力等. 骨桥蛋白在胃癌中的表达及与胃癌侵袭转移的关系. 中华肿瘤杂志，2005; 27:167-169
12 Karadag A， Scutt AM， Croucher PI. Human myeloma cells promote the recruitment of osteoblasts precursors: mediation by interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptor. J Bone Miner Res， 2000; 15:1935-1943
生物细胞分析范文4
方法：选取我院收治的87例急性药物性间质性肾炎患者作为研究对象，将患者随即分成观察组（45例）和对照组（42例），观察组使用促红细胞生成素联合甲泼尼龙冲击进行治疗，对照组行甲泼尼龙冲击治疗。治疗后观察两组患者的治疗情况以及少尿期、多尿期、蛋白尿和血尿症状消失时间和肾功能恢复正常时间。
结果：观察组45例患者中病情完全缓解的有41例，比例为91.1%，对照组病情完全缓解23例，比例为54.8%，两组患者对比具有明显的统计学意义（P
结论：促红细胞生成素联合甲泼尼龙冲击治疗急性药物性间质性肾炎具有良好的效果，应该在临床中予以大力推广。
关键词：急性药物性间质性肾炎促红细胞生成素甲泼尼龙
【中图分类号】R4【文献标识码】B【文章编号】1671-8801（2013）11-0268-02
急性药物性间质性肾炎（DAIN）是临床上常见的肾脏损害病症，其致病机制是由于患者长期大量使用抗生素、非甾体类抗炎药、利尿药等药物进而引发非免疫介导间质性损伤[1]。该病如果早期发现基本上都能得到有效的治疗，但是如果延误了治疗时机很有可能造成恶性肾功能损害[2]。本院运用促红细胞生成素联合甲泼尼龙冲击对急性药物性间质性肾炎患者进行了治疗，具体内容如下。
1资料与方法
1.1一般资料。本文选取我院于2007年3月至2010年3月收治的87例急性药物性间质性肾炎患者作为研究对象，所有患者均无肾病既往史，经入院后检查均确诊为DAIN。致病原因为：抗生素药物51例，质子泵抑制剂药物11例，非甾体药物9例，中药9例，混合药物5例，不明药物所致2例。尿常规检查结果：蛋白尿73例，血尿61例，白细胞尿86例；血肌酐检查176～1228μmol/L。将87例患者随机分为观察组45例和对照组42例，两组患者在性别、年龄、病程、致病药物、家庭支持等方面均无显著差异（P>0.05）。
1.2一般方法。患者入院后检测致病药物，即时停服该药物，维持电解质平衡[3]。对照组给予500mg/次甲泼尼龙静脉滴注，1d/次，连续滴注三天。后口服0.5mg/kg/d泼尼松，25d为一个疗程；观察组在对照组治疗的基础上运用促红细胞生成素进行联合治疗，加注3000U皮下注射促红细胞生成素，1周3次，持续25天。
1.3统计学方法。应用SPSS16.0统计学软件对上述治疗进行数据的分析，计量资料采用均数±标准差表示，进行t检验，计数资料进行X2检验，P
2结果
治疗后，观察组患者的少尿期、多尿期、蛋白尿和血尿消失时间以及肾功能恢复时间各项指标均优于对照组，经统计学分析两组患者四项指标对比均具有统计学意义（P
3结论
急性药物性间质性肾炎是在短期内发病的肾间质炎症，其临床特征较为明显，一般表现为间质水肿和肾小管受损，有的患者还会伴有肾功能不全等症状。大多数的急性药物性间质性肾炎在停止服用致病药物后能够有一定程度缓解，经过及时的诊断治疗多数可以治愈。如果得不到有效的治疗或者再次服用致病药物有可能产生变态反应进而发展成严重肾衰竭，因此早期发现及时治疗是降低该病危害的重要措施。通过本次研究可以发现，促红细胞生成素联合甲泼尼龙冲击对于治疗急性药物性间质性肾炎具有良好的效果，值得在临床中进行推广。
参考文献
[1]吴昱，苏涛，杨莉等.几种尿标志物在急性药物性肾小管间质性肾炎鉴别诊断中的意义[J].北京大学学报（医学版），2010（02）：164-168
生物细胞分析范文5
流式细胞仪的介绍
流式细胞仪是一种比较先进的新型高科技仪器设备，整合了单克隆抗体技术、细胞荧光化学技术、计算机技术、光电测量技术、电子物理技术和激光技术等诸多先进技术，能够在快速直线流动的细胞或生物颗粒中，实现快速定量分析多种参数及分选目标细胞亚群的功能。目前，随着技术水平的不断发展，流式细胞仪得到了进一步的完善，在细胞分析及分选中能够发挥出更大的作用。流式细胞仪在生物化学、细胞遗传学、细胞生物学、肿瘤学、血液学和免疫学等诸多基础医学或临床医学领域中都有所应用，为临床疾病的研究提供了巨大的帮助。流式细胞仪的构成主要包括了四个部分，分别是计算机及分析系统、光电管及检测系统、激光源及光学系统、流动式及液流系统。
流式细胞仪的操作使用方法
使用流式细胞仪前，操作人员需要进行调试和校准，确保仪器最佳的运行状态。调试内容主要包括了测量区光路、液流速度、激光强度等。操作使用中，操作人员先将电源打开，并预热系统，然后将气体阀打开，调节压力参数，得到适合的液流速度，并将光源冷却系统开启；将去离子水加入样品管中，冲洗液流喷嘴系统；使用校准标准物品调整仪器，调定放大器电路增益、光电倍增管电压、激光功率，确保散射荧光强度达到最高，变异系数达到最小；选定测量参数、测量细胞数、流速后，以相同工作条件，分别测量目标样品及对照样品；选择计算机屏上数据显示方式，直接观察和了解测量进程；测量完成后使用去离子水冲洗液流系统；实验数据存入计算机系统后，关闭气体阀及测量装置，让计算机处理数据，得出最终结果。
流式细胞仪在医学检验中的应用
在医学检验中，流式细胞仪的具体应用非常广泛，本文只选取几个比较有代表性的应用予以介绍。
（一）在肿瘤学中的应用
流式细胞仪在肿瘤细胞学诊断中，能够达到较高的准确率。相关人员可以使用该仪器开展细胞周期分析、DNA倍体分析、检测细胞增殖标志物定量分析、细胞表面物质分析、癌基因蛋白产物分析、耐药蛋白分析、细胞凋亡分析等。通过检测可以得到更加充足的信息，在肿瘤的临床诊断、治疗、预防中，提供依据和指导，辅助选择化疗药物及放疗时间强度，同时还可早期诊断癌症，鉴别肿瘤良恶性等。利用流式细胞仪检测肿瘤细胞多药耐药相关蛋白表达水平，医生能够辅助选择肿瘤化疗药物，并监测判断肿瘤化疗效果。
（二）在免疫学中的应用
流式细胞仪可用于测定淋巴细胞亚群，如NK淋巴细胞群、B淋巴细胞群、T淋巴细胞群等。自身免疫性疾病患者，淋巴细胞水平可能会升高，如自身免疫性溶血、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等。免疫缺陷性疾病的患者，自身免疫功能下降，因而淋巴细胞水平较低，如再生性贫血障碍、活动性肝硬化、肿瘤、病毒感染、艾滋病等。在具体的临床应用中，通过测定CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞的水平占比，能够监测免疫反应患者、自身免疫性疾病患者、免疫缺陷疾病患者的免疫状态。
（三）在血液病中的应用
生物细胞分析范文6
关键词：肺癌；A 549细胞：MRC-5细胞；细胞生长；哌啶并噻吩：结构活性关系
中图分类号：Q279
文献标识码：A
文章编号：1007-7847（2014）05-0382-05
肺癌是世界范围内发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一。近年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性肺癌发病率和死亡率占女性所有恶性肿瘤的第二位[1]。肺癌的治疗方法主要有手术治疗、放射治疗、药物治疗、靶向治疗、综合治疗等，药物治疗及靶向治疗在其中占据了重要的地位[2]。目前，临床上常用的治疗肺癌的药物有贝伐单抗、西妥昔单抗、长春新碱等，虽然这些药物对肺癌有一定的疗效，但也存在着很大的毒副作用及机体对药物的极大的耐药性问题，因此，开发疗效显著、靶向性强、毒剐作用小的新型治疗药物显得尤为重要[3]。
化学合成的有机小分子是一种相对分子质量小、容易进入细胞、可以与其中的蛋白质分子结合并影响蛋白活性的一种化合物。在抗肿瘤药物的筛选中，这种小分子化合物也得到广泛的应用，筛选有活性的小分子化合物是其中的第一步。一口.筛选到活性化合物，该化合物就被视为可能的药物先导化合物，后续可进行结构修饰、药理学研究、药代动力学分析等药物开发的相关研究工作。、此外，就算筛到的活性化合物不适合作为药物开发对象，进一步寻找该化合物的作用靶点及作用机制，电可发现一些与肿瘤发生发展相关的重要的新的基因，从而为药物研发提供新的靶点，因此也是具有重要意义的[4，5]。在20世纪八九十年代，快速合成结构多样的有机小分子的技术发腱成熟，随后商业化的小分子化合物大量出现，为抗肿瘤药物筛选及肿瘤发生机制的研究提供了丰富的资源[6]。
在医药的研究发展过程中，含氮杂环化合物因其具有独特的生物活性、低毒性等，常被作为医药创制的基本结构单元[7-9]1。为了寻找高活性的新型化合物，本研究从实验室现有的小分子化合物库中选取13个含有哌啶并噻吩为母核，成氯盐，目前国内外文献未见报道的新型化合物，在体外培养肺癌A549细胞中，研究其对细胞生长的抑制作用；并分析了化合物结构与活性之问可能存在的关系。对活性最高（对A549细胞生长的抑制率最高）的化合物进行了抑制A549细胞生长的浓度依赖效应分析及对正常人胚肺成纤维MRC-5细胞的生长抑制作用研究。
1 材料与方法
1.1 材料
人肺癌细胞系A549由昆明理工大学医学院张继红老师馈赠，正常人胚肺成纤维细胞系MRC-5购自中国科学院昆明动物研究所细胞胞库，小分子化合物购自Life Chemicals。研究中所用主要试剂包括：改良型RPMI-1640培养荩fIIv一clone）、DMEM培养基（Hyclone）、胎牛血清（Scien―Cell）、特级胎牛血清（Gibco）、青链霉素混合液液（So一larbio）、胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio）、二甲基亚砜（DMSO，Solarbio）。WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）。
1.2 细胞培养
从液氮罐中取出细胞，复苏后置于6 cm直径的细胞培养皿中，放在37 ℃、5% C02条件下的细胞培养箱（Thermo）中培养。A549细胞完个培养基包括改良型RPMI-1640培养基、10%的胎牛血清（ScienCell）、1%的青链霉素混合液；MRC-5细胞完全培养基包括DMEM培养基、15%的特级胎牛血清（Gibco）、1%的青链霉素混合液。复苏后生长状况良好的细胞，传代至10 cm直径的细胞培养皿中扩大培养，以备后续试验使用。选取生长状态良好处于对数生长期的细胞接种于96孔板，用于小分子化合物活性检测试验。
1.3 .13 个小分子化合物对A549细胞生长的抑制作用分析
将处于对数生长期的A549细脆，接种于96孔板，铺板密度为2xl04 cells/mL，即每孔为2000个细胞，体积为100 μL。细胞接种24h后，向其中分别加入各小分子化合物（终浓度为10μmol/L）体积为1μL，对照孔中加入等体积的DMSO（终浓度为0.5%），每个处理设3个重复（每个小分子及DMSO均分别处理3个孔的细胞），再补加细胞完全培养基100 μL。小分子化合物处理48 h后，每孔加入WST-1溶液20 μL，在培养箱内继续孵育2～4 h，然后用酶标仪在450 nm波长处测定吸光值，所得数据用于结果分析。1.4 小分子化合物11抑制A549细胞生长的浓度依赖效应分析及对MRC-5细胞生长的抑制作用分析
将处于对数生长期的A549细胞和MRC一5细胞，接种于96孔板，铺板密度为2x104 cells/mL，即每孔为2 000个细胞，体积为100 μL。细胞接种24 h后，向其中分别加入不同浓度的化合物1 1（噻吩并[2， 3-c]哌啶-3-甲酰胺一2一[（3一甲氧基一萘-2-羰基）一氨基卜6-苄基一，盐酸盐；Thieno[2，3 -c] piperidine一3-carboxamide -2 -[（3 -methoxy -naphthalene -2 -carbonyl） -amino] -6 -（benzyl） -，hy-drochloride）（终浓度分别为1、2.5、5、10 μmol/L），体积为1μL，对照孔中加入等体积的DMSO （终浓度为0.5%），每个处理设3个重复（不同浓度的小分子及DMSO均分别处理3个孔的细胞），再补加细胞完全培养基100 μL。小分子化合物处理48 h后，每孔加入WST-1溶液20 μL，在培养箱内继续孵育2～4 h，然后用酶标仪在450 nm波长处测定吸光值，所得数据用于结果分析。该化合物抑制A549细胞生长的IC50值用GraphPad Prism软件计算。
2 结果与分析
2.1 13个小分子化合物对A549细胞生长的抑制作用
本研究所用的13个化合物是具有相同核心结构（图1）的类似物，并成氯盐。因其核心结构含哌啶并噻吩结构，所以我们暂时把这一类小分子命名为哌啶并噻吩类化合物。核心结构中的R1、R2代表不同的结构基团。化合物1～4的Rl结构基团为甲氧羰基，5―8的R1结构基团为氰基，9～13的R1结构基团为氨甲酰基（表1）。
用化合物（终浓度10 μmol/L）处理A549细胞48 h后，用WST-1法检测细胞的存活情况，通过与对照细胞（DMSO）的存活情况进行比较，来计算各化合物对A549细胞生长的抑制率（表1）。R1结构基团均为甲氧羰基的化合物中，对A549细胞生长的抑制率最高的是化合物4，抑制率为（26.58+3.65）%；R1结构基团均为氰基的化合物中，对A549细胞生长的抑制率最高的是化合物7，抑制率为（46.59+8.68）%；R1结构基团均为氨甲酰基的化合物中，对A549细胞生长的抑制率最高的是化合物11，抑制率为（71.34+0.96）%。2.2 小分子化合物11抑制A549细胞生长的剂量效应及对MRC-5细胞生长的抑制作用
13个小分子化合物中对A549细胞生长抑制率最高的化合物1 1，我们又进行了不同浓度的化合物11对A549细胞和MRC-5细胞生长的抑制作用分析。结果显示，该化合物对A549细胞生长的抑制作用具有明显的浓度依赖效应，A549细胞的存活率随化合物11浓度的增加而逐渐降低，在终浓度为10 μmol/L的时候，抑制率达到最大。用GraphPad Prism软件计算出该化合物抑制A549细胞生长的1C50为2.407 μmol/l.。虽然MRC-5细胞的存活率也随化合物11浓度的增加而有所降低，但终浓度为10 μmol/L时，其对MRC-5细胞生长的抑制率也只有30.41%（图2）。
由此可见，化合物11对A549细胞生长的抑制作用是一种特异的作用，而非简单的细胞毒性，同时该化合物对MRC-5细胞生长的抑制率远小于对A549细胞生长的抑制率，这些特征都暗示我们该化合物或许可作为治疗肺癌药物先导化合物来进行药物研发。
3 讨论
A549细胞系是1972年由GJiard等从58岁的白种男性的肺腺癌组织移植，通过体外培养建立的细胞系，一方面具有Ⅱ型肺泡上皮细胞的形态及特性，另一方面表现出典型的肺腺癌细胞恶性特征。因此，A549细胞系被广泛用于抗肺癌药物筛选及其他肺癌相关研究中。
本研究中，检测细胞存活情况采用的是WST-1法。WST-1是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其他MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点，具有快速、简便、准确等特点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的甲瓒（formazan）不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-1和XTT、MTS产生的甲瓒都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤；其次，WST一1产生的甲瓒比XTT和MTS产生的甲瓒更易溶解；再次，WST-1比XTT和MTS更加稳定，使试验结果更加稳定。另外，WST-1和MTT'、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高；是体外筛选抗癌新药的可靠方法。
含氮杂环母核的化合物一直是研究的热点，但目前哌啶并噻吩类化合物研究相对较少，只有曾国平等报道9个合成的未见报道的新型哌啶并噻吩并嘧酮衍生物中，部分化合物有较好的抑制黄瓜灰霉、水稻纹枯、小麦赤霉菌生长的活性，本研究所筛选的化合物是13个未见报道的哌啶并噻吩类化合物.在体外培养A549细胞，利用W-ST-1法检测化合物处理后细胞存活率的变化，发现了部分化合物能不同程度抑制A549细胞生长，其中化合物II对A549细胞生长的抑制效率最高，但对正常MRC-5细胞牛长的抑制作用显著低于对A549细胞生长的抑制作用，这一新的发现也为肺癌治疗药物的开发提供了新的思路。
通过对13个小分子化合物结构与活性之间可能存在的关系进行分析，发现Rl结构基团为甲氧羰基的4个化合物中，化合物4的活性最高，化合物1、2、3活性相对较低的原因可能是R2结构基团相对大.导致空间阻力大，使得与受体结合不够强：Rl结构基团为氰基的4个化合物中，化合物5、6、7的活性差不多，其中化合物5、6可能因为R2结构基团有苯并杂环结构，化合物7需要待一步研究；R1结构基团为氨甲酰基的4个化合物中，化合物Il的活性最高，可能因为其R2结构基团有苯并结构及苯环结构的完整性。化合物结构与活性之问关系的初步分析也为以后的化合物结构优化设计及计算机辅助药物筛选提供了一定的思路。
