【摘要】食品生物技术是高校食品相关专业的一门十分重要的专业课程，是专业性强且多学科交叉的综合性学科。由于课程技术原理和内容较多且复杂，导致教学效果并不理想。为了提高学生的学习兴趣和对知识的综合运用能力，本文以食品生物技术课程的核心内容基因工程为主，设计实践课程内容，以激发学生的学习兴趣，提高学生的综合、创新和创造能力。
【关键词】食品生物技术；实践；设计
1前言
生物技术是当今高科技领域发展最快、最引人注目的前沿学科之一。食品生物技术是生物技术在食品领域的重要运用，是食品相关专业教学的重要内容[1]。通过运用生物技术来对食品进行生产或改造，可提高食品产值，改善食品品质，提升农副产品附加值，对推动农业产业化发展和食品安全提供了保障[2]。《食品生物技术》作为一门综合性学科，包括基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程、发酵工程、生物工程下游技术及现代食品检测技术等主要内容[3]，涉及内容广，综合性强，学习难度大[4]。由于缺乏实践教学的设计，学生对理论课知识的认知仍然欠缺，理论联系实际的能力不足，所以需要开展食品生物技术的综合型探索性实践课程，以激发学生学生的兴趣和积极性，帮助学生更加全面了解和掌握该课程中涉及的理论知识和技术原理，巩固专业知识基础,完成理论课知识的验证，最终提高学生的综合、创新和创造能力[5]。本文根据我们食品生物技术课程实践教学设计成功经验，从提高学生学习兴趣及实践能力，以及提高学生的创新意识的角度，以食品生物技术的核心内容基因工程作为实践课程设计的内容，为食品生物技术实践教学设计提供一些思路，为食品生物技术这门课程的讲授提供参考。
2基因工程实验设计
2.1实验目的
掌握与基因工程基本操作步骤有关的实验技能：熟悉基因组DNA、质粒工具载体的提取方法，DNA浓度的测定方法，聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR），限制性内切酶与DNA的消化，琼脂糖凝胶电泳，DNA连接与TA克隆及感受态细胞的转化及利用α互补筛选细菌克隆的方法。
2.2仪器与试剂
材料：过夜培养的含质粒大肠杆菌菌液100mL，大肠杆菌感受态细胞，未线性化的细菌质粒100µL，具有T突出的T-载体，正向引物（5'-AGAGTTTGATCCTG⁃GCTCAG-3'）；反向引物（5'-GGCTACCTTGTTAC⁃GACTT-3'），试管，培养皿若干。试剂：无水乙醇，TE缓冲液（10mmol/LTris•HCl（pH8.0）、1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）），LB液体培养基，琼脂，琼脂糖粉，CyberSafe染料，DNAmarker，限制性酶EcoRI，T4DNAligase连接酶，70%乙醇，超纯水，溶液I（50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris•HCl（pH8.0）、10mmol/LEDTA（pH8.0）），溶液II(等体积的0.4mol/LNaOH和2%SDS），溶液III（5mol/L乙酸钾60mL、冰乙酸11.5mL、水28.5mL），氯仿，苯酚，70%乙醇，胰RNA酶，青霉素（Amp），IPTG溶液，X-gal溶液，1×TBE溶液等。仪器：超净工作台，PCR热循环仪，恒温水浴锅，台式离心机，漩涡混合器，移液枪（10µL、100µL、1000µL），微量分光光度计，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像仪和恒温水浴锅。
2.3实验步骤及内容设计
2.3.1煮沸法提取革兰氏阴性细菌的基因组DNA
用移液枪取1mL大肠杆菌培养物于1.5mLEP管中，14000rpm离心5min，收集菌体。加入500µLTE缓冲液，涡旋混匀。14000rpm离心1min，弃上清液。加入200µLTE缓冲液，涡旋混匀后置于100℃水浴箱中煮沸15min。取出后立即放置于冰上冷却5-10min。14000rpm离心1min，取上清液150µL于新EP管中，此即为该细菌的基因组DNA。
2.3.2碱裂解法分离质粒DNA小量制备法
[6]在微型离心管中加入1.2mLLB培养液，14000rpm离心30s。移去上清，将沉淀用100µL含有4mg/mL溶菌酶的溶液I重新悬浮。在旋涡混合器上将细胞振荡混匀，在室温下放置数秒。室温下加入200µL溶液Ⅱ，轻微振荡试管使用其混合。加入150µL冰冷的溶液Ⅲ，上下颠倒混合。室温孵育2min后出现白色絮状物，14000rpm离心2min，将上清液移至新的EP管中，加入等体积的苯酚∶氯仿（1∶1）混合物，旋涡混合1min，14000rpm离心2min，将上层水相移入新的离心管中。加入等体积氯仿溶液，旋涡混合振荡30s。14000rpm离心2min，将上层水相移入新的离心管中。加入2倍体积的冰冷的无心乙醇，混合后于-20°C沉淀5min。14000rpm离心4min，弃去上清，用冰冷的70%的乙醇淋洗沉淀，并放置在超净工作台中通风20min以使沉淀干燥。将沉淀重新悬浮在50µL50µg/mLRNA酶的TE缓冲液中，37°C恒温箱保温5min。
2.3.3使用微量分光光度计测定DNA浓度
打开NanoVue微量分光光度计电源开关。抬起金属臂，用擦镜纸蘸蒸馏水轻轻擦净光导纤维终端小孔表面，合上金属臂。先测量空白对照，校准系统。然后重复上面的操作，测量实际待测样品。记录浓度及A260/A280数值。
2.3.4聚合酶链反应（PCR）
将所有试剂冰上融化，将PCR管至于冰盒上。按照表1的体系，在PCR管依次加入试剂。按照表2设定PCR热循环仪。
2.3.5限制性内切酶与DNA的消化
从-20°C冰箱中取出细菌质粒样品溶液。在PCR管中加入下列试剂：7µL超纯水，2µLEcoRI10×缓冲液，1µLEcoRI，10µL质粒DNA溶液。在微量离心机上离心2-3s，然后放入PCR热循环仪，设定37°C运行2小时。反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳检测产物酶解情况，观察并记录条带数量和位置。
2.3.6琼脂糖凝胶电泳
取1g琼脂糖，加入100mL1×TBE，用微波炉加热至溶解，将琼脂糖溶液冷却至50°C左右时，用移液枪加入2µLCyberSafe染料，轻摇以混匀溶液，将琼脂糖溶液缓缓倒入插有齿梳的电泳槽模子。待琼脂糖凝固后，取出齿梳，并放入含有TBE缓冲液的电泳槽。样孔加入混合的1µL上样缓冲液和5µLDNA样品。设置100V、30min后，将胶从电泳槽中取出，置于凝胶成像仪的玻璃板上，紫外灯下观察，并拍照记录。
2.3.7DNA连接与TA克隆
在PCR管中加入20µL连接反应体系：lµL25µL/mL扩增的靶DNA，20ng具有T尾巴的质粒，lµL10X连接缓冲液，lµLT4DNA连接酶，补足超纯水至20µL反应体系。打开PCR热循环仪，设定程序，将连接混合物于恒定16°C反应12小时。
2.3.8感受态细胞的转化及利用α互补筛选细菌克隆
首先制备LB筛选平板，称取LB肉汤粉末，加入1.5%的琼脂，溶于100mL去离子水，置于高压灭菌锅121°C，15min。待冷却至50°C左右，在超净台中导入平板中。待凉至室温且凝固后，吸取40µL2%的X-gal溶液，使用无菌涂布器将溶液涂至整个平板表面，待平板表面无残留液体，吸取7µL20%的IPTG溶液涂至整个平板表面。从-80°C冰箱取出感受态细胞，小心置于冰上。用移液枪头小心加入10µL重组质粒DNA溶液加入到200µL感受态细胞溶液。迅速放置于42℃的恒温水浴中热击90s，然后冰上冷却1-2min，向试管中加入800µL室温下的LB培养基，37°C水浴培养45min。取200µL细胞混合液涂至含AMP的LB琼脂培养基上，37°C培养12-16小时。观察菌落颜色。
2.4实验结果记录及分析讨论
实验实施过程中，学生应如实记录实验结果。本部分实验结果如图1和图2所示，PCR扩增应出现目标清晰条带（图1）。感受态细胞的转化及利用α互补筛选细菌克隆实验平板出现白色和蓝色菌落（图2）。实验结束后，学生应完成实验报告的撰写。实验报告内容应包括实验名称、目的、材料及设备、方法及步骤、实验结果及总结和讨论部分。讨论部分主要是对实验结果的准确性进行判断，结合实验基本原理对造成实验失败的可能原因进行分析和总结。
3实验教学的实施
本门实践课程由于涉及大量的实验原理，需要在教学前给与学生充分的时间（可为至少1个月）进行查阅文献资料，理清实验基本原理、实验思路、目的及方法，并能够联系到食品生物技术的理论学习部分，进行举一反三，对于存疑的部分应和同学及教师进行探讨，保证实验前对实验内容有较清晰的认识。在实验实施过程中，实验教师应提前制备所需的试剂和准备好必要材料（培养皿、移液枪、无菌枪头等）。由于本实验涉及到微生物和要运用一些重要仪器，因此实验前还应对学生进行本实验相关内容培训，以确保实验正常、安全、有序的实施，包括实验室安全，微生物的无菌操作，移液枪的使用方法，仪器设备（灭菌锅、水浴锅、PCR仪和凝胶成像系统等）的操作规范等。在实验实施过程中，学生应按照实验步骤进行各项实验，且如实记录各部分实验结果。如遇到实施问题，应及时与实验老师进行沟通。教师应注意学生的实验操作手法，避免或减少实验操作不当，以提高实验结果的可靠性[7]。
4考核评价标准
本门课程的实践课程的设计旨在提高学生对理论课基本原理的认知，因此实验课程部分可占食品生物技术这门课总成绩的30%。实验课总成绩可设置为100分，实验报告占50%，实验操作占40%，团队互助占10%[7]。实验报告撰写内容是否清晰和完整，体现了学生对食品生物技术课程基本原理的认知程度及主动学习能力，因此是主要的考核标准。其次，微生物相关的基本实验操作技能是本门课程需要掌握的关键实验技能，也是实验实施的关键部分，此部分的考察是在实验实施过程中教师实时给与的。最后，在实验实施过程中，难免会遇到各种各样问题，学生应依靠团队互助掌握解决问题的办法，在此过程中，学生发现问题并解决问题的能力得到充分锻炼，此部分作为学生的激励分值。
5结束语
本文针对食品生物技术的核心知识点基因工程，设计系列实验内容，贯穿了基因工程基本原理和技术所需步骤。该实验所需实验条件容易满足，项目内容完整，紧密联系了课程所教授的理论知识，能激发学生的学习兴趣，为学生后续的生物技术的理解和掌握奠定了基础，并锻炼了本科生查阅文献和运用已掌握的食品生物学基础知识及实操技能来进行深入探索和解决食品食品领域实际问题。教学后发现，这一讲授设计方案可有效提高学生学习兴趣，促进学生查阅大量资料并参与教师的课题研究，为未来从事食品领域提供了良好的基础。
作者：李丽丽 陈洵 石磊 单位：暨南大学食品安全与营养研究院
