医学检验常用染色方法范例6篇

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医学检验常用染色方法

医学检验常用染色方法范文1

[关键词] 甲氧西林金黄色葡萄球菌;耐药性;研究进展

[中图分类号] R372 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)01(b)-008-03

Research progress of detection and drug resistence of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus

FENG Ming

Clinical Laboratory, the People's Hospital of Hezhou City, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Hezhou 542800, China

[Abstract] The author introduces the research progress of detection and drug resistence of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). The correlative literatures of MRSA in recent years are collected, analyzed, summarized and reviewed. The drug resistance mechanism, feature, test methods, protective and therapeutic measures of MRSA are summarized. MRSA is the most common pathogen in nosocomial infection. Because its rapid propagation speed, wide prevalence range, infection rate takes on ascend trend and it usually causes the infection prevalence and outbreak, therefore the prevention and drug resistance mechanism of MRSA have always been pay attention as a question of clinical common concern.

[Keywords] Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; Drug resistance; Research progress

自抗菌药物闻世之后,使得许多感染性疾病得到了救治,其实效已经得到了临床的证实。但随着抗菌药物的广泛使用,细菌的生态亦发生了变化,致使耐药菌群越来越多。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus,MRSA)是目前医院感染最常见的致病菌之一。由于其传播速度快,流行范围广泛,多部位感染,并且表现出多重耐药性,已与乙型肝炎(HBV)、艾滋病(AIDS)并列世界范围内的三大难解决的感染性疾病[1]。因此,遏止MRSA的产生及其耐药机制一直是国内外医学工作者研究的热点。本文就近年国内外对MRSA的检测方法及其耐药机制的研究进展进行综述如下:

1 耐甲氧西林的金色葡萄球菌产生的原因与后果

MRSA致病性强,在全球范围内感染率不断增加,是引起院内感染的重要致病菌[2]。Jevons于1961年在英国首次报道了MRSA,但到了20世纪80年代后期MRSA在已成为全球性的病原微生物,并居医院感染病原菌的首位。据闰中期等[3]报道,MRSA在综合性三级甲等医院的检出率都在80%左右。魏军等[4]认为,在金黄色葡萄球菌中,MRSA占64.1%。稍高于肖永红于2006~2007 年Mohnarin细菌耐药监测研究组全国84所医院MRSA检测结果(56.1%)。有资料显示,MRSA的感染季节集中在春、秋、冬三季,这与此时期呼吸系统较易受到感染有关[5]。

孙玉明等[6]研究显示,成人院内金黄色葡萄球菌感染中,MRSA所占比较高,达81.8%~92.0%,神经外科ICU可达100.0%。有研究证据表明,MRSA感染致病后可引起难以控制的致命的败血症[7]。MRSA所造成的院内感染一直是临床普遍关注的问题[8],MRSA的出现,为临床治疗带来了极大的挑战[9]。

2 耐甲氧西林的金色葡萄球菌的易感人群

由于人体是金黄色葡萄球菌的天然宿主,有30%~50%的健康成人体表有金黄色葡萄球菌定植,其中10%~20%是永久定植,定植率高的人群主要包括1型糖尿病、静脉吸毒、血液病、获得性免疫功能缺陷或者是外科手术术后患者。研究显示,ICU新入患者的MRSA定植率为11.9%[10]。

MRSA在住院患者和医务人员中的携带率非常高,是院内交叉感染的重要传染源,而手是传播MRSA的关键性媒介[11]。而国外流行病学调查表明,来自急诊室和社区的患者也可能携带有MRSA。同时MRSA可能通过患者、家属、医护人员的相互密切接触进行传播,对于患者是一个极大的威胁。由于MRSA体外生存能力较强,对β内酰胺类抗生素及其他多种抗生素高度、多重耐药,存活长,传染性较强,临床治疗颇为棘手。

3 耐甲氧西林的金色葡萄球菌的耐药机制

MRSA耐药问题已成为临床上的主要问题。MRSA的耐药机制虽未完全阐明,但已证实与细菌产生的一种新的青霉素结合蛋白2a(PBP2a)密切相关。金黄色葡萄球菌对β内酰胺类药物的耐药机制主要包括产β内酰胺酶和PBP2a的突变[12]。美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)文件指出,一旦金黄色葡萄球菌检出mecA基因或PBP2a蛋白即可定为MRSA[13]。

参照NCCLS标准,从临床标本分离的金黄色葡萄球菌转种至LB培养基,培养24 h,配成1×1010 cfu/L的细菌悬液,沾取1.2 μL接种至MH琼脂板上(MH平板含40 g/L NaCl,对倍稀释的苯唑西林)直径5~8 mm的圆形区,32℃孵育48 h后观察结果,MIC≥4 mg/L即为MRSA。从药敏结果分析,MRSA通过不同的机制对氨基苷类、大环内酯类、氯霉素和四环素等耐药,但是通常对万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺及一些氟喹诺酮类敏感[14]。汪铃等[15]研究认为,MRSA呈多重耐药特点,MRSA对利奈唑胺、替考拉宁、万古霉素敏感率为100%。万古霉素属快速杀菌剂,对MRSA具有较佳的抗菌效果。吴超[16]认为MRSA表现出多重耐药,耐药谱越来越广。2002年自美国报道了第1株耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)以来,先后出现了3株VRSA[17]。

近年来MRSA感染率逐年增加,人们逐渐发现MRSA 几乎对所有β内酰胺类抗生素耐药,甚至累及红霉素、环丙沙星和庆大霉素[18],成为临床治疗的难点。

4 耐甲氧西林的金色葡萄球菌的检测方法

由MRSA引起的感染已经成为临床抗感染治疗的难题之一。如何快速、准确地检测出MRSA及预测其耐药性变化对细菌耐药的检测及耐药机制的研究是全球医药界倾力关注的焦点问题,为此临床实验室准确、快速地对该类菌株进行筛选和确认,是控制MRSA感染的关键。依据药敏试验结果,不仅可指导选择合适的抗生素,还有利于控制MRSA的传播。因此检验科室应提高细菌培养和监测技术水平,特别是应缩短报告时间,为MRSA感染提供准确的诊断依据。

目前临床常用的方法有纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂筛选法、分子生物学诊断方法等,国内许多大中型医院都在使用Vitek-32型全自动细菌分析系统(Vitek-32 AMS)进行对MRSA的检测(仪器法)和药敏实验[19]。其中包括有头孢西丁纸片扩散法(FOX法)和苯唑西林盐琼脂纸片扩散法(OXA法)。李蓓等[20]对纸片扩散法(CLSI推荐)、乳胶凝集法和PCR方法进行比较,由于其仅对52例样本进行了检测,显示3种方法检测的差异无统计学意义。随着PCR技术尤其是荧光标记技术的发展,目前临床上多采用荧光PCR方法检测MRSA也更为精确的。

5 耐甲氧西林的金色葡萄球菌的预防和治疗

由于MRSA的多重高度耐药,临床上抗生素的应用谱已较为狭窄,所以应合理使用抗生素,延缓或减少耐药菌株的产生,控制耐药菌株的扩散和流行,有利于疾病的治疗,应做到以下几点:①避免滥用抗生素,积极控制院内感染。对感染者的治疗要综合考虑临床表现、病原学、用药史,并结合临床诊断,根据细菌对药物的敏感试验选择抗菌药物。②定期对病房进行消毒,对MRSA感染或携带者进行隔离或床边隔离。③筛查新入患者,对新入院患者进行MRSA筛查有利于减低医院内MRSA感染的发生率[21]。新入患者的MRSA筛查作为一个独立的有利因素已经被许多感染管理机构认同,并推广到各个医院成为感染管理控制的法规条例[22]。④医务人员的规范化洗手。MRSA的主要传播方式是定植或感染患者所带细菌经医护人员的手传播至其他患者,为接触性传播[23]。所以规范化洗手也是相当重要的。尹利华等[24]研究证实,手部清洁是预防医院获得性感染最简单,同时也是最有效的措施。

6 小结与展望

MRSA是目前医院感染的重要病原体之一,越来越引起医学界的重视。虽然受菌株来源、药敏试验的方法、测试条件、抗菌药物选用等不同条件的影响,使MRSA在各医院的检出有一些差异,由于MRSA对多种抗菌药物耐药,造成临床治疗困难,已引起临床普遍关注与重视[25]。

虽然目前万古霉素仍是治疗金黄色葡萄球菌感染最有效的药物,但随着该药物在临床上的用量增加,临床上已出现了对万古霉素产生耐药的MRSA[26]。为此国内外医学工作者不断探讨新的治疗方法和筛选敏感的抗生素。

用利奈唑胺治疗MRSA感染疗效显著,其抗菌机制是利奈唑胺与细菌50S核糖体亚单位结合,终止蛋白质合成的最早阶段。我国有着非常丰富的中草药资源,已经证实多种中草药及其成分有抑菌或抗菌作用。部分中草药通过提高机体的免疫功能、降低抗生素的毒副作用、增强抗菌药物的作用,间接体现抗菌或抑菌作用,近年来,中药抗MRSA耐药性的研究也倍受关注。

综上所述,由于MRSA的危害表现是对多种抗菌药物的严重耐药性,所以长期大量使用抗生素会使MRSA甚至MSSA的耐药谱更加扩大,耐药率会进一步上升,因此,必须加强对抗菌药物的合理应用和管理,特别是临床医生应根据药敏试验结果选择抗生素,这才是防止 MRSA流行的最有效措施。

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医学检验常用染色方法范文2

随着医疗技术的发展,各种侵入性操作治疗手段的使用,肿瘤化疗,激素和免疫抑制剂的广泛应用,医院感染问题日益突出。抗生素的广泛应用,在有效治疗感染的同时,也诱发或导致治疗更加困难的多重耐药和医院的二重感染。医院感染日益成为一个严峻的问题摆在广大医务工作者面前,应引起足够的重视。在美国医院感染的发生率在5%~10%,每年造成的额外的医疗消费约为175~350亿美元[1]。除了经济上的损失以外,更严重的是给患者带来巨大的危害。医院感染的发生有3个重要的环节,即传染源的存在、传播途径和易感人群,每个环节都和微生物学检查有着极为密切的关系。医院感染的发生主要有两种类型,即外源性感染(系指由患者本身以外的微生物引起的感染)、内源性感染(系指由患者本身携带的微生物引起的感染)。要对不同类型的感染作出正确的诊断,必须进行微生物学检查。因此临床微生物学检验在医院感染的诊断、监测,医院感染的流行病学调查、消毒灭菌效果评价以及抗菌药物的合理使用等方面,具有极其重要的作用,下面就几个主要问题作一概述。

对各种临床标本作出正确的病原学诊断

医院感染涉及到临床各科室,由于介入性诊断治疗技术的广泛应用,放疗和化疗手段的开展,抗菌药物、激素的使用,特别是抗菌药物的不合理使用以及消毒灭菌技术使用过程中存在的问题等,使得医院感染不断出现,要及时地采取预防、治疗、隔离等措施,就必须有及时准确的病原学诊断。目前细菌培养鉴定技术不断丰富,仪器设备日趋先进和完善,给病原学鉴定提供了有力的证据,但另方面基本操作技术以及在实践中积累的经验在病原学鉴定中亦有着不可忽视的作用。

此外,在医院感染流行暴发时对病原菌除做到种的鉴定外,必须做到型的鉴定,即分型技术。目前细菌分型方法很多,如血清学分型、生物化学分型、细菌菌素分型、噬菌体分型、抗菌药物及重金属分型、质粒图分析、PCR技术、染色体酶切物脉冲场凝胶电泳(PFGE)等,目前则以细菌染色体限制性内切酶酶切后PFGE最为可靠[2]。

细菌的耐药性监测

人类通过不断研制、生产新的抗菌药物来对付微生物日益复杂的耐药性。近些年来由于抗菌药物的广泛的甚至不合理使用使得细菌的耐药性日益严重和复杂。耐青霉素肺炎链球菌(PRP)近年来日渐增多,在某些国家甚至高达70%以上。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA或ORSA)发展极为迅速,在美国1975年MRSA仅为2.4%,而到了1991年即增长到29%,在我国MRSA更为严重,约在50%[2]。耐万古霉素肠球菌(VRE)亦成为我们面临的一大威胁,在美国一般病房及ICU,1989年VRE不足1%,到了1993年普通病房增加到2%以上,在ICU则增加到13%[4]。近年来,人们一直在担忧但又不得不接受耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)的出现这一严酷的现实,首例耐万古霉素金黄色葡萄球菌1996年5月出现在日本(菌株名为Mu5O),之后在美国新泽西州及密西根相继出现。1998年在我国香港出现VRSA,患者为一患癌症中年妇女,由于MRSA引起菌血症,经万古霉素治疗两周,无效、死亡。VRSA其耐药机制不同于VRE,分析可能与金黄色葡萄球菌细胞壁有关,目前正在研究中。耐多种药物的结核分枝杆菌(MDR-TB)已引起医学界广泛关注。近期又出现由偶发分枝杆菌引起的感染,是由于注射器未能彻底灭菌而造成注射部位感染60例。非典型分枝杆菌多数表现为生长速度快(一般3~5天)营养要求不高,因此,一定要根据药敏试验结果选用抗菌药物进行治疗。真菌感染日益增多,真菌菌血症患者的死亡率在30%以上。产生超广谱β内酰胺酶的菌株不断增加。 因此对细菌耐药性的监测已成为一项重要任务摆在临床微生物工作者的面前,而且要不断地坚持做下去。

抗菌药物的合理使用在预防医院感染中具有重要意义:目前在我国严重地存在着抗菌药物使不合理甚至滥用的现象,据调查在我国住院病人中约有80%患者给予抗菌药物,而根据细菌对抗菌药物敏感试验结果给予抗菌药物治疗的病人仅占14%(4%~34%),换言之约有86%的患者是根据医生经验给予抗菌药物治疗的。因此要改进实验室工作条件,加强与临床的联系,及时采取标本进行微生物学鉴定及药物敏感试验,以减少临床抗菌药物的不合理使用。

3.定期向临床科室报告病原学鉴定结果及细菌对抗菌药物敏感试验结果,因而临床医师对该院引起感染的常见菌及对抗菌药物的敏感性较为全面的了解,这些数据则成为临床医师在得到病原学确切诊断及药物敏感试验结果之前参考用药的依据。众所周知,在病原学诊断方面尽管采取了很多措施来缩短出报告时间,距临床要求仍有时间差。因此,定期提供当地医院病原学检查结果往往可以作为临床医师初步用药的依据,之后再根据该病例分离细菌药物敏感试验结果进行核实或更改治疗方案。卫生部有关文件中关于医院感染管理委员会的职责中明确提出,每半年要报告1次引起感染性疾病的病原菌,以及对抗菌药物的敏感试验结果。

4.对医院以及重点科室的环境和医护人员的手进行病原学监测

引起医院感染的病原菌可存在于病人、医护人员,亦可存在于医院环境中,因此进行微生物学监测非常必要,如对医院感染发病率较高的科室或病房进行物体表面和空气的微生物学调查,对一些特殊部门如手术室、产房、婴儿室、ICU等进行环境微生物学监测,并要求达到卫生部颁发的标准。此外医护人员手的消毒在预防医院感染中具有重要作用,因此要定期或不定期地对医护人员的手进行细菌学监测并要求达到卫生部颁发的标准。当出现医院感染流行时,除对各种临床标本进行微生物学检查外,亦应对传播途径、医院环境以及隔离措施效果等方面进行微生物学检查和监测。

5.对消毒灭菌效果进行生物指标监测

医院中使用的消毒灭菌方法很多,如物理灭菌法、化学消毒法。对于消毒灭菌效果的监测,使用的方法也很多,如化学指示剂、压力表监测法、留点温度计法等,但最为可靠的方法为生物指标,即用某些特异的菌种作为指示菌,视其是否被杀死作为消毒灭菌的指标,如用嗜热脂肪芽胞杆菌作为压力蒸汽灭菌的生物指示剂,应用枯草芽胞杆菌黑色变种作为紫外线杀菌的指示菌,应用金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌黑色变种作为化学消毒剂杀菌的指示菌。

总之,通过临床微生物学检验,明确医院感染的病原体及体外药敏试验,指导临床正确合理的选择敏感高效低毒的药物,才能较好的治疗医院感染,降低病死率。也只有通过临床微生物学检验,才能揭示医院感染的发病规律,控制耐药菌株的产生,降低医院感染的发病率,为探索和应用新的防范措施提供有利依据。

参考文献

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[2]贺学英.耐甲氧西林葡萄球菌耐药性观察.中华医学检验杂志,1997,20:268-271.

医学检验常用染色方法范文3

【关键词】

窒息;感染;血小板;姬-瑞染色;SYSMEX五分类

新生儿窒息和新生儿感染是经常威胁新生儿生命健康的疾病,近来研究表明,新生儿窒息和感染时血小板计数,血小板平均体积和血小板分布宽度有着明显的相关性改变。

外周血涂片染色分析和血小板计数在各级实验室都是常见并开展的项目,实验简单实用,而血小板各参数在正常组和新生儿窒息或感染组对比有着明显改变,现我院最近在这方面开展了一些比较和分析,就一些所得描述如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

2008年7月至2010年7月 本院住院部新生儿室5152例新生儿静脉血2 ml,所用抗凝管为EDTA-K3专用血常规管,其中窒息组新生儿52例,感染组73例,抽取静脉血后立即颠倒混匀,同时涂抹血片。

1.2 试剂和仪器

贝索生物制品有限公司生产的姬-瑞染色液,EDTA-K3 血常规专用抗凝管。奥林巴斯双目光电显微镜,SYSMEX 全自动血液细胞计数仪。

1.3 实验方法

严格按照全国临床检验操作规程进行血涂片染色,自然干燥后油镜观察全片血小板形态特点,同时按 SYSMEX 规定操作程序进行外周血液细胞计数和分类计数。

1.4 统计学方法

实验所得数据全用x±s表示,组间比较用t检验。

2 结果

窒息组新生儿与正常组比较外周血 血小板计数、 血小板平均体积、血小板体积分布宽度均有显著性差异(P均

3 讨论

由上表比较显示,新生儿窒息后PC与正常组对比有着明显下降,而MPV和PDW升高。感染组新生儿PC、MPV、PDW与正常组对比明显上升,可能是机体处于应激状态,激活巨核细胞,产生更多的血小板,并产生大体积的血小板,从而引起血小板各参数改变。因此,临床上检测血小板各参数对新生儿窒息和感染的诊断有明显的参考价值,而血小板参

作者单位:523690东莞,南方医科大学广济医院检验科

数检测和外周血细胞染色操作简单,不需要特别昂贵的仪器设备,有利于各级医院推广。

参 考 文 献

[1] 焦路阳, 唐成和.窒息新生儿外周血白细胞与血小板动态变化分析.陕西医学杂志,2005,34(1).

医学检验常用染色方法范文4

【关键词】 血涂片镜验; 血常规

中图分类号 R446.11 文献标识码 B 文章编号 1674-6805(2013)36-0062-01

近年来,随着各医疗机构全自动血细胞分析仪的普及,极大地提高了检验工作效率,缩短了检验报告的时长。但过度依靠自动化分析仪,忽视手工血涂片镜检,势必造成部分病例漏诊、漏报等情况,影响了医务人员的诊断和治疗。血涂片镜检是将血液通过推片、染色后于光学显微镜下实施白细胞分类,以及血小板形态、红细胞和寄生虫检测等,均为血液形态学检查的常规方式,可减少漏报率,提高准确率[1]。本文对笔者所在医院近年收治的300例需血常规镜检的患者进行观察,分析血涂片镜检在血常规检验中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年4月-2013年4月收治的300例需血常规镜检的患者,全部患者实施血涂片和血细胞分析仪检验。其中男147例,女153例,年龄12~79岁,平均(45.6±4.5)岁。经过临床检查和判断,该300例患者均符合血常规检验的标准。

1.2 检查方法

1.2.1 涂片制作、染色和镜检 (1)制作涂片标准:根据患者的具体症状与BC-3000血细胞分析仪的功能,参照显微镜检查的血涂片标准进行研究。仪器具有3个计数异常显示:红细胞、白细胞和血小板;(2)涂片标准:选择厚薄相当,头体尾清晰,细胞分布匀称,血膜长度占玻片的2/3左右;(3)血涂片染色:用瑞氏-吉姆萨复合染液实施染色,染液根据《全国临床检验操作规程》第3版的标准进行配置;(4)血涂片镜检:由低倍或者高倍镜,检查涂片的染色、涂片是否正确,白细胞数是否和仪器结果符合,检查外周血细胞的分布情况和各中血细胞的所占比例,尤为注重涂片尾部是否存在巨大或者异常细胞,选择体尾交界处有核细胞和红细胞不相叠部分作为有典型性的油镜区,油镜检查包括比例、细胞形态、分类计数等。

1.2.2 采血、分析和观察 (1)针对EDTA-K2抗凝使用真空采血技术于肘静脉采集血氧2 ml,放于室温处理,采血后2 h内谨慎按照仪器操作流程完成检查;(2)将BC-3000血细胞分析仪对需要检查的300份血常规样本进行分析,同时进行涂片染色镜检。血涂片使用瑞氏-吉姆萨复合染液实施染色,根据科学的操作流程,在普通双目光学显微镜下实施观察检查。血涂片分析包括白细胞分类计数与形态、血细胞数量评估、血小板大小与形态、红细胞大小与形态,观察是否有异常病例,如寄生虫和中毒颗粒[2]。

2 结果

全部300例患者实施血涂片和血细胞分析仪检验,异常病例有29例,占9.7%,其中传染性单核细胞增多症2例,占0.7%;异型淋巴细胞增多症1例,占0.3%;缺铁性贫血12例,占4.0%;巨幼细胞性贫血9例,占3.0%;慢性粒细胞性白血病2例,占0.7%;急性白血病3例,占1.0%。剩余271份血涂片镜检结果与血细胞分析仪相符。

3 讨论

血细胞自动分析仪是以白细胞体积大小而进行区别的,并不能识别嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞,且不能区别异型淋巴细胞和中性粒细胞毒性变。倘若遇检查血常规异常时,需严谨地实施血涂片镜检,进行综合分析,血涂片不仅可复核计数的准确性,而且可使多种普遍性的白血病、贫血、感染性疾病得到准确的诊断[3-4]。

根据本研究得出,血涂片镜检属于诊断血细胞的主要组成部分,医院和检验科需重视血涂片镜检,检验人员应充分了解掌握血涂片镜检的操作流程,观察、分析血细胞的各项情况,为临床提供更为可靠的诊断依据,因此,虽然血涂片分析较为繁琐复杂,但是准确率较血细胞分析仪高,应结合工作实际适时进行推广。

参考文献

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医学检验常用染色方法范文5

【关键词】 微生物检测; 申请

临床实验室服务的质量直接影响着临床医师的医疗决策质量,临床实验室要提供高质量的服务,需要认真思考:哪些检验项目可提供最好的证据?该检验项目结果是否可靠?[1]大量的研究和文献报道了合理使用抗生素对于延缓细菌耐药性的产生和降低患者的住院费用的重要性。较少见文献报道不恰当的选择微生物检验项目对感染性疾病诊断的负面影响[2]。不合理的选择微生物检验项目不仅会增加患者的医疗费用,而且药物的副作用会对患者的身体产生不良影响[3]。下面通过几个例子讲述微生物检验项目选择易犯的错误,期望引起临床微生物检验同行的注意。

病例1

一45 岁男性酒精成瘾患者因戒酒入院。入院14天后该患者主诉腹泻。此患者除酒精中毒外,无其它器质性疾病,腹泻前未使用过抗生素。其主管医生为该患者选择了大便白细胞检查、大便培养、大便潜血和寄生虫检查及艰难梭菌毒素检测。检测结果中大便白细胞及艰难梭菌毒素阳性,但其它检测结果均为阴性。

点评

大便培养是微生物实验室中最昂贵的常规试验之一,而这一试验被广泛地不加选择地用于任何腹泻的病人,阳性率较低。入院三日以上患者检测出伤寒杆菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌及寄生虫的可能性不足0.5%。常规大便培养应局限在门诊病人或住院3天以内的病人。有关专家建议对常规大便培养采用“3日标准”。经调查确定成年住院病人检查肠道病原菌的大便培养标准为:⑴ 腹泻入院后72 h内培养。⑵入院后超过72 h发作腹泻符合下列条件之一:①年龄≥65岁,先前存在疾病引起持续的器官功能改变;②AIDS患者;③中性粒细胞减少(

社区获得性腹泻或旅行性腹泻

(入院≤3日)医院获得性腹泻

(入院>3日)持续性腹泻

(入院>7日)沙门氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、O157:H7艰难梭菌毒素A±B检测粪便白细胞检查若出现血便,产志贺毒素大肠埃希菌检测疑为医院获得性腹泻爆发或患者为婴儿,按社区获得性腹泻检测蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫、环孢子虫等孢子虫的检查近几周使用过抗生素,艰难梭菌毒素A±B检测AIDS患者还需检测微孢子虫和鸟分枝杆菌

病例2

一68岁糖尿病患者因恶心、呕吐、发热入院,此患者一直接受血透析治疗。入院后取静脉导管顶端肉汤定性培养2份,每份均检出MRSA。立即开始静脉内万古霉素治疗,并于3天后除去静脉导管。导管顶端和血培养均检出大肠埃希菌,导管顶端检出少量MRSA,随后改用庆大霉素治疗,一周后发烧消退出院。

点评

实践证明导管定性培养对预测CRBSI(catherrelated blood stream infection,导管相关性血流感染)无多大临床意义,不建议使用此项检测。而导管半定量培养或定量培养可提供较有临床意义的参考。该患者由于使用了导管定性培养,得出了错误的诊断及对万古霉素治疗效果不理想,还须承受万古霉素的毒性负作用。临床医生首先应判断导管是否仍有保留的必要性。按导管保留与否分别采用不同的送检与结果判断方法。1.保留情况:⑴通过导管和外周静脉取血,定量培养。如果导管和外周静脉血培养均为阳性且是同一种菌,而且导管血培养的菌落数是外周静脉血培养菌落数的5~10倍以上,可诊断为CRBSI;当无配对的外周血培养结果,仅有导管血培养结果,若导管内血培养的细菌数>100CFU/ml,真菌数>25CFU/ml也可确诊。⑵通过导管和外周静脉取血同步培养检测,若从导管采血的阳性报告时间早于从外周静脉取血≥120min,可诊断为CRBSI[5]。2. 不保留情况:⑴滚动导管头半定量培养:用镊子将无菌获取的导管头(3~4cm)在血平板上来回滚动4次,培养24~48h后观察菌菌落数,若每个平板菌落数大于15CFU,可能为CRBSI;若每个平板菌落数小于15CFU,不可能为CRBSI,多为皮肤表面污染菌。⑵超声处理导管头定量培养:将导管头用胰大豆液冲洗后超声波处理,用生理盐水适当稀释,定量接种于血平板,培养后计算细菌数,如在100CFU以上有诊断意义。

病例3

一85岁糖尿病患者老妇因右脚溃疡的治疗恶化入院,体检发现在大拇趾、食趾及脚后根有三处溃疡。溃疡处有黄色的脓液流出,经皮肤拭子采样培养,分别一处或多处检出:MRSA,粪肠球菌和革兰阳性杆菌。

点评

开放性的溃疡拭子采样培养可确定伤口细菌的定植情况,常不能准确反映伤口细菌的真实感染情况。大多数专家不支持采集伤口拭子分离病原菌。皮肤表面分离的细菌不能预测伤口深部的感染。只有正确采集伤口标本才能提供伤口感染的真实情况。⑴组织标本 组织标本主要指应用穿刺活检、手术活检及刮取所获得的组织。表浅的皮肤黏膜感染需穿刺抽取组织液或切取组织块进行病原学检测;深部组织感染需通过各种内镜检查或手术来获得相应的组织标本作病原学诊断。对伤口进行清创术并清除表面碎屑后采集的深部组织用于细菌定量与鉴定病原菌是最有用的方法,以无菌操作采集的组织先进行称重、捣均并作系列稀释,然后接种在选择培养基和非选择培养基上,分别置需氧和厌氧环境中培养。⑵ 伤口液体标本 当伤口有液体存在时,可采用针吸皮碎屑下的液体,特别是抽集皮下脓肿中的脓液。如果是腔内伤口如压伤,可采用灌注无菌生理盐水的方法采集腔内液体。采集表层伤口液体或组织碎屑最常用的是无菌棉拭子,可用于伤口细菌半定量与定性;海藻盐拭子由于能完全将其拭子溶解到稀释液内而释出细菌,故可用作全定量分析。传统革兰染色可通过伤口涂片中是否发现中性粒细胞作为辅助判断病原菌的依据。但对于多数伤口是需氧菌与厌氧菌的混合菌感染,虽然在标本中有细菌与白细胞同时存在,但其染色价值有局限性[6]。

病例4

一75岁多年尿道插管患者因尿液颜色变深和气味难闻而至急诊科就诊,该患者无发热、寒颤、恶心和呕吐等不适症状。尿分析测试结果显示:10~12个白细胞/LP,白细胞酯酶微量,细菌1+。临床医生给出尿路感染的诊断,并医嘱口服左氧氟沙星10天。

点评

目前尚无证据表明尿液颜色变深与尿路感染之间的关联,并且尿道插管脓尿也和尿路感染无直接关系。尿道插管患者尿液白细胞升高与结石、导管植入等有关。该患者的尿分析结果不能确诊为尿路感染,更不必使用抗生素。患有导尿管相关性菌尿症的患者,若无尿路感染不必使用抗生素。尿路感染的诊断标准为:尿常规镜检男性≥5个/HP,女性≥10个/HP;尿液培养细菌计数标准按革兰阳性球菌浓度≥ 104 CFU/ml,革兰阴性杆菌浓度≥ 105CFU/ml,真菌浓度≥105CFU/ml判断 。务必记住:膀胱插管两周以上会引起微生物在该处的定植,如无症状则无需治疗,因治疗本身就会导致出现耐药菌的危险。最有效的措施为撤除尿管。如果尿培养一直持续阳性,或患者在撤除导尿管后还常出现症状,或出现继发性菌血症,此时应使用药物治疗,并应保持有效的尿液及血浆对致病菌敏感的药物浓度。伴有脓尿的非典型的菌尿尿道插管患者不必治疗。研究表明尿道插管患者使用抗生素并不能清除插管处定植的细菌或真菌。使用抗菌药物不仅不能预防尿路感染,相反会增加感染的发生,对长期留置导尿管的患者来说效果不佳,同时增加了真菌及其他条件致病菌感染的机会,建议临床不要长时间应用抗生素预防留置导尿相关性感染[7]。

病例5

一87岁老妇因惊厥入院留观待诊,入院时体温39℃,临床医生推测可能系脑脊髓膜炎并作了腰椎穿刺检查。脑脊液清亮,显微镜检查仅发现少许红细胞,未见白细胞。脑脊液革兰染色未发现细菌,生化检查糖与蛋白含量均在正常范围。随后实施其它的检查项目如脑脊液新型隐球菌抗原检查、单纯疱疹病毒PCR检查,抗酸杆菌和真菌的涂片检查和脑脊液培养检查,但这些检查结果均为阴性。

点评

脑脊液检验是针对神经系统疾病诊断的系列技术,脑脊液成分与性质的改变常常可以反映中枢神经病变的性质或病因。如在镜下或培养中发现致病菌,便可准确无误地作出病原学诊断,若发现癌瘤细胞或异常血细胞,也可作出有关疾病性质的诊断。另外,中枢神经系统是体内特殊免疫器官,许多神经免疫疾病也只有从脑脊液检验中反映出来。在美国脑脊液四管检查法已成为标准化的操作规程:第1管行细胞计数和分类;第2管行革兰染色、抗酸染色和墨汁染色及细菌和真菌培养;第3管行糖、蛋白检测、性病研究实验室试验、新型隐球菌抗原检查和细胞学检查;第4管行病毒和血清学检查。但是一些基础检查项目如细胞计数和分类、糖、蛋白检测、革兰染色和细菌培养结果正常,则其它一些补充试验可不必开展(AIDS患者例外)。因此临床医生在提交脑脊液检查申请时,可先选择基础检查项目,如基础检查项目阳性,才选择进一步的补充检查。当然,送检时须在一送检脑脊液试管上贴标鉴并注明“请保存此标本3天”。

讨论

在选择检验项目时一般要兼顾有效性、时效性和经济性三个方面。有效性是指检验诊断价值,主要考虑该项检验对某种疾病诊断的敏感度和特异度。时效性是通过检验可尽快地作出诊断,往往单用某一项检验很难了解病理改变的全貌,作出正确的诊断,因此,往往采取“组合检验项目”的方式。所谓经济性是指在保证及早确诊及向临床医师提供有效信息的前提下,应考虑选用费用较少的检验项目,以减轻患者的经济负担[8]。上述几个典型病例说明了减少不必要检查和无意义检查项目的重要性。病例2清楚地说明了此类检查引起了不必要的抗生素使用及由此带来的药物负作用。当今抗生素耐药日趋严重,务必教育医学院的学生、医生和其他医务人员滥用抗生素和错误选择微生物检查项目的后果[9]。通过计算机为基础的医院信息管理系统可提醒医生选择合适的检查项目。加强检验科与临床的沟通也是指导临床医师选择合理、实用、经济的微生物检验项目的有效手段。

参考文献

1 李萍. 用循证医学指导临床组合检验项目的应用. 中华检验医学杂志,2006,29:99~101.

2 Wilson ML.Appropriate use of clinical microbiology tests.Clin Lab Med,2002,22:491~503.

3 Wilson ML. Clinicallyrelevant costeffective clinical microbiology:strategies for decreasing unnecessary testing. Am J Clin Pathol,1997,107:154~167.

4 Wood M. When stool cultures from adult inpatients are appropriate. Lancet, 2001 ,24 :901~902.

5 Raad I,Hend AH, Alakech B, et al.Differential time to positivity: a useful method for diagnosing cather-related bloodstream infections. Ann Intern Med,2004,140:18~25.

6 沈定树. 伤口标本细菌检验的影响因素. 中国实验诊断学,2005,9:313~315.

7 刘丁, 陈萍,成瑶,等.留置导尿管患者泌尿道感染前瞻性研究.中国感染与化疗杂志,2007,7:432~434.

医学检验常用染色方法范文6

1单细胞分离

单细胞分离的方法很多,包括显微操作技术(micromanipulation)、激光捕获显微切割技术(lasercapturemicrodissection,LCM)、微流控技术(microfluidicplatforms)等。目前在法医DNA检验中实际应用的技术平台有两种,显微操作技术和激光捕获显微切割技术。

1.1细胞染色由于在实际案件中获得的细胞,细胞形态并不是实验室理想的形态,为了更好的识别细胞,在普通显微镜下观察时需要对细胞进行染色。对于上皮细胞,我们研究组尝试了不同的染色方法,通过联用显微操作技术对龙胆紫浓度梯度及时间梯度染色进行研究发现,0.5μL龙胆紫染液(0.05g/mL)加入100μL细胞悬液,5min后胞核着色即已明显,能有效提高显微捕获单细胞分离检验技术的检测效能,另外,染色时间不影响DNA结果分析[7]。对于细胞染色,DiMartino等通过对比核固红与巴氏染色法,证实巴氏染色法不仅能清晰的观察细胞,而且不影响下游PCR扩增[8]。Sanders等通过大量的实验发现,苏木素/伊红染色法(H&E)染色后的细胞STR分型峰高下降幅度较小,不影响分型结果[9]。也可以用荧光原位杂交技术对细胞的性染色体进行标记。

1.2显微操作技术显微操作技术是在显微镜下通过微毛细管吸取单个细胞。典型的显微控制系统包含一个倒置显微镜加上一个操纵杆操作,电动精密控制平台。其优点是操作容易进行,通过显微镜直观地分离单个细胞,成本低,主要用于较小细胞群体中的目标细胞分离。该平台适合对案件中上皮细胞进行分离,3个口腔上皮细胞平行16次试验均可获得完整分型,甚至低至一个细胞也可得到完整分型,该方法已成功应用于一起案的检验。在该案件中,提取受害人皮肤上的唾液斑,通过在镜下分离有核的口腔上皮细胞(来自于犯罪嫌疑人)和无核角化的上皮细胞或细胞碎片(来自于受害者皮肤),成功获得嫌疑人的STR分型。在案件中常碰到的血烟头检材,由于血液量大,常规方法很难获得烟头上唾液来源个体的STR分型,即使用单细胞分离检验时,也常常获得混合STR分型。本课题组在显微操作标准流程的基础上进行改进,将吸取的细胞先在TNE缓冲液中清洗几次,以彻底去除血液细胞碎片和游离DNA,最终获得完整唾液来源个体的DNA分型。也有报道将显微操作分离的方法用于分离,但细胞体积非常小,直径只有约6μm,毛细管吸取操作相对困难,下面介绍的激光捕获显微切割技术平台更加适合细胞的分离操作。显微操作法存在以下几个方面的不足。第一,由于依赖手工操作,对实验员的经验与操作能力要求较高,自动化程度较低,而且玻璃吸针脆性大,操作时易碎。第二,耗时较长,操作繁琐。第三,对于涂片后的检材,必须在液体环境下进行操作,容易受蒸发的影响,检材蒸干后,再补水时容易造成检材的损失,甚至带来污染。第四,对于案件中陈旧样本,根据形态识别细胞容易出错。

1.3激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术是利用UV(320~400nm)激光切割并捕获涂于覆膜玻片上的细胞。仪器设备较昂贵,自动化程度较显微操作技术平台高,是目前法医学应用最有效的单细胞分离方法,可用于上皮细胞、细胞、白细胞等不同类型的细胞分离。目前,该平台应用较多的是案中差异裂解法无法消除女性成分干扰的精斑检材,通过在显微镜下寻找并捕获细胞以消除女性成分。由于细胞是单倍体,理论计算证明捕获15~20个未降解的细胞,有很高的可能性获得完整的STR分型,实验证明至少捕获30个细胞可获得完整的STR分型。也有学者应用悬液荧光原位杂交(suspensionfluorescenceinsituhybridization,S-FISH)对案样本进行标记,通过这种方法可以明显减少前处理操作步骤。对于多个贡献者的混合精斑,差异裂解法不能将每个贡献者完全分离。近年来,我们研究组在这方面有深入的研究。通过联合使用激光捕获显微切割方法和低体积扩增技术,可以实现以单个细胞DNA为模板,进行Y-STR扩增检测,并成功获得三人混合精斑中各个来源人的Y-STR分型。研究组进一步使用荧光原位杂交技术标记Y型,特异性挑选Y型,通过优化组合Y-STR基因座与10个常染色体STR基因座(auto-STR),构建全新的YA-STR复合系统。其中,Y-STR基因座用于区分不同个体,通过组合Y-STR相同的图谱,实现个体的常染色体STR分型检验。首次尝试将该技术应用于三人混合精斑的检验,准确地获得了三个个体的STR分型。近年来,我们研究组还利用该平台建立了男女混合血液样本的分离检验技术方法。该平台在寻找细胞这一步骤时耗时耗力。有研究组开发了自动化的图像识别软件,通过分析图像中的光强、颜色和形状,可实现快速识别细胞,但是对不同种类细胞准确快速的识别仍需要进一步的研究。

1.4微流控技术最近兴起的微流控技术平台因其高通量、自动化、可有效防止污染而备受关注。微流控装置封闭的操作空间可以有效地避免污染,微升至纳升的操作体积可以保证较高的样品浓度,同时减少试剂消耗,虽然目前还没有在法医学单细胞分离中实际应用,但未来有很大的发展潜力。

2单细胞裂解

分离得到单细胞后,需将细胞裂解获得基因组DNA。传统的法医DNA检测需要对基因组DNA进行纯化,而对于单细胞检验,为了避免DNA的损失,常略去纯化步骤,裂解后直接进行PCR扩增。因此,裂解步骤要保证不影响后续PCR扩增反应的顺利进行。目前主要使用蛋白酶裂解,常用蛋白酶K或Protease(德国QIAGEN公司),酶解后高温使胞内蛋白质及蛋白酶K变性失活,利于基因组DNA的释放和下游PCR反应。对于细胞可加入DTT,打断二硫键,使细胞充分裂解。

3PCR扩增

一个细胞中的总DNA量仅有数匹克,常规的PCR管扩增需要的细胞数目较多,我们的研究结果显示至少20个口腔上皮细胞或60个细胞检测到Identifiler®PCR试剂盒(美国ABI公司)中全部分型。最近几年发展起来的微量化反应,即芯片-低体积PCR扩增(on-chiplowvolume-polymerasechainreaction,LV-PCR)系统[23,24],在低至1.5μL的PCR体系中,DNA模板与引物和聚合酶结合的机会明显提高,使微量细胞甚至单个细胞进行DNA分型变为现实,不仅检测的灵敏度得到提高,而且检验范围也大大拓宽了。LV-PCR使用贝克曼公司的AG480FAmpliGridslide进行扩增,前期大量的研究都是使用该产品进行,而且实验证明该产品灵敏度、准确性可满足法医单细胞检验的要求。另外一种最新的方法也值得关注,是在微液滴里进行PCR扩增。首先将单个细胞和荧光标记引物结合的微珠随机扩散在1.5nL的油包裹的琼脂微流液滴中,在大量微液滴内进行平行的PCR扩增反应后,于PCR扩增管内进行二次扩增,常规毛细管电泳检测,通过对大量单个细胞进行平行9重STR检测,获得混合样本各成分的STR分型。

4数据分析

单细胞检验由于DNA模板量非常低,其缺带、多带等现象经常发生,stutter峰较常规扩增强,单细胞检验的数据分析和低拷贝DNA的分析方法类似,需平行扩增,综合多次结果获得最终的STR分型。一般来说至少需获得5次有效分型(获得13个基因座以上的结果)[28],重复3次及以上的位点才能确认为有效位点。

5单细胞测序

在二代测序技术和全基因组扩增技术(wholegenomeamplification,WGA)发展的基础上,2011年,Navin等人首次发明了单细胞测序(single-cellsequencing,SCS)技术,测定了人体单个细胞的基因组DNA。单细胞测序的文章呈逐年递增状态,从2011~2014年,由5篇文章上升至近30篇,涉及生物学多个领域,发表于生物学顶级期刊上。2013年《,科学》杂志将单细胞测序列为年度领域榜首《,自然方法》杂志将单细胞测序列为2013年年度最重要的方法学进展。

5.1全基因组扩增技术由于单个细胞DNA含量有限,需进行全基因组扩增才能满足二代测序的最低DNA量。目前,已有多种以单个基因组为模板的全基因扩增技术,简称寡核苷酸引物PCR技术(degenerateoligonucleotideprimedPCR,DOP-PCR)和多重置换扩增技术(multipledisplacementamplification,MDA)。其中DOP-PCR方法覆盖率低,但可获得准确的拷贝数。MDA方法是在恒温下利用具有强模板结合的phi29DNA聚合酶和六聚物进行链置换扩增反应。Phi29DNA聚合酶具有3’5’外切酶活性,并且具有特殊的多重置换和连续合成特性,产生的DN段较大,约为50~100kb,可以覆盖基因组的90%以上,和DOP-PCR方法一样也会产生不同区域扩增不平衡性,MDA方法产生的不平衡性不具有重复性。2012年,首次报道了基于多次退火环状循环的扩增技术(multipleannealingandlooping-basedamplificationcycles,MALBAC),该方法结合MDA扩增技术和PCR扩增技术的优势,利用特殊设计的引物,巧妙地使扩增子的结尾通过互补而成环,进而在一定程度上防止了基因组DNA的指数性扩增,明显降低了扩增偏倚性,并显著提高覆盖度,但是该方法使用Bst聚合酶,没有校错活性(proofreadingactivity)。现有的商业化试剂盒各项参数见表1。全基因组扩增技术虽然仍然会有基因缺失等问题,但是相信随着时间的推移和技术的进步,扩增的准确性会逐步提高。

5.2二代测序技术对单细胞全基因组扩增后进行二代测序。二代测序技术具有快速、高效、低成本的优点。近两年来的研究表明,二代测序结果的准确性很高,与传统的Sanger测序相当。二代测序技术在法医学中应用研究很多,目前已经有两种商业化的试剂盒,美国ThermoFisherScientific公司开发的基于SNP的theHID-IonAmpliSeqTMIdentityPanel和theHID-IonAmpliSeqTMAncestryPanel,主要通过SNP检测进行个体识别和祖先推断;美国Illumina公司开发的ForenSeqTMDNASignaturePrepKit,在一个PCR反应中可以同时扩增27个常染色体STR,8个X-STR,25个Y-STR,95个个体识别SNPs,56个祖先信息标记(ancestryinformativemarkers,AIMs)和24个显性特征SNPs,更适合法医学应用。这两个公司使用的测序技术的优缺点见表2。

6单细胞检验展望