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医学检验常用染色方法范文1
1 合理安排实验室的整体布局
医学检验技术专业实验实训室设在教学楼A 区五楼实验室，分别由6 间实验室构成，实验室编号为: 529、530、531、532、533、534。这几间实验室彼此相邻，以满足教学安排的合理性和紧凑性。
2 实验室的具体安排和设计
2. 1 529 实训室( 仪器室)
( 1) 承担课程。临床学检验、血液学检验、仪器分析学、仪器维修。
( 2) 实验室配备。实验室的四面墙均设有电源，分别摆放供实训课程常用的临床仪器: 三分类血细胞分析仪、血沉分析仪、血象分析仪、尿液分析仪、尿沉渣分析仪等。实验室中间摆放由附属医院提供的示教仪器，包括: 不同品牌的三分类血细胞分析仪、血沉分析仪、血象分析仪、尿液分析仪、尿沉渣分析仪，其中包括希森美康的各型号仪器，如: SYSMEX R - 500、SYSMEX SF - 3000 、SYSMEX UF - 50、SYSMEX KX - 21、SYSMEX F -B20 、SYSMEX AD - 270，这些仪器按照型号排列摆放，相当于此品牌仪器在临床上的一个发展史的展示。实验室配备冰箱1 台，供临床学检验和血液学检验专用，用于存放一些血液标本、血液实验试剂盒和仪器校准试剂等。
( 3) 主要实训项目。三分类血细胞分析仪的应用、尿液常规检验、尿沉渣检验、尿液分析仪结构、调试、使用、维护等。
( 4) 特点。此实验室是由原来的教师办公室改造而成的，所以已具备空调，可以为实验仪器提供适宜的运行温度，但是电源插座设置不是很充足，水池只有一个符合办公需求的小水池，有待改进。
2. 2 530 实训室( 采血室)
( 1) 承担课程。临床学检验、血液学检验
( 2) 实验室配备。五分类血细胞分析仪、荧光显微镜、全自动生化分析仪
( 3) 主要实训项目。五分类血细胞分析仪的应用、尿液常规检验、尿沉渣检验等
( 4) 特点。房间较小，相当于正规实验室面积的一半，且模拟临床实景操作，配备采血窗口，以采血窗口为界将实验室划分成两部分。学生可以在采血窗口模拟临床的采血过程，然后运用采血窗口后面区域的常规临检仪器，直接进行各项实验室检查。特别值得一提的是，此采血室与其他实验室配合使用，在校医院的监督下，可完成每年新生的体检工作。
2. 3 531 实训室( 显微镜室)
( 1) 承担课程。临床学检验、血液学检验、寄生虫学检验、免疫学检验、微生物学检验、仪器分析学。
( 2) 实验室配备。水浴箱、离心机、显微镜、恒温培养箱，实验室配备冰箱1 台，供微生物学检验专用，主要存放微生物菌种、血平板和微生物生化管和药敏纸片等。
( 3) 主要实训项目。球菌检验、培养基制备( ss胨水KIAMIU) 、肠杆菌科检验、非发酵菌检验、真菌检验、线虫、吸虫、绦虫、阿米巴、鞭毛虫、疟原虫、弓形虫镜下观察、复染色法、单染色法、革兰染色法、培养基制备、微生物生长性状观察及接种技术、理化因素对微生物生长的影响、菌种保藏、微生物生化试验( 糖、蛋白质、酶) 、常见致病菌鉴定( 编码技术) 、细菌、酵母菌的形态观察( 菌体、菌落、芽管、假菌丝) 、显微镜直接计数法( 酵母菌) 、平板菌落计数法( 土壤中细菌总数检测) 、食品卫生微生物检验( 大肠菌群计数) 。
( 4) 特点。标准的显微镜室，配备45 台显微镜，能够保证实验学生每人一台显微镜，为熟练掌握相关实验操作提供可靠保障。且实验室两端有水池，适合微生物和临检、血液等较复杂的染色操作。
2. 4 532 实训室
( 1) 承担课程。免疫学检验、仪器分析学、细胞生物学。
( 2) 实验室配备。722 分光光度计、水浴箱、离心机、水浴箱、移动式紫外线杀菌车等。所有玻璃仪器按照名称、规格、数量分别储存在12 个靠墙的柜子里面，抽屉、柜子分别加锁分类储存各检验专业课程的常用实验器材。配备冰箱1 台: 免疫学检验专用，用于储存免疫学试剂盒、标本、标准品、仪器校准试剂等。
( 3) 主要实训项目。免疫凝集实验、双向免疫扩散试验、单向免疫扩散试验、甲胎蛋白的定量检测、外周血单个核细胞的分离、胶体金法对血HBsAg和尿HCG 的检测、抗体提取纯化实验、甲型肝炎病毒IgM 抗体的检测、乙型肝炎病毒标志检测、分光光度计的使用、离心机结构、调试、使用、维护等。
( 4) 特点。标准的实验室，具有大量的储物功能，相当于医学检验专业的一个小型库房。且实验室一端有水池，具备标准实验台，实验仪器齐全，可以完成很多复杂实验的前处理阶段。
2. 5 533 实训室
( 1) 承担课程。临床学检验、血液学检验、寄生虫学检验、微生物学检验、仪器分析学。
( 2) 实验室配备。恒温培养箱、显微镜、水浴箱、离心机、移动式紫外线杀菌车等。配备冰箱1台，微生物学检验专用，主要存放微生物菌种、血平板和微生物生化管和药敏纸片等。
( 3) 主要实训项目。血细胞计数板使用、RBC计数、WBC 计数plt 计数、血涂片制备、WBC 分类计数、三分类血细胞分析仪的应用、尿液常规检验、尿沉渣检查、RH 血型鉴定、交叉配血、BM 正常形态阅片、贫血阅片、白血病阅片、球菌检验、培养基制备( ss? 胨水? KIA? MIU) 、肠杆菌科检验、非发酵菌检验、真菌检验、线虫、吸虫、绦虫、阿米巴、鞭毛虫、疟原虫、弓形虫镜下观察、不染色法、单染色法、革兰染色法、培养基制备、微生物生长性状观察及接种技术、理化因素对微生物生长的影响、菌种保藏、微生物生化试验( 糖、蛋白质、酶) 、常见致病菌鉴定( 编码技术) 、细菌、酵母菌的形态观察( 菌体、菌落、芽管、假菌丝) 、显微镜直接计数法( 酵母菌) 、平板菌落计数法( 土壤中细菌总数检测) 、食品卫生微生物检验( 大肠菌群计数) 、光学显微镜的使用。
(4)特点。标准的显微镜室，配备45 台显微镜，能够保证实验学生每人一台显微镜，为熟练掌握相关实验操作提供可靠保障。且实验室一端有水池，适合微生物和临检、血液等较复杂的染色操作。
2. 6 534 实训室( PCR 实验室)
( 1) 承担课程。分子生物学、细胞生物学。
( 2) 实验室配备。PCR 仪、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、漩涡混匀振荡器、低温冷藏冰箱、药敏细菌鉴定仪、超净台、摇床、DNA 测序仪、酶标仪和洗板机等。
( 3) 主要实训项目。乙肝病毒定量、丙肝病毒定量、耐多药基因表达、HIV 抗体。
( 4) 特点。PCR 实验室依据所使用的方法分为试剂制备、标本制备、扩增产量分析四个区域。各区域应完全独立分隔，无任何的空气直通。空气流向应由室外向室内，可通过在室内设置的通风、排风设备达到空气流由室外向室内流动的要求。
医学检验常用染色方法范文2
1单细胞分离
单细胞分离的方法很多，包括显微操作技术（micromanipulation）、激光捕获显微切割技术（lasercapturemicrodissection,LCM）、微流控技术（microfluidicplatforms）等。目前在法医DNA检验中实际应用的技术平台有两种，显微操作技术和激光捕获显微切割技术。
1.1细胞染色由于在实际案件中获得的细胞，细胞形态并不是实验室理想的形态，为了更好的识别细胞，在普通显微镜下观察时需要对细胞进行染色。对于上皮细胞，我们研究组尝试了不同的染色方法，通过联用显微操作技术对龙胆紫浓度梯度及时间梯度染色进行研究发现，0.5μL龙胆紫染液（0.05g/mL）加入100μL细胞悬液，5min后胞核着色即已明显，能有效提高显微捕获单细胞分离检验技术的检测效能，另外，染色时间不影响DNA结果分析[7]。对于细胞染色，DiMartino等通过对比核固红与巴氏染色法，证实巴氏染色法不仅能清晰的观察细胞，而且不影响下游PCR扩增[8]。Sanders等通过大量的实验发现，苏木素/伊红染色法（H&E）染色后的细胞STR分型峰高下降幅度较小，不影响分型结果[9]。也可以用荧光原位杂交技术对细胞的性染色体进行标记。
1.2显微操作技术显微操作技术是在显微镜下通过微毛细管吸取单个细胞。典型的显微控制系统包含一个倒置显微镜加上一个操纵杆操作，电动精密控制平台。其优点是操作容易进行，通过显微镜直观地分离单个细胞，成本低，主要用于较小细胞群体中的目标细胞分离。该平台适合对案件中上皮细胞进行分离，3个口腔上皮细胞平行16次试验均可获得完整分型，甚至低至一个细胞也可得到完整分型，该方法已成功应用于一起案的检验。在该案件中，提取受害人皮肤上的唾液斑，通过在镜下分离有核的口腔上皮细胞（来自于犯罪嫌疑人）和无核角化的上皮细胞或细胞碎片（来自于受害者皮肤），成功获得嫌疑人的STR分型。在案件中常碰到的血烟头检材，由于血液量大，常规方法很难获得烟头上唾液来源个体的STR分型，即使用单细胞分离检验时，也常常获得混合STR分型。本课题组在显微操作标准流程的基础上进行改进，将吸取的细胞先在TNE缓冲液中清洗几次，以彻底去除血液细胞碎片和游离DNA，最终获得完整唾液来源个体的DNA分型。也有报道将显微操作分离的方法用于分离，但细胞体积非常小，直径只有约6μm，毛细管吸取操作相对困难，下面介绍的激光捕获显微切割技术平台更加适合细胞的分离操作。显微操作法存在以下几个方面的不足。第一，由于依赖手工操作，对实验员的经验与操作能力要求较高，自动化程度较低，而且玻璃吸针脆性大，操作时易碎。第二，耗时较长，操作繁琐。第三，对于涂片后的检材，必须在液体环境下进行操作，容易受蒸发的影响，检材蒸干后，再补水时容易造成检材的损失，甚至带来污染。第四，对于案件中陈旧样本，根据形态识别细胞容易出错。
1.3激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术是利用UV（320~400nm）激光切割并捕获涂于覆膜玻片上的细胞。仪器设备较昂贵，自动化程度较显微操作技术平台高，是目前法医学应用最有效的单细胞分离方法，可用于上皮细胞、细胞、白细胞等不同类型的细胞分离。目前，该平台应用较多的是案中差异裂解法无法消除女性成分干扰的精斑检材，通过在显微镜下寻找并捕获细胞以消除女性成分。由于细胞是单倍体，理论计算证明捕获15~20个未降解的细胞，有很高的可能性获得完整的STR分型，实验证明至少捕获30个细胞可获得完整的STR分型。也有学者应用悬液荧光原位杂交（suspensionfluorescenceinsituhybridization，S-FISH）对案样本进行标记，通过这种方法可以明显减少前处理操作步骤。对于多个贡献者的混合精斑，差异裂解法不能将每个贡献者完全分离。近年来，我们研究组在这方面有深入的研究。通过联合使用激光捕获显微切割方法和低体积扩增技术，可以实现以单个细胞DNA为模板，进行Y-STR扩增检测，并成功获得三人混合精斑中各个来源人的Y-STR分型。研究组进一步使用荧光原位杂交技术标记Y型，特异性挑选Y型，通过优化组合Y-STR基因座与10个常染色体STR基因座（auto-STR），构建全新的YA-STR复合系统。其中，Y-STR基因座用于区分不同个体，通过组合Y-STR相同的图谱，实现个体的常染色体STR分型检验。首次尝试将该技术应用于三人混合精斑的检验，准确地获得了三个个体的STR分型。近年来，我们研究组还利用该平台建立了男女混合血液样本的分离检验技术方法。该平台在寻找细胞这一步骤时耗时耗力。有研究组开发了自动化的图像识别软件，通过分析图像中的光强、颜色和形状，可实现快速识别细胞，但是对不同种类细胞准确快速的识别仍需要进一步的研究。
1.4微流控技术最近兴起的微流控技术平台因其高通量、自动化、可有效防止污染而备受关注。微流控装置封闭的操作空间可以有效地避免污染，微升至纳升的操作体积可以保证较高的样品浓度，同时减少试剂消耗，虽然目前还没有在法医学单细胞分离中实际应用，但未来有很大的发展潜力。
2单细胞裂解
分离得到单细胞后，需将细胞裂解获得基因组DNA。传统的法医DNA检测需要对基因组DNA进行纯化，而对于单细胞检验，为了避免DNA的损失，常略去纯化步骤，裂解后直接进行PCR扩增。因此，裂解步骤要保证不影响后续PCR扩增反应的顺利进行。目前主要使用蛋白酶裂解，常用蛋白酶K或Protease（德国QIAGEN公司），酶解后高温使胞内蛋白质及蛋白酶K变性失活，利于基因组DNA的释放和下游PCR反应。对于细胞可加入DTT，打断二硫键，使细胞充分裂解。
3PCR扩增
一个细胞中的总DNA量仅有数匹克，常规的PCR管扩增需要的细胞数目较多，我们的研究结果显示至少20个口腔上皮细胞或60个细胞检测到Identifiler®PCR试剂盒（美国ABI公司）中全部分型。最近几年发展起来的微量化反应，即芯片-低体积PCR扩增（on-chiplowvolume-polymerasechainreaction，LV-PCR）系统[23,24]，在低至1.5μL的PCR体系中，DNA模板与引物和聚合酶结合的机会明显提高，使微量细胞甚至单个细胞进行DNA分型变为现实，不仅检测的灵敏度得到提高，而且检验范围也大大拓宽了。LV-PCR使用贝克曼公司的AG480FAmpliGridslide进行扩增，前期大量的研究都是使用该产品进行，而且实验证明该产品灵敏度、准确性可满足法医单细胞检验的要求。另外一种最新的方法也值得关注，是在微液滴里进行PCR扩增。首先将单个细胞和荧光标记引物结合的微珠随机扩散在1.5nL的油包裹的琼脂微流液滴中，在大量微液滴内进行平行的PCR扩增反应后，于PCR扩增管内进行二次扩增，常规毛细管电泳检测，通过对大量单个细胞进行平行9重STR检测，获得混合样本各成分的STR分型。
4数据分析
单细胞检验由于DNA模板量非常低，其缺带、多带等现象经常发生，stutter峰较常规扩增强，单细胞检验的数据分析和低拷贝DNA的分析方法类似，需平行扩增，综合多次结果获得最终的STR分型。一般来说至少需获得5次有效分型（获得13个基因座以上的结果）[28]，重复3次及以上的位点才能确认为有效位点。
5单细胞测序
在二代测序技术和全基因组扩增技术（wholegenomeamplification,WGA）发展的基础上，2011年，Navin等人首次发明了单细胞测序（single-cellsequencing,SCS）技术，测定了人体单个细胞的基因组DNA。单细胞测序的文章呈逐年递增状态，从2011～2014年，由5篇文章上升至近30篇，涉及生物学多个领域，发表于生物学顶级期刊上。2013年《，科学》杂志将单细胞测序列为年度领域榜首《，自然方法》杂志将单细胞测序列为2013年年度最重要的方法学进展。
5.1全基因组扩增技术由于单个细胞DNA含量有限，需进行全基因组扩增才能满足二代测序的最低DNA量。目前，已有多种以单个基因组为模板的全基因扩增技术，简称寡核苷酸引物PCR技术（degenerateoligonucleotideprimedPCR,DOP-PCR）和多重置换扩增技术（multipledisplacementamplification,MDA）。其中DOP-PCR方法覆盖率低，但可获得准确的拷贝数。MDA方法是在恒温下利用具有强模板结合的phi29DNA聚合酶和六聚物进行链置换扩增反应。Phi29DNA聚合酶具有3’5’外切酶活性，并且具有特殊的多重置换和连续合成特性，产生的DN段较大，约为50~100kb，可以覆盖基因组的90%以上，和DOP-PCR方法一样也会产生不同区域扩增不平衡性，MDA方法产生的不平衡性不具有重复性。2012年，首次报道了基于多次退火环状循环的扩增技术（multipleannealingandlooping-basedamplificationcycles,MALBAC），该方法结合MDA扩增技术和PCR扩增技术的优势，利用特殊设计的引物，巧妙地使扩增子的结尾通过互补而成环，进而在一定程度上防止了基因组DNA的指数性扩增，明显降低了扩增偏倚性，并显著提高覆盖度，但是该方法使用Bst聚合酶，没有校错活性（proofreadingactivity）。现有的商业化试剂盒各项参数见表1。全基因组扩增技术虽然仍然会有基因缺失等问题，但是相信随着时间的推移和技术的进步，扩增的准确性会逐步提高。
5.2二代测序技术对单细胞全基因组扩增后进行二代测序。二代测序技术具有快速、高效、低成本的优点。近两年来的研究表明，二代测序结果的准确性很高，与传统的Sanger测序相当。二代测序技术在法医学中应用研究很多，目前已经有两种商业化的试剂盒，美国ThermoFisherScientific公司开发的基于SNP的theHID-IonAmpliSeqTMIdentityPanel和theHID-IonAmpliSeqTMAncestryPanel，主要通过SNP检测进行个体识别和祖先推断；美国Illumina公司开发的ForenSeqTMDNASignaturePrepKit，在一个PCR反应中可以同时扩增27个常染色体STR，8个X-STR，25个Y-STR，95个个体识别SNPs，56个祖先信息标记(ancestryinformativemarkers,AIMs)和24个显性特征SNPs，更适合法医学应用。这两个公司使用的测序技术的优缺点见表2。
6单细胞检验展望
医学检验常用染色方法范文3
1 真菌检测方法及意义
1.1 切片HE染色光镜观察(常规染色)
胃黏膜真菌感染多在黏膜表面的渗出层或坏死层,背景污秽,难以辨认,尤其是毛霉菌和曲霉菌的菌丝往往被误认为坏死脱落物质。只有念珠菌因其粗大的假菌丝和芽生孢子容易检出。另外,活检标本小、含真菌量少、一些真菌在HE染色切片中本身不易着色,这都是真菌漏检的原因。因此,单单依靠HE染色诊断真菌感染是不够的。
1.2 PAS染色光镜观察(特殊染色)
PAS染色法对真菌着色有一定特异性,切片中真菌鲜亮,是理想的真菌染色方法之一。真菌菌丝壁着红色,菌丝不完整,呈节段性[7]。芽生孢子红色,二端钝圆,横切面呈球形,有明显折光性。
1.3 Giemsa染色光镜观察(特殊染色)
当HE、PAS染色后,病理医师镜检仍不能确认是否有真菌感染时,Giemsa染色可以作为一种有效的补充染色。Giemsa染色对真菌着色清晰,菌丝和芽生孢子均呈蓝色。
2 真菌组织切片形态
2.1 念珠菌
在组织切片中,念珠菌主要位于黏膜表面的渗出及坏死组织内,HE染色尚能辨认芽生孢子和假菌丝(图1)。芽生孢子在10×40倍视野下可见两种形态:一种是较大的孢子,球形或略呈卵圆形,体积相当于中性粒细胞分叶核的一个片段,直径3~5 μm,苏木素浓染,染色细腻;另一种芽生孢子形态较小,圆形,紫红色,直径2~3 μm,中心可见淡染折光性强的空染区。在10×100倍光镜下,芽生孢子清晰,厚膜,中心可见淡染小泡。假菌丝由芽管延长形成,细而直,像一根透明胶管,有分隔,少部分有分枝。HE染色切片呈浅蓝色。孢子和假菌丝PAS染色呈鲜亮的玫瑰红色(图2),Giemsa染色呈天蓝色。
2.2 毛霉菌
HE染色切片中,毛霉菌比念珠菌粗大,长短不一,壁厚,直径为5~6 μm,多数情况下为10~15 μm,菌丝无隔,如形成皱褶,易误认为分隔,分支少而不规则。毛霉菌的特征性结构除无隔的大菌丝外,还能形成孢子囊,但HE染色切片很少见。毛霉菌HE染色呈浅蓝色,比细胞核着色略浅,易辨认。PAS染色切片呈玫瑰红色(图3),Giemsa染色粗大菌丝蓝染。
2.3 曲霉菌
HE染色切片,曲霉菌菌丝粗细均匀,直径为2~7 μm,有隔,淡蓝色,有时着色较浅,不易辨认。曲霉菌菌丝易变形,可呈小球或小囊状,聚集成群生长,也可散在生长,呈深蓝色,易被误认为是球菌。PAS染色清晰可辨(图4),菌丝呈红色,小球或小囊呈紫红色;Giemsa染色呈蓝色。
3 胃黏膜真菌感染的意义
3.1 重视真菌感染
真菌广泛存在于自然界,是主要的条件致病感染菌之一。机体抵抗力下降或胃黏膜屏障作用减弱时[8],均可引起胃黏膜真菌感染。胃黏膜真菌感染尤以慢性消化性溃疡多见,表面污浊,边缘不整;纤维胃镜下可见溃疡扩大、加深,溃疡面凹凸不平,表面污秽厚苔,周围黏膜结节状隆起,组织松脆易出血,为其典型特征,与溃疡型胃癌的形态表现颇为相似[9],X线甚至胃镜肉眼检查会误认为癌,因而在胃黏膜活检病理诊断时,须警惕真菌感染[10]。真菌感染的诊断目前仍然根据病理检查,在病灶内找到真菌菌丝[11]。采用方法主要为HE、PAS、Giemsa染色。单独依靠HE染色易造成漏诊。对胃溃疡病临床医师除考虑消化性胃溃疡和胃癌外,应高度重视真菌性胃溃疡的存在,减少误诊率。
3.2 胃溃疡与真菌的关系
胃黏膜真菌感染是否与胃溃疡有关,取决于胃黏膜上皮的完整性。胃黏膜始终处于细胞凋亡与增殖的动态平衡中。当真菌感染时,可能诱发胃黏膜上皮细胞过度增殖和凋亡,当凋亡的数目大于增殖的数目,增殖细胞又不能及时弥补凋亡细胞时,会导致溃疡形成[12]。胃溃疡形成后,缺损的黏膜层保护屏障不完整,局部免疫力下降,真菌进入胃内后,在溃疡渗出及坏死物中生长、繁殖。此时,真菌的代谢产物和酶加速溃疡的发展,使溃疡进一步扩大、加深,增加了出血及胃穿孔的机会。临床上难治性胃溃疡并不少见。潘国宗等[13]对难治性消化性溃疡的定义为:经用标准量的H2受体拮抗剂治疗后,曲霉菌菌丝粗细均匀,体积较小,有隔,淡蓝色,着色较浅;经胃镜确定,胃溃疡在12周末不愈合者。难治性胃溃疡病因复杂,除幽门螺杆菌感染外,真菌感染也是其病因之一。真菌感染引发的胃溃疡,一旦诊断明确,治疗效果非常明显,常用的药物有克霉唑(三苯甲咪唑)、制霉菌素等,疗程2~4周[14],治疗后经胃镜复查及病理活检诊断,溃疡可完全愈合。
3.3 胃癌与真菌的相关性
从慢性胃炎到最终发展为胃癌的演变过程中,各种致病因子可能单独或协同作用于不同的阶段,微生物感染是其中一个重要因素[15]。幽门螺杆菌感染引起胃溃疡、胃癌已普遍形成共识,真菌在胃溃疡、胃癌的发生中同样不能忽视。当真菌感染胃黏膜时,可能产生一些酶和毒素,造成胃黏膜上皮细胞过度增殖,通常被视为胃癌发生危险性增加的重要生物标记[16]。胃黏膜上皮细胞始终处于凋亡与增殖的动态平衡中,细胞过度凋亡同样可造成上皮细胞癌变。因为过度凋亡可刺激细胞不断增殖,许多致癌因子诱发癌肿的早期都能引起细胞凋亡增加[17]。因此,胃溃疡真菌感染可增加胃癌的发生机会,故胃癌的发生与真菌感染有一定相关性。
4 小结
胃镜活检检查对真菌性胃溃疡和溃疡型胃癌的鉴别诊断非常重要,是唯一的确诊方法[18]。虽然真菌在病理组织切片HE染色中能够被检出,但其结果不够理想,易造成漏诊。所以,PAS染色、Giemsa染色是非常有用的补充方法,对真菌的诊断意义重大。另外在分子生物学方面已有学者开始注意用PCR技术来辅助诊断真菌感染[19]。胃镜涂片和真菌分离培养等技术也可尝试。
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医学检验常用染色方法范文4
【关键词】 微生物；检验；应用体会
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.03.697 文章编号：1004-7484（2014）-03-1740-01
1 标本采集
标本采集作为微生物检验工作中的第一步，在临床实践中至关重要。而标本采集主要指将病人少许的血液、排泄物、分泌物、呕吐物、体液或脱落细胞等样品进行采集，本次实验中选取同一地区健康成年男性216人，分为实验组与对照组，每组108人，分别进行血液，痰，尿液和粪便的采集，其中实验组所采集的标本进行人为模仿检验过程中的污染进行污染处理，对照组标本进行正常处理。其采集标本的结果直接影响了之后的检验程序，甚至影响到临床用药的正确与否[2]。因此，在进行标本采集时，需严格遵循标准采集程序，为之后的检验步骤奠定基础。
1.1 血液标本 血液标本作为微生物检验中的一种重要方法，能够在一定程度上协助诊断疾病，为临床治疗提供依据。血液标本通常在临床医生对患者使用抗生素前或停药24h后进行采集，采集方法分为毛细血管采集法与静脉采集法，而采集的标本主要分为全血标本、血清标本及血培养标本[3]。儿童与成人的采血量不同，儿童采血量一般选择在1至5ml，成人采血量一般选择在8至10ml，并于24小时内于不同部分采集2-3分血量[4]，而采血量的多少并不固定，通常随着疾病的严重程度进行变化。
1.2 痰标本采集 痰标本采集作为微生物检验中的另一常见方法，可通过对患者痰液内细胞、细菌、寄生虫等的检验，观察其性质、颜色、气味和量，协助诊断呼吸系统的某些疾病[5]。痰标本采集法的主要方法为：取进行水漱口2至3次的患者深部咳出的第二口痰用无菌容器封装，及时送检。
1.3 尿标本采集 据临床资料显示，尿标本的采集检验可对患者的病情进行正确的诊断，为其提供依据。尿标本的采集不仅可以了解患者此阶段的病情，可以进一步判断患者的意识状态及心理状态。尿标本采集时需注意使用10-20ml晨尿中段作为标本于无菌容器中，并用水冲洗尿道周围，保证尿道洁净。
1.4 粪便标本采集 粪便标本作为常见的微生物检验方法之一，不仅可以帮助相关医疗人员评估其基本病情，也可反应患者的排泄功能是否异常。在采集粪便标本的过程中，因棉花棒上常吸附大量有效成分，包括细菌、白细胞、原虫卵等，可在一定程度上降低细菌培养的阳性率。因此，在粪便标本采集时避免使用棉花棒进行采集，应告知患者在采集粪便的过程中直接选择收集颜色和性状较为独特的粪便与无菌容器中。
2 统计学处理
采用SPSS18.0统计软件对本次研究所取得的数据进行分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采取t检验，以均数±标准差（χ ±s）的形式对数据进行表示，以P
3 标本验收
标本的验收作为微生物检验过程中较为核心的一部分，其目的在于保证所收集的标本符合试验要求，以此保证标本的质量。而标本的验收主要分为以下几步：①对合格标本进行签收；②对采集进行分类验证；③对未合格标本进行拒签与登记；④对特殊标本进行及时安排。
3.1 血标本验收 血液标本的合格标准为：血量的多少符合要求且未受到污染，无菌器皿保证未出现泄漏与破裂等情况，且对血液标本进行及时黏贴标签，保证标本与患者的正确匹配。表1结果显示对照组的标本正常人数明显高于实验组，P
3.2 痰标本验收 痰标本可直接使用涂片并送至革兰染色镜检，验收过程中，同样注意避免污染。痰标本的合格标准为：WBC>25个/低倍镜视野，鳞状上皮
3.3 尿标本验收 尿标本验收中所应注意的主要环节为：保证收集器皿洁净无污染且未出现破裂或溢出等情况。表3结果显示对照组的标本正常人数明显高于实验组，P
3.4 粪便标本验收 粪便标本验收中应注意收集容器外是否有粪便残留导致标本污染，且需注意粪便的颜色及性状，若送检标本不合格，经及时拒检并要求患者重新采集。表4结果显示对照组的标本正常人数明显高于实验组，P
5 小 结
除上述方法外，包括显微镜检查，显微镜检查可为医疗人员提供重要的诊断价值依据。对所收集的标本进行格兰染色，以确保标本的质量，并作出及时的分类。几种常见的诊断依据如下：①尿道分泌物经革兰染色镜检后呈现格兰阴性双球菌，可初步判断为淋病；②粪便中球杆菌的比例检查，可用来判断肠道菌群失调；③痰液的抗酸染色检验抗酸杆菌，可为肺结核的诊断提供理论依据[7]。
药敏试验通常适用于抗生素治疗前，可为相关医疗人员提供抗生素治疗理论依据。但据相关临床资料显示，约86%的医疗人员仅凭借自身经验为患者制定抗生素治疗方案，并未严格执行药敏试验，同时增加了患者出现过敏情况的风险，甚至危及到了患者的生命安全。因此，为患者进行药敏试验至关重要。在药敏试验过程中，需对细菌的种类进行及时分离，避免出现漏检等情况，且细菌的鉴定结果和药敏试验应在72h内完成[8]。
据以上研究情况表明，微生物检验的结果可为临床诊断提供重要的参考依据，也可对患者的疾病做出初步判断，并对患者的治疗效果进行评估。只有通过广大检验专业人员长期、大量、细致的工作，才能不断提高检验质量[9]。总之，微生物检验技术作为临床诊断疾病的一种较为常用的形式，具有十分重要的意义，可在一定程度上提高患者的生存质量，甚至提高患者的存活率，值得在临床范围内广泛推广。
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医学检验常用染色方法范文5
尿液是血液通过肾小球滤过、肾小管和集合管的重吸收及排泄产生的代谢产物。尿液在调节水、电解质、酸碱平衡及排泄废物中起到十分重要的作用，由于血液与全身各组织、器官的密切关系，因此尿液的组成和性状可反映机体代谢情况及各系统功能状态，尤其与泌尿系统疾病直接有关。尿液检验又称尿液分析，是泌尿系统进行疾病诊断、疗效及预后判断的首选项目。
尿液一般检验主要包括传统的物理学（肉眼）检查、化学检查和显微镜检查。现代尿液一般检验以尿干化学试带和尿液化学分析仪方法替代传统的化学检查，具有快速正确的优点，但不能代替传统的尿沉渣显微镜检查。现代尿液检验方法，尚有放射免疫法、尿酶联免疫法、色谱法、分子生物学法、电镜法、流式细胞仪法等多种检验方法，可检测尿中各种蛋白、氨基酸、酶、激素、抗体、细胞因子等，对诊断疾病及估计治疗效果起了十分重要的作用[1]。
1 尿沉渣显微镜检查
此项检查是尿常规检查中的重要项目之一。尿沉渣检查是用显微镜对尿沉淀物进行检查，识别尿液中细胞、管型、结晶、细菌、寄生虫等各种病理成份；辅助对泌尿系统疾病作出诊断、定位、鉴别诊断及预后判断的重要常规试验项目。在一般性状检查或化学试验中不能发现的变化，常可通过沉渣检查来发现。尿沉渣检查可分为非染色尿沉渣镜检、染色尿沉渣镜检和尿沉渣定量检查。非染色尿沉渣镜检，应取混匀新鲜尿液，直接涂片或取10ml尿离心（水平式离心机、离心半径15cm，1500r/min，378G）离心5min后弃去上清液，留下0.2ml沉渣，轻摇离心管，使沉渣有形成分充分混匀，取尿沉渣20ul，滴入载玻片上，用18×18mm的盖玻片覆盖。尿沉渣镜检观察，用10×10镜头，观察其中有形成份的全貌和管型。用10×40镜头观察鉴定细胞成份和计算数量，应观察10个视野所见最低和最高值，再计算出平均每一个视野的数值，记录结果。管型用高倍镜鉴定，但计数数量按低倍镜观察20个视野，算出平均一个视野平均值，记录结果。参考值：①细胞成份；每高倍镜视野所见的最低～最高值；红细胞0～3/HP；白细胞0～5/HP。②管型（透明）：每低倍镜视野平均值0～1/全片。③尿结晶和盐类数量以每一高倍视野（+）、（2+）、（3+）、（4+）报告[2]。染色尿液沉渣镜检可分为离心法及混匀一滴尿法。离心法敏感，检测阳性率高，为目前住院病人，尤其是内科和泌尿科病人常规检测方法，但其手续繁琐、费时，且因操作条件不同，如离心的尿量、转速和时间、保留尿沉渣体积等不同而使结果不一致。混匀一滴尿法简单易行，但阳性率低，易漏诊，常用于非泌尿系统疾病的过筛检查，除明显混浊的血尿、脓尿外应强调用离心法，用染色时透明管型不易漏检，也有助于其它细胞成份结构观察。尿沉渣定量检查，其方法为过筛法和一小时尿沉渣计数。过筛法主要留取病人新鲜晨尿，混合后直接滴入血细胞计数池内，计数5大格中红细胞、白细胞、上皮细胞及管型数，结果×2得出每ul内的数。参考值：正常人每ul新鲜尿中红细胞、白细胞、小圆上皮细胞为0～2/ul，超过了2～5/ul为可疑，＞10/ul为阳性。1小时尿沉渣计数，其方法为：患者先排尿弃去，准确收集3小时尿液于清洁干燥容器内送检，准确测量3小时尿量，充分混合。取混匀尿液10ml，置刻度离心管中，1500r/min离心5min，用吸管吸弃上层尿液9ml，留下1ml，充分混匀。吸收混匀尿液1滴，注于血细胞计数板内。细胞共数十大方格，管型计数20个大方格。参考值：红细胞0～100000/1小时尿；白细胞0～200000/1小时尿，管型＜3400/1小时尿。
对尿沉渣有形成份的识别除了应用普通光学显微镜之外，还可用偏差显微镜、位相显微镜、荧光显微镜进行检测。尿沉渣显微镜检查以它独特的临床价值仍是尿液分析中不可缺少的检查手段[3]。但由于尿沉渣操作费时，在大批量标本检查时，特别是门诊病人急需试验结果时，每个标本都经严格操作得出沉渣报告是困难的，因此需要找一个简单、快速的方法进行筛选，将完全正常的标本筛出后，有利于对异常的标本进行规范性检查，干化学尿液分析提供了筛选的试验手段[4]。
2 尿液自动化学分析仪
现代科学技术的发展，使尿液化学分析实现了自动化，在尿液化学分析仪上运用多联尿干化学试带可同时检测尿液中10多种化学成分。干化学分析是利用液体标本直接加到干燥试剂上，以标本中水为溶剂引起特定化学反应的方法。可同时测定尿PH、尿蛋白质、葡萄糖、酮体、隐血、胆红素、尿胆原、亚硝酸盐、白细胞、比密等。近年来11联尿试带也已问世，增加了除上述10项外的抗坏血酸项目，来反映尿中维生素C的含量。尿液自动化学分析仪工作的基本原理是反射光度法。即用尿干化学分析试带与尿中相应化学成份反应，当该产生颜色变化的试带，被波长不同的发光二极管照射后，产生反射光。反射光由光电管接受，光信号转化成为电讯号，电讯号传送至模拟数字转换器，转换成数值，经微处理控制器处理，自动显示结果。通常试带颜色深浅与被测中物质在一定浓度范围内成正比，而与反射光的强度成反比。其操作方法为：吸取混匀尿液约10ml，在尿分析仪上作尿化学10项测定，测试完毕后，标本再以1500r/min离心沉淀5min，弃去上清液，取沉渣约0.2ml涂片镜检。尿干化学分析仪参考范围：PH5～7，比重（SG）1.015～1.025；蛋白质（pro）阴性；葡萄糖（GLU）阴性；酮体（KET）阴性；胆红素（BIL）阴性；亚硝酸盐（NIT）阴性；白细胞（LEU）阴性；红细胞阴性：维生素C 20～100mg/L。尿液自动化学分析仪操作简便、快速、准确、结果可靠，在许多国家已经把它作为常规方法在临床检验中广为应用。开机平衡后几分钟即可报告结果，故极适合用于急诊标本。另外，由于干化学分析除了仪器和干片外，无需贮备任何其它试剂和配制任何溶液，故对于相对独立的门诊部或诊所及病人的床头检查和家庭监护，这类仪器极为适用。但也有其缺点，如果使用不当或许多中间环节及影响因素都将直接影响自动化分析结果的准确性，不仅会引起实验结果的误差，甚至延误诊断，因此要求操作者对自动化仪器的原理、性能、注意事项及影响因素等方面的知识有充分了解，正确使用自动化仪器，这样才能使尿液分析仪得出的结果更可靠、准确。自动分析也不能完全取代涂片镜检，尤其是管型、红细胞、脓细胞、结晶等可能漏检或不正确，所以说不能完全依赖尿液分析仪，必须结合镜检，才能纠正分析仪不能检出的结果，为临床提供正确报告，故镜检在尿检查中是十分重要的[5]。
3 全自动尿液分析仪
目前尿沉渣检查多采用人工显微镜检查作为主要检测手段，然而其遇到的首要问题是方法如何统一，镜检如何标准化。在整个手工镜检过程中，取多少尿离心，离心力大小，离心时间长短，最后剩下多少沉渣物，取多少镜检；所加盖玻片的面积，显微镜放大倍率、观察多少视野及报告方式等，国内外很不一致。同时由于尿标本成分复杂、成分鉴别的主观性、尿沉渣的报告方式不统一、尿沉渣参考值不一致等原因，使得检测结果由于报告速度慢、检验人员劳动强度大，检测结果个体误差大、重复性较差而无法满足临床的要求。SYSMEX公司研制生产的全自动尿有形成份分析仪UF-100在这样的背景下应运而生，由于它具有手工操作无法比拟的重要精度，可以完全自动地对尿液中各有形成份作模拟鉴别和计数，并能获得多项更客观而有效的分析结果，其定量报告可有助于临床的疗效监控。其对红细胞形态的鉴别可有助于临床了解泌尿系统出血部位以及仪器的高检测效率等多方面的先进性与优越性，而成为尿沉渣检查筛选手段的首选工具。UF-100全自动尿有形成份分析仪采用先进的激光流式细胞检测技术及荧光染色技术，并与电阻抗测定法结合对尿有形成份进行直接鉴别及计数，使自动化尿检获得了重大突破。UF-100装备有综合性数据提示信号系统，可协助操作员迅速确定需要复查的标本。由用户定义的数据提示信号还可以设定需要的分析灵敏度，帮助检测可疑标本，为临床提供有用信息。触摸感应式的彩色液晶屏幕不仅可以显示数据，同时还可以输入字母及数据，分析操作只需将标本架设置在所定的位置上，按下按钮，便可启动自动分析功能，使实验室具有卓越的效率。UF-100还具有综合质量控制程序，备有12个文件及每个定量参数的180个数据，提供可信赖的监控系统，以保证最佳性能。可存储1000个标本的散射图和直方图，还包含标本的物理化学特性的综合数据。双向连接口能够实现测试指令与主机及化学定性检查装置之间的全自动通讯，从而建立了一个可靠的多功能工作站[6]。UF-100测定原理为：吸入800ul尿液后自动加以稀释和混合，并对细胞、细菌等有形成份作特异性染色，通过加压使细胞进入充满鞘液的流室。因鞘液的约束下细胞排成单列，经流室喷嘴喷出，形成的细胞柱与激光束垂直相交，使激活的细胞产生荧光。流式细胞入口两端电极间的恒定直流电使有形成份通过时产生与细胞大小呈正比的电阻变化。通过测定前向散射光、荧光的波幅和强度及电阻抗的变化报告12个参数，对细菌、白细胞等5种有形成分进行分析[7]。UF-100操作简便，检测速度快，无需离心标本，仅需70s便可生成打印的检验报告，每小时能完成100份标本的检测，可使临床医生在第一时间段获得尿液检查的有关信息，但也有假阳性、假阴性结果，还不能完全取代传统显微镜镜检，虽可用于临床尿路感染的筛检，但不可替代定量细菌培养[8]。
综上所述，尿流式沉渣分析、尿干化学与传统手工操作是三种完全不同原理的分析方法，虽然都能分析尿中红细胞、白细胞、蛋白质、细菌等，但由于原理不同，结果肯定不一致。只有认识了它们的原理，才能正确理解认识这种差异[9]。无论上述哪一种方法，都不能说是很完善的筛检方法。但相比较而言，UF-100假阴性率最低，且检测速度快，相对于尿沉渣镜检或试纸法来说，UF-100筛检效果较好，能满足对阳性标本作进一步的病原体分离培养、鉴定及药敏试验的需求。若结合干化学试带和镜检，可以为临床提供更多、更准确的信息[10]。
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医学检验常用染色方法范文6
本文简单介绍了拉曼光谱的原理、拉曼光谱分析技术在纺织纤维定性方面的应用现状，结合目前纤维定性鉴别的方法，提出了将拉曼光谱用于纺织纤维定性的可行性，突破了现有检测方法存在的局限。
关键词：拉曼光谱；定性；纺织纤维；应用
随着新技术的不断更新，新的化学纤维层出不穷，为了充分利用各种化学纤维的优良性能以满足各种用途的需要，多种化学纤维与天然纤维混纺或交织的产品愈来愈多，给纤维检验工作带来了很大困难，因此开发新型检测技术，提高纤维定性水平，简化检验程序尤为重要。本文简单介绍了一种新型的检测技术“拉曼光谱”的原理以及其在纺织纤维定性工作中的发展应用。
1 纺织纤维定性检验方法现状
纺织纤维含量检测是纤检部门检测的重要项目之一。在纺织品纤维含量检测过程中，首先需要对纺织品中不同的纤维组分进行定性，来确定纺织品纤维组分。目前，纤检部门常用的鉴别方法包括显微镜观察法、燃烧法、化学溶解法、熔点试验法、红外光谱分析法等几种。最常用的是燃烧法、显微镜法和化学溶解法[1]。
燃烧法和显微镜观察法以及化学试剂法在定性检测中都有一定的局限性，例如粘胶纤维、莫代尔、莱赛尔3种再生纤维素纤维，它们在显微镜下的形态以及燃烧现象很相似，难以很好地区分。有的检验需要采用化学溶解的方法，常用几种有毒的化学试剂[2]（如二甲基甲酰胺、甲酸/氯化锌等），不仅给检验人员身体健康带来危害，而且对大气造成污染。红外光谱定性分析方法虽然可以准确地鉴别纺织纤维，在纤维定性中得到了很多应用，但是它对测试环境温湿度要求较高、检测周期长，样品制作麻烦。
近来，环保、快速、准确的检验方法已成为纺织品检验人员的追求目标。拉曼光谱定性检测方法因具有需要样品量少、不需前处理、测试速度快、对样品无损害、测试结果准确、不产生污染物等诸多优点，可以有效地解决纺织行业现行方法存在的问题。
2 拉曼光谱测量原理
2.1 拉曼光谱原理
拉曼散射是光照射到物质上发生的非弹性散射所产生的。单色光束的入射光光子与分子相互作用时可发生弹性碰撞和非弹性碰撞，在弹性碰撞过程中，光子和分子间没有能量交换，光子只改变运动方向不改变频率，这种散射过程称为瑞利散射。而在非弹性碰撞过程中，光子与分子之间发生能量交换，光子不仅仅改变运动方向，同时光子的一部分能量传递给分子，或者分子的振动和转动能量传递给光子，从而改变了光子的频率，这种散射过程称为拉曼散射。拉曼散射分为斯托克斯散射和反斯托克斯散射[3]。
拉曼光谱具有以下特点：
（1）检测范围广，拉曼光谱可以检测所有的无机和有机化合物、高分子混合物。
（2）检测灵敏度非常高、速度快、无损、无污染。拉曼光谱方法是一种纯粹的化学检测方法，其检测过程不需制样、不损害样品、不产生污染物、分析周期短、重复性好。
（3）拉曼光谱检测所需试样不受水的影响，而且对样品的大小没有要求，可以检测微量样品。虽然近红外也可以适用于各种类型的试样，但实际操作仍然有许多困难。
2.2 拉曼光谱仪的测量原理
拉曼光谱仪的测量原理如图1所示，将一块样品放在仪器上，用激光束照射，仪器会自动产生拉曼光谱图，样品的组成不同，所测得的谱图不同，根据谱图的特征来辨别样品的组成。
3 拉曼光谱的发展和应用
拉曼光谱技术是定性分析的强有力的工具。拉曼光谱常包含有许多确定的能分辨的拉曼峰，所以，原则上应用拉曼光谱分析可以区分各种试样。不过，所有可能的纯净材料和它们的混合物的数量是无穷尽的，仅有少量的简单分子及其混合物的拉曼光谱，在与其他式样的光谱相比较时，能轻易地区别出来。所以，定性分析的一个必要工作是根据测得的拉曼光谱判定出可能的材料和混合物，限定这些可能物的数量。这一工作的完成需要应用试样的其他信息，例如试样的来源和经历，是否是混合物，它的物理性质和外貌以及其他技术得到的资料[4]。
拉曼光谱之所以一开始就受到重视，是因为它与红外光谱有相同的波长范围，但操作比红外光谱简单。目前，拉曼光谱已广泛应用于考古、医学、石油化工、林业和法庭科学等诸多领域。随着激光技术的发展和检测装置的改进，拉曼光谱技术在当代工业生产和科学研究中必将得到越来越广泛的应用。王文科用激光拉曼光谱对乙醇、甲醇的混合物进行了研究，结果表明用工业酒精甚至甲醇勾兑的假酒利用拉曼光谱法鉴别是可行的。
4 拉曼光谱在纤维定性方面的应用情况
在拉曼光谱分析纺织纤维结构方面，近几年的研究主要集中于以下几个方面：复合材料的界面和机体结构的测定，再生蚕丝制备过程中，分子链规整度和取向度变化的测定；丝素经酶处理后，高分子结构的变化研究以及羊绒和羊毛分子结构研究，而在纤维成分分析方面有如下研究：鉴别天然绿色棉和染色棉；研究聚丙烯、羊毛、聚酯和一些天然纤维的鉴别方法；对染色纤维中染料的分析以及比较红外光谱与拉曼光谱对染色纤维区分的效果。吴俭俭等用拉曼标准谱图试验区分了聚酯纤维PET和PTT，并提出了利用单组分样品的标准化谱图建立特征表数据库的建议。拉曼光谱特别适合于鉴别化学结构相近的同类纤维，如莱赛尔、莫代尔、铜氨等再生纤维素纤维以及聚酯纤维（PET、PBT、PTT）。
拉曼光谱主要用在针对混纺织物的纤维定性鉴别中，由于每种纤维的分子组成不一样，得出的光谱图也各有特征。首先采取各种不同的纤维的单组分织物在拉曼光谱仪上测出光谱图，采用提取特征值、特征表的方法记录每种纤维的特征峰个数、特征峰的值以及对应的X轴上的值建立数据库，再将待测样品进行测量得出的谱图与数据库中的值进行对比，即可得出织物的纤维组分。该方法能满足纤维检测的要求，并以快速、无损、环保的优点弥补了传统方法的不足，具有很高的应用价值。
虽然纺织纤维的拉曼光谱检测方法具有方便、快速、环保、稳定等优点，但受限于其测量原理，拉曼光谱在纤维鉴别中也存在一些局限性，比如荧光物质、纤维熔点、黑色染料、纤维含量等因素的影响。与红外光谱分析法比较，对检测环境的温湿度无特别要求，样品无需特殊处理，特别适合检测含水的样品。
5 结论
显微镜法、燃烧法、溶解法鉴别纺织纤维是目前定性行之有效的方法，但由于新的化学纤维不断出现，用以上方法就难以区分了。拉曼光谱技术是定性分析的强有力的工具，其快速、无损、环保的优点弥补了传统方法的不足，具有很高的应用价值，拉曼光谱技术现已广泛应用到了考古、医学、石油化工、林业和法庭科学等诸多领域。随着激光技术的发展和检测装置的改进，拉曼光谱技术在纺织纤维定性工作中必将得到越来越广泛的应用，当然， 目前依然面临着一些急待解决的问题，如建立一个所有纤维拉曼光谱特征峰的数据库、检测装置的改进等，这些都是目前有待于开发的课题。
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