地球表面积的71%左右被水覆盖，包括海洋和淡水水域，在这些水环境中，蕴藏着丰富的蛋白资源。水产蛋白质尤其是海洋生物蛋白质的品位极高，所含必需氨基酸种类丰富、营养均衡，有着陆地蛋白资源无法替代的优越性。近年来，世界水产总量一直保持在每年一亿吨左右。在如此巨大的蛋白资源中除了部分直接用于食用外，很大部分低值水产品及水产品加工过程中产生的副产物或是经过粗略的加工制成鱼粉，或是直接丢弃，产品的附加值很低。无论是鱼粉加工过程中产生的废水还是直接丢弃的低值水产品，直接排放到环境中都会造成严重的环境污染。因此，如何运用生物技术对这些低值水产品和水产加工过程中产生的副产物进行高值化利用，是目前生物技术领域急需开展的研究课题。其中，运用微生物技术和酶技术对这些低值水产蛋白资源进行酶解利用，是开发水产蛋白资源的重要途径。我国是一个水产大国，自上世纪90年代以来，我国水产品产量一直稳居世界第一。然而，目前我国在水产蛋白资源的酶解利用方面的研究并不多，而且不够深入。对富含蛋白质的低值水产品和水产加工副产物进行酶解综合利用，不仅可提高其附加值，改善水产蛋白资源的营养及功能特性，同时还可减少对环境的污染，产生良好的经济效益。 1酶解工具蛋白酶的来源及选择 1.1蛋白酶的来源 目前用于水产蛋白资源酶解利用的蛋白酶种类很多，根据其来源可分为植物，动物和微生物来源三类。来自植物的蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶等，其中以木瓜蛋白酶在水产蛋白资源酶解中应用最为广泛。来源于动物消化道的蛋白酶包括胰蛋白酶，胃蛋白酶，胰凝乳蛋白酶等，除了上述常用的动物消化道蛋白酶之外，有些学者使用自行从动物消化道中提取的消化酶作为水产蛋白酶解的工具酶，如从鲭鱼肠道中提取的蛋白酶(mackerelintestinecrudeenzyme,MICE)[1]，从大西洋鲑鱼幽门盲囊中提取的蛋白酶[2]和从金枪鱼幽门盲囊中提取的蛋白酶[3]等。微生物发酵产生的蛋白酶在水产蛋白酶解利用中应用较多，产酶微生物有细菌，霉菌，酵母和放线菌。细菌类蛋白酶主要是枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌产生的，一般是中性或碱性蛋白酶，如Novozymes的Neutrase，Protamex，Alcalase[4]和RohmEnzymes的Corolase7089[2]等，霉菌产生的蛋白酶有Novozymes的Flavourzyme和RohmEnzymes的CorolasePN－L等[4]。 1.2酶解工具蛋白酶的选择 不同的蛋白酶对同一底物的水解效率不同，而且不同蛋白酶酶解产生的产物的理化功能特性和化学组成存在很大的差异，因此，酶解所用的工具蛋白酶的选择对于水产蛋白资源酶解利用是非常重要的。不同的蛋白酶由于酶切作用方式及酶切位点的不同，酶解产物营养成分组成如肽段的分子量大小和游离氨基酸的组成上存在很大的差异。如胰蛋白酶的酶切作用位点比较少，只能裂解碱性氨基酸Arg或Lys羰基侧肽键[5]，因此酶解产生的片断较大。研究显示，用细菌蛋白酶(Alcalase，Neutrase，Protamex)酶解的酶解产物，分子量小于2500Da的肽段较多，而来自动物(猪，鳕鱼)胰脏的蛋白酶酶解产物中分子量较大的肽段较多，而且以氮回收率为考察指标时，细菌蛋白酶优于从动物组织中提取的蛋白酶[6]。不同的蛋白酶对酶解产物的风味的好坏也有很大的影响。酶解反应所用蛋白酶及其用量、水料比、pH值、温度和酶解时间等因素对酶解产物的风味值均有影响[7]。在蛋白资源的酶解利用中，成本最高的是所使用的外源蛋白酶，因此，从经济效益上讲，蛋白酶的选择至关重要。目前研究及生产上所用的蛋白酶种类较多，如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、Flacourzyme、Protamex、Alcalase、Neutrase等，研究表明，以蛋白质回收和获得最大水解度为目的时，以Protamex[6][8]和Alcalase[2]最为合适；若以酶解产物风味为选择指标，则使用Flacourzyme[7]为适宜。 2水产蛋白资源的酶解利用现状 人们对水产蛋白资源的酶解利用可以追溯到上世纪六十年代，几十年来，研究人员对水产蛋白资源的酶解利用的研究始终保持着浓厚的兴趣，到目前为止，已有大量的水产蛋白资源被应用于酶解利用研究。表1所列为近十几年来部分被应用于酶解利用的水产蛋白资源。从表1中可知，可用于蛋白酶解利用的水产资源十分丰富，许多鱼类、软体动物、甲壳动物和单细胞藻类以及鱼、虾、蟹、贝类等加工后的副产物都可以应用于酶解利用，其中种类丰富的鱼类及其加工过程中产生的副产物是水产蛋白酶解利用的主要对象。通过蛋白酶解的方法对加工过程中产生的副产物进行综合利用研究，可以尽可能多的回收这些渔业加工副产物中的蛋白质，以达到对其充分利用的目的。许多研究表明，水产蛋白质资其酶解产物与酶解前比较具有较高的营养价值和很好的功能特性，可以应用于饲料、食品、化工、医药等各个领域，实现对其高值化利用。 3酶解工艺、酶解过程及酶解产物特性 水产蛋白的酶解和陆地蛋白的酶解就其工艺流程和水解过程来说基本是一致的。在工艺上，所有的酶解反应都包括调节酶解条件(pH值、温度等)、酶解、酶解反应的终止、产物的分离等过程，图1为酶解反应工艺流程图[2][7][9～12]。蛋白酶解的机制非常复杂，因为底物中包含了大量的不同种类的不溶性蛋白质。一般认为，所有的酶解反应至少分为两个阶段，首先，酶分子与蛋白质颗粒连接，蛋白质中一些特殊的残基和肽键进入酶的活性中心，第二步，水解反应的发生，释放出大量可溶性的多肽和氨基酸，越处于核心、结合越紧密的蛋白质水解速度越慢。一般来说，蛋白质的酶解反应在最初的0.5～2h内保持较高的水解速度，这一时间由于酶解反应的底物和所用的蛋白酶不同而有差异，Liaset等的研究显示用Protamex对大西洋鲑鱼鱼排进行酶解以氮回收率(nitrogenrecovery%，NR%)为反应指标，酶解反应在最初的0.5h内保持较高的水解速度[8]；而在Guérard等的研究中，水解速度在最初的1.5h内保持较高的水平[10]。随着酶解反应时间的延长，酶解反应速度明显下降。蛋白质酶解反应的这一特性可以用水解曲线(如图2)表示，在反应的初期阶段，水解度随着反应时间的增长而有较大的增高，随着时间的延长，这种增长越来越小，水解速率明显下降，最后，水解速率降为0而水解度达到最高。这种蛋白酶解所呈现的典型的曲线在许多水产蛋白资源的酶解研究中被发现，如对大西洋鲑鱼[2][8]、金枪鱼[10][14]、毛鳞鱼[11]、沙丁鱼[13]等的酶解都呈现了上述规律。笔者在利用Flavourzyme对罗非鱼鱼头进行酶解的研究中也发现了上述规律，在酶解条件固定时α-氨基氮质量(α-aminonitrogen，AN)随着酶解时间的变化符合水解曲线所显示出的规律，并且α-氨基氮质量在酶解反应最初的1h内保持较大的增长。1993年，Moreno和Cuadrado通过碱性蛋白酶Alcalase(酶解条件：50℃，pH8)对鹰嘴豆蛋白(chickpeaproteins)的酶解研究，认为水解曲线所揭示的趋势产生的原因有如下三点：①可被蛋白酶裂解的肽键数目的减少；②酶活力的降低；③产物抑制作用[15]。2001年，Guérard等学者用Alcalase酶解黄鳍金枪鱼废弃物，通过在酶解反应中途加入酶解底物(即金枪鱼废弃物)，发现水解度的增加和中途加入的底物的量成正相关，因此Guérard等认为可被蛋白酶裂解的肽键数目是控制水解速率的主要因素[10]。蛋白资源在酶解过程中除了呈现出统一的酶解规律之外，不同来源的蛋白质资源的酶解产物还具有一些普遍的特性，如溶解性增加，乳化性能增强，具有一定的发泡性能，流动性增加以及具有更高的营养价值和更易吸收等等。根据水产蛋白资源的上述特性，可以将其应用于饲料、食品、化工及功能性食品等各个领域。#p#分页标题#e# 4水产蛋白资源酶解产物的应用 4.1水产风味调味品 随着时代的发展，人们对调味品的追求也越来越高，水产风味调味品，由于其含有丰富的氨基酸、多肽、糖、有机酸、核甘酸等呈味成分以及牛磺酸和高度不饱和脂肪酸等保健成分，越来越受到人们的青睐。应用蛋白酶酶解各种低值水产品和水产加工过程中产生的副产物，获得风味产品以提高其经济价值。与内源蛋白酶自溶和强酸强碱分解法相比较，外源蛋白酶酶解具有反应条件温和、水解效率高、催化反应专一，有利于确定化学性质等优点。1994年，Kim等利用小龙虾(Crayfish)肝胰腺提取物对蟹加工过程中产生的副产物进行酶解，获得了风味值较高的酶解产物[17]。1999年，Imm和Lee应用Flavourzyme对红海鳕鱼肉进行酶解，证明经过酶解的鱼肉风味值远高于未经酶解直接烹煮的鱼肉，而且酶解产物中的风味氨基酸含量是未经酶解鱼肉中的6～9倍[7]。 4.2在微生物培养中的应用－水产蛋白胨 水产蛋白资源被酶解后，酶解产物具有蛋白质含量高，水溶性好，其中多肽和游离氨基酸丰富等特点，因此，水产蛋白酶解产物即水产蛋白胨可作为发酵工业和实验室中微生物培养所用的蛋白胨。2001年，Mukhin等将由从鲎肝胰腺中提取的蛋白酶酶解冰岛扇贝加工废弃物得到的酶解产物应用于微生物培养，对其在微生物培养基中作为氮源的应用做了评估，认为此蛋白胨可应用于微生物培养[18]。Guérard等将来自于金枪鱼、鳕鱼、鲑鱼和杂鱼的蛋白胨应用于细菌、酵母和霉菌的培养，并与酪蛋白胨相比较，结果显示上述鱼蛋白胨应用于微生物的培养效果显著[10]。Aspmo等将从大西洋鳕鱼内脏酶解获得的产物应用于微生物培养，并与数种市售蛋白胨如胰蛋白胨、大豆蛋白胨，酵母提取物等进行比较，结果显示，大西洋鳕鱼内脏蛋白胨作为一种混合氮源，可用于替代市售蛋白胨；并且，对于培养一种对营养需求苛刻的乳酸菌(Lactobacillussakei)，其培养效果明显高于各种市售蛋白胨[19]。 4.3在功能食品和药品中的应用 越来越多的研究表明，蛋白质氨基酸序列中的某些多肽片断在释放出来之后具有一定的生物活性作用，如降血压、促进生长、抗凝血、抗氧化、增强免疫力等，因此，蛋白质酶解产物或从中分离得到的肽可以作为药品或作为配料应用于功能食品行业。近年来的研究表明，许多水产蛋白资源的酶解产物都具有抗氧化作用，如鳕鱼[3]、鲭鱼[20]、毛鳞鱼(capelin)[21]等，2005年，Je等从阿拉斯加鳕鱼鱼排酶解产物中分离得到了一个具有抗氧化作用的六肽：Leu-Pro-His-Ser-Gly-Tyr,分子量为672Da[1]。2001年Byun和Kim从阿拉斯加鳕鱼鱼皮胶原蛋白酶解产物中分离得到了两个具有血管紧张素转化酶Ⅰ(ACEⅠ)抑制作用的三肽：Gly-Pro-Leu和Gly-Pro-Met[22]。2005年，Rajapakse等从黄鳍金枪鱼(yellowfinsole，Limandaaspera)酶解产物中分离得到了一个具有凝血因子Ⅻa和血小板聚集抑制作用的蛋白质[23]。除了上述应用之外，水产蛋白资源的酶解在水产资源的开发上还有很多用途，如用于壳聚糖[24]、牛磺酸[25]等的制备，用作乳制品的替代品等。 5水产蛋白资源酶解利用研究展望 5.1更优蛋白酶的筛选、酶解工艺的优化 蛋白酶是水产蛋白资源酶解利用中最昂贵的成分，也是蛋白酶解利用成本的主要来源。因此，筛选高效、廉价的蛋白酶将一直是水产蛋白资源酶解利用的研究热点之一。酶解所用蛋白酶可以来自于工业发酵，也可以来自于动植物组织提取。利用从水产加工副产物甲壳类的肝胰腺和鱼类的消化道组织中提取的蛋白酶对其他低值水产品或水产加工副产物进行酶解，如Mukhin利用从鲎肝胰腺中提取的蛋白酶对冰岛扇贝加工副产物进行酶解[18]；Jeon等利用金枪鱼幽门盲囊中提取蛋白酶对鳕鱼鱼排进行酶解[3]，都获得了很好的效果。利用从动物废弃内脏中提取的蛋白酶对其他低值水产品或水产加工副产物进行酶解，不仅降低了因购买蛋白酶而带来的生产成本，而且做到了对多种水产蛋白资源的综合利用，是水产蛋白酶解利用的研究方向之一。水产蛋白资源酶解之前的处理还需要进一步研究，并非所有的水产资源都适合作为水产蛋白酶解的对象，富脂鱼类并不适合作为蛋白酶解的对象，因为它的含脂量高，去除脂肪比较麻烦、需要较高的代价，而且酶解产物极易因为脂质过氧化而影响其品质[26]。然而，水产蛋白资源中有很多都是富含脂肪的，因此，如何在进行蛋白酶解之前或酶解之后分离出脂肪，做到水产资源中蛋白质与脂肪的综合利用将是今后水产蛋白资源酶解利用的一个重要研究课题。2002年，Gildberg等对鳕鱼加工副产物进行酶解研究，在获得酶解液的同时，对酶解之后产生的残渣，主要是骨头进行了提取胶原蛋白的研究[6]，Gildberg等的工作为今后对含骨质水产蛋白资源的综合利用提供了一种全新的思路。蛋白资源的酶解是水相酶解，酶解产物通常以液体的形式存在，因此，必须将酶解液进行干燥处理，转变为固体粉末以利于储藏、包装、运输及应用。喷雾干燥是生产中常用的一种用于液体干燥的方法，2002年，Abdul-Hamid等对黑罗非鱼酶解产物进行了喷雾干燥条件对酶解产物营养品质影响的研究，发现较高的干燥温度造成了酶解产品氨基酸总量的降低，对酶解产物的营养价值造成了破坏[27]。冷冻干燥法是另一种将液体产物转变成固体粉末的方法，优点在于能保证产品的生物活性及营养价值不被改变，不过冷冻干燥法将导致生产成本的提高。 5.2酶解产物苦味的去除和酶解液脱色 蛋白质酶解产物普遍存在苦味。Murry和Baker于1952年第一次描述了蛋白质酶解产物苦味，此后，科学家们对蛋白质酶解产物苦味产生的原因及酶解产物中的苦味成分进行了广泛而深入的研究，取得了重大的成就。认为蛋白质酶解产物中的苦味主要是由苦味肽而不是由游离氨基酸引起的，苦味肽中的氨基酸残基大多是含有非极性的脂肪烃或芳香环侧链即疏水性氨基酸残基(Val、Ile、Phe、Trp、Leu和Tyr)，而且当疏水氨基酸位于肽链内部时苦味值较大，位于肽链C或N端的时候苦味值较低。在酶解过程中，由于蛋白酶的作用，原来包藏于蛋白质内部的疏水氨基酸残基暴露了出来，经过蛋白酶的酶切作用，含有较多疏水氨基酸残基的肽段被释放出来，从而使酶解产物产生了苦味[16]。目前，苦味肽是将蛋白质酶解产物应用于人类消费品的主要障碍。一般采用选择性分离、塑蛋白反应(plasteinreaction)、掩蔽法和外肽酶的应用四种方法来减少或掩蔽蛋白酶解产物的苦味[16]。酶解产物苦味值的大小与酶解所用蛋白酶的种类及水解度的大小都有关系，蛋白酶酶切作用方式及酶切作用位点的不同，酶解产物苦味值具有较大的差异，如Alcalase的酶解位点是疏水性氨基酸的羰基侧肽键，酶解产生的肽中疏水氨基酸位于肽的两端，苦味值较小。酶解产物水解度的大小对其苦味值也有较大影响，水解度的增加导致了酶解产物的苦味值的增大，随着水解度的进一步增大，苦味肽被酶切成为两端为疏水氨基酸残基的小肽甚至被降解成为游离氨基酸，因此酶解产物的苦味值随着水解度的进一步增大而降低[7][16]。Flavourzyme是一种蛋白酶/肽酶复合物，含有内切蛋白酶和外切蛋白酶两种活力，用于酶解可获得较高的水解度且产物具有较好的风味[7]，由于其具有外切蛋白酶活力，Flavourzyme还可用于酶解苦味的脱除。蛋白质资源经酶解后，酶解液一般都带有深浅不一的黄色，随着水解度的增大，酶解液颜色液逐渐变深。如此浓重的颜色不利于酶解液的应用，很多研究通过活性炭[28,29]、海藻糖[29]等对酶解液进行脱色，如刘惠宾等应用活性炭对鳀鱼酶解液的脱色进行了研究，结果表明在适宜的条件下活性炭对酶解液的脱色效果显著，然而，利用活性炭对酶解液进行脱色会导致酶解液营养成分的损失，即使在最适脱色条件下，氨基酸的损失率仍高达3.5%～5.0%[28]。#p#分页标题#e# 5.3酶解产物生理活性作用的研究，功能肽的分离纯化 近年来，蛋白质酶解产物的生物活性作用研究正受到人们越来越多的重视，许多的研究都证明了水产蛋白资源酶解产物具有一些生物活性成分，如抗氧化作用[1][3][21]、血管紧张素转化酶Ⅰ抑制作用[30,31]等。目前国内外的研究大都停留在证明蛋白质酶解液具有某一生物活性作用成分，从酶解液中分离出具有特定生物活性的多肽的研究很少，仅韩国Kim等学者报道了从水产蛋白资源中分离出了具有抗氧化作用的六肽[1]，ACEⅠ抑制作用的三肽[22]等。而且，研究的生理活性作用相对仅集中于抗氧化作用和ACEⅠ抑制作用。今后的研究应以证明更多的水产蛋白资源酶解产物具有生物活性作用；研究酶解产物是否具有更多的生理活性作用如肿瘤抑制作用、抗病毒、抗菌、抗心血管疾病、促进生长、提高机体免疫力等；从酶解产物中分离纯化出具有特定生理活性的多肽等方向以满足酶解液在功能食品和药品等领域中应用的需求。 6结语 我国水产业发展很快，水产品总产量从1990年开始一直处于世界首位并遥遥领先于其他水产大国，但水产品加工业相对滞后，与其他渔业大国如日本、挪威等国相比相差甚远。我国水产品加工多为初级产品，精、深加工产品少，特别是大宗低值水产品及水产加工副产物综合利用水平较低，我国的水产品在国际市场上的竞争力较差。目前，我国急需开展水产蛋白资源尤其是大宗低值水产品及水产加工副产物的高值化综合利用研究，通过蛋白质的酶水解开发出以水产蛋白资源为原料的高新技术产品，增强我国水产品在国际市场上的竞争力。
