基因检测范文1
一 乙型肝炎病毒dna(hbv-dna)测定
乙型肝炎是由乙肝病毒引起的以肝脏损害为主要临床特征的急、慢性传染病，严重者可发展成慢性肝炎、肝硬化和肝癌。在我国，乙肝是危害人类健康的一种主要传染病。
【参考值】
阴性 (taqman荧光定量pcr技术)
【临床意义】
1.hbv-dna是乙型肝炎病毒感染的直接证据，是hbv有活性复制能力及具传染性的确切标志。
2.可定量检测hbv-dna含量，为临床病情判断、疗效观察提供信息。
3.hbv-dna的出现先于其他血清学指标(如hbsag)，可早期诊断hbv感染。
4.正常人hbv-dna为阴性。当hbv-dna为101～104拷贝/ml时，表明病毒复制水平低，传染性较弱；而当 hbv-dna>104拷贝/ml时，表明病毒复制水平高，传染性强。
5.hbv-dna含量测定可为临床药物选择提供依据。
【注意事项】
1.标本可用血清或血浆，避免肝素抗凝，避免反复冻融。
2.标本室温放置不超过4小时。
3.溶血、高胆红素标本影响检测结果。
二 其他病毒dna测定
(一)人瘤病毒dna(hpv-dna)检查
人瘤病毒是一种小的双链dna病毒，根据核酸相关性分型已发现70余型。该病毒可以感染人的皮肤和黏摸上皮细胞，诱发细胞增生，产生瘤样病变。
【参考值】
阴性 (多重核酸荧光定量pcr技术)
【临床意义】
1.hpv难以用传统的病毒培养及血清学技术检测，目前主要采用分子生物技术检测hpv-dna，灵敏度高。
2.可对尿道、阴道、宫颈脱落细胞进行人瘤病毒的检测及分型，判断体内hpv感染状况。
3.hpv 6和11型与尖锐湿疣、喉头鳞状上皮状瘤发生有关；hpv 16、18、31、32型等与宫颈癌发生相关。因此，可用于对hpv高危亚型的诊断，对尖锐湿疣、宫颈癌等疾病的诊断与筛查具有重要意义。
4.hpv-dna检测可用于考核疗效与预后。
【注意事项】
1.用无菌拭子取尿道、阴道、宫颈分泌物于无菌试管或无菌瓶中。
2.标本采集应严格按无菌操作，避免污染。并及时送检。
(二)人类巨细胞病毒dna(hcmv-dna)检查
hcmv是疱疹病毒科成员，人类普遍易感，多为隐性或潜伏感染。在免疫功能低下、缺陷或抑制情况下，可发生成人hcmv感染，常呈弥漫性病变，严重者甚至死亡。
【参考值】
阴性 (荧光探针杂交pcr技术)
【临床意义】
1.用于临床hcmv感染的快速诊断。
2.用于临床免疫抑制治疗过程中体内hcmv感染的快速诊断与疗效监测。获得性免疫缺陷综合征等患者hcmv感染的诊断与疗效监测。
3.pcr技术检测hcmv的敏感性高，且hcmv-dna的出现早于临床症状或血清学标记物的出现，可早期诊断 hcmv感染。
4.妊娠早期感染hcmv可引起胎儿先天畸形，产前检测hcmv-dna有利于优生优育。
5.连续监测巨细胞病毒的含量变化可了解病毒的复制状况，从而为疾病的早期诊断与药物疗效提供直接的病原学依据。
【注意事项】
采用edta抗凝全血或脑脊液标本，采集后及时送检。
(三)单纯疱疹病毒dna(simplex herpes virus， hsv-dna)
单纯疱疹病毒是一种有囊膜的双股dna病毒，分为i型和ii型。近年来，hsv是性传播疾病、病毒性脑炎等疾病的重要病原体。
【参考值】
阴性 (荧光探针pcr技术)
【临床意义】
1.用于检测人血清样本或体液样本中的单纯疱疹病毒并可同时分型，辅助诊断hsv感染性疾病。
2.hsv i型感染主要引起口唇疱疹、疱疹性结膜炎、脑炎和皮肤性疱疹，hsv ii型主要引起生殖器疱疹， hsv-dna检测可辅助诊断上述疾病，并可用于考核疗效与预后。
【注意事项】
1.血清用无菌注射针头抽取静脉血2ml于无菌肝功管中。
2.分泌物用无菌棉拭子采集标本，女性取宫颈或阴道分泌物，男性取或前列腺液，将取样后的棉拭子放入无菌试管或无菌瓶中。
3.脑脊液抽取脑脊液于无菌玻璃瓶中。
(四)eb病毒dna(eb virus，ebv-dna)
ebv属于丫疱疹病毒科，主要经涎液传播，pcr技术可灵敏地检测出标本中的ebv-dna，满足临床诊断、治疗需要。
【参考值】
阴性 (荧光探针杂交pcr技术)
【临床意义】
1.可快速检测血液、脑脊液、组织、尿液中的eb病毒，为eb病毒感染提供直接证据。
2.eb病毒临床上与鼻咽癌传染性单核细胞增多症、霍奇金病等的发病密切相关。
【注意事项】
1.检测标本可采用edta抗凝全血、脑脊液、咽拭子、尿液、病变组织等。
2.标本采集时严格按无菌操作，并及时送检。
三 rna病毒测定
丙型肝炎病毒rna(hcv-rna)检测
丙型肝炎病毒是一种单链正股rna病毒，引起丙型病毒性肝炎。丙型病毒性肝炎多因输血或血制品而引起，在输血者中还存在无症状的hcv携带者。
【参考值】
阴性(rt-pcr，荧光定量pcr技术)
【临床意义】
1.有助于hcv感染的早期诊断。
2.hcv-rna阳性提示hcv复制活跃，传染性强。
3.hcv-rna转阴提示hcv复制受抑，预后较好。
4.连续观察hcv-rna，结合抗-hcv的动态变化，可作为丙肝的预后判断和干扰素等药物疗效的评价指标。
【注意事项】
1.标本可用血清或血浆，用无菌注射针头抽取静脉血2～3ml于无菌肝功管或edta抗凝管中送检。避免肝素抗凝，避免反复冻融。
2.标本室温放置不超过4小时。
3.溶血、高胆红素标本影响检测结果。
参 考 文 献
基因检测范文2
这让人们对利用基因检测来有效预防疾病（尤其是癌症）投入了更多的期待。
2015年1月，美国癌症协会报告称，美国过去20年癌症死亡率下降，至少有150万人躲过了死神的召唤。美国癌症协会将癌症死亡率下降归结于吸烟人口减少、癌症预防、早期癌症筛查和治疗技术的进步等因素。
而基因检测作为针对癌症防治的分子学方法越来越被人们接受。在美国，每年有四五百万人参加基因检测。
据生物芯片上海国家工程研究中心北方基地统计，随着中国人消费能力和健康保健意识的不断增强，越来越多的人将认识到基因检测的重要性，预计每年基因检测量至少在300万人次以上。
一个人一生只需做一次
癌症是最常见的基因疾病，所有癌症的发生，都源自DNA序列的异常。这些DNA序列的异常可能从父母中遗传而来，也可能来自于体内外环境造成的突变，或者两者兼具。
“和一般的体检不同，通过基因检测来预防癌症，一个人一生只需要做一次就够了。因为自身所携带的基因是从父母那里遗传下来，所以这些基因不论你从什么时候做，都是一成不变的。” 美国北岸大学健康中心副院长、个性化肿瘤治疗项目主任、复旦大学公共卫生学院遗传转化和健康干预中心主任徐剑锋对《t望东方周刊》说。
个性化的癌症筛查检测也并非是越早越好。徐剑锋说，“我们一般建议35岁以后的成人可以考虑，新生儿并没有那么紧迫。”
2015年7月，美国人类遗传学会（ASHG）了儿童和青少年基因检测声明。报告的第一作者、犹他大学的Jeffrey Botkin教授表示：“我们只掌握了有限的数据来说明基因检测是如何影响儿童和他们的家庭，所以我们建议，除非通过基因检测数据能够及时获得医疗辅助，否则，基因检测应推迟到孩子们成年后再进行。”
“癌症筛查作为三级预防的重要部分，是降低发病率、死亡率以及提高生活质量的有效方法，但是按照目前一刀切的标准筛查方案，会导致低风险个体的过度筛查。”复旦大学健康传播研究所所长傅华说。
在美国，有专门的获得政府认证执照的基因医学咨询师，他们也属于医疗从业人员。患者是否该做某项筛检，以及筛检结果出来之后是否该进行治疗，都由他们提出建议，进而由咨询师和临床医师互相配合开展基因检测。
如何评估遗传风险
在基因技术之前，家族史常用来作为遗传风险评估的重要指标。
但是受家族大小、家族成员间的联系程度等诸多因素影响，仅仅依靠这个指标难以确定遗传风险。也就是说，没有家族史并不意味着没有遗传风险。比如，一个人的家族没有患癌症的历史，但是他却得了癌症。家族史虽然反映了遗传因素，但是这种间接测量遗传风险的方法偏差较大。
“因此我们需要一个更准确、更直接可靠的方法来评估癌症遗传风险。” 美国北岸大学健康中心教授Charles Brendler说，相比之下，自己的DNA所反映的遗传分数更加可靠。“现有的医学证据表明，遗传分数应用于癌症风险评估的准确性和可靠性完全优于家族史的评价。”
科学家们目前已经鉴定出几百个与常见癌症风险相关的位点，将其进行组合，计算出每种癌症的遗传分数。
“对于每一种癌症，每个人都可以获得一个特定的遗传分数。这些遗传分数能够锁定你得哪种癌症的风险比较高。”徐剑锋解释说。
除此以外，科学家们已经鉴定出200多个致癌基因，几乎囊括大多数常见癌症。如果在这些基因中发现一个致病性突变位点，那么患一种或者几种类型癌症的风险就可能较高。
总而言之，个性化癌症筛查就是结合遗传分数、高外显率的致癌基因，以及家族病史，提供全面的遗传风险评估。
“预防死亡”
“基因检测和个性化癌症筛查的重点是预防癌症造成的过早死亡。”徐剑锋说，对于乳腺癌、前列腺癌以及大肠癌而言，早发现意味着90%患者可以生存5年以上。
而对于生存率低的癌症来说，高危人群进行癌症筛查也是有用的。虽然基因无法改变，但是获知自己的患癌风险意味着早有准备。知道自己遗传癌症的发病风险高低，以及是否带有目前已知的致癌基因突变等，可以选择性地设计癌症筛查的起始年龄、筛查方法、筛查频率甚至选择预防性手术等预防措施。
比如，美国演员安吉丽娜・朱莉为了预防乳腺癌和卵巢癌，先后进行了乳腺和卵巢摘除手术。“朱莉身上不仅有乳腺癌、卵巢癌的家族史，还携带有BRCA1这种基因突变，她患乳腺癌和卵巢癌的风险比一般人高很多。”徐剑锋说。
2014年2月国家食药监管总局、国家卫计委联合为了规范行业发展，叫停了基因测序项目。2014年12月和2015年1月，医政医管局和妇幼健康服务司先后下达通知，基因测序重新被卫计委“再开闸”。 除此以外，2015年6月8日，发改委《国家发展改革委关于实施新兴产业重大工程包的通知》，其中提到要重点发展基因检测等新型医疗技术，并将在3年时间内建设30个基因检测技术应用示范中心。
基因检测范文3
我已经生育了一个聋儿了，第二胎会不会还是聋儿？
我和丈夫都是聋哑人，我们能不能生育一个健康的孩子呢？
为什么别人打庆大霉素没事，我只打了一针就耳聋了呢？
……
上述问题虽各不相同，但答案却是相同的，都是“耳聋基因”在起作用！耳聋基因是什么东西？是不是有耳聋基因的人就会耳聋？怎么才能知道自己有没有耳聋基因呢？有耳聋基因的人该怎么办？听听专家的说法。
耳聋是临床上最常见的遗传病之一。在我国，听力语言残疾者甚众，并以每年新生3万聋儿的速度增长。上海市新华医院完成的一项研究表明：上海平均每1000个新生儿中就有2名听力障碍儿童，其中一半与遗传因素有关。出生时听力正常，但在儿童或青少年期逐渐出现听力障碍者，也有相当部分与耳聋易感基因有关。
目前，与耳聋有关的基因主要有GJB2基因、线粒体A1555G突变基因等。其中，GJB2基因突变与迟发性或进行性听力减退有关；线粒体A1555G突变基因则与某些药物性耳聋（出生时无听力障碍，但在接触庆大霉素、链霉素等氨基糖苷类药物后出现严重耳聋）的发生有关。此类患者的姐妹、母亲、姥姥等在内的所有母系成员都不能使用氨基糖苷类药物。
哪些人需要做耳聋基因诊断？
在下列情况下，人们可进行耳聋遗传咨询获得帮助：①正常夫妇生了一个聋儿，询问再发风险者；②有耳聋家族遗传史，担心下一代会患此遗传病；③男女双方均为聋哑人或其中一人为聋哑人，需要给予婚配指导或生育指导；④家族中出现因为氨基糖苷类药物致聋或者其他因素致聋患者时，需要指导预防其他成员再发耳聋。
耳聋基因诊断怎么做？
耳聋基因诊断是通过提取并检测患者血液中的DNA，判断其耳聋基因是否突变致病。随后，专科医生可以对这些具有耳聋基因的人进行耳聋预防和生育指导。比如，有耳聋基因者若在择偶时，能避免选择与自己具有相同耳聋基因的人，就可以有效降低生育聋儿的风险率；具有耳聋线粒体突变基因者，若能避免使用耳毒性药物，就能最大限度避免药物性耳聋的发生；已经育有一个常染色体隐性遗传基因突变聋儿的听力正常的夫妻，因仍有25%的可能性再次生育聋儿，必须接受耳聋基因诊断，以明确夫妻双方的耳聋基因携带方式，并通过进一步的产前诊断明确胎儿的基因携带方式，降低再生聋儿的风险。
目前，我院耳鼻咽喉－头颈外科已开设针对耳聋儿童及青少年的耳聋遗传门诊，并进行基因检测工作，以增强人们对耳聋遗传病的关注。
此检查的基本流程如下：
1． 电话预约。
2． 按约定时间到耳鼻喉科门诊，进行遗传咨询。
基因检测范文4
关键词：农作物；转基因；检测
1转基因农作物发展的基本情况
农作物转基因技术使农作物获得自身不具有的抗除草剂、抗病虫害、耐盐碱、富营养、抗干旱、高产量、抗重金属等特性[1]，该技术自问世以来取得了飞速的发展。1988年M.A.W.Hinchee等[2]和D.E.McCabe等[3]率先获得转基因大豆植株，标志着大豆转基因研究的成功。转基因大豆商业化自1994年开始，截止到2009年，大豆已成为世界上种植面积最大的转基因作物。自C.James[4]首次利用农杆菌介导玉米转化成功以来，由于抗虫、抗除草剂玉米较好的性状表现，在美国等国家获得较大面积的推广，并为相关种子企业带来丰厚的利润回报，迄今玉米已经成为最成功的商业化转基因农作物。全球转基因植物的种植面积由1996年的260万hm2迅速增至2014年的1.815亿hm2[5]。目前，全球主要的商业化转基因作物大约有25种，其中大豆种植面积约占全球转基因种植作物面积的47％[6]，其次是玉米，约占32％，紧跟其后的是棉花和油菜，分别占比15％和5％。
2我国农作物转基因现状
全球转基因农作物商业化种植已有20余年。我国农作物转基因技术发展也很快，到20世纪90年代中期，我国已掌握自主研究的转基因抗虫棉育种技术，并拥有相关专利，打破了国外在转基因技术上的垄断地位。自国家“十二五”规划转基因重大专项实施以来，随着技术和设备的不断更新，我国科学家在玉米、水稻等作物学领域进行了大量的研究，特别是转基因水稻方面的研究，走在世界前列，在许多方面取得较理想的发展成果。2009年12月，农业部批准了2个抗虫转基因水稻品种（华恢1号、Bt汕优63）和1个转植酸酶基因玉米品种的安全证书。
3转基因检测技术是转基因农作物有序发展的保障
随着转基因作物在全球范围内种植面积的日益扩大，人们对转基因安全性的关注及担忧日益增加[7]。我国对农作物转基因监管严格，行政执法部门对农作物转基因的监管，应以检测为技术依据来加大执法力度，防范非法转基因扩散对我国农业生产及食品加工行业造成危害。另外，有关转基因知识产权保护中，对于侵权的认定，也需要通过检测来确认。因此，当前形势下，加强农作物转基因检测，是确保我国农业安全、维护法律尊严的要求。加快大批量农作物种子盲样转基因检测技术研究，已成为转基因农作物商业化推广进程的重要内容。
4农作物转基因成分的检测方法
本文综述的农作物转基因检测方法主要有3类：第1类方法在市场监管检测中最为常用，是以外源基因的特定DNA序列为对象的检测技术；第2类是蛋白质检测技术；第3类是红外检测转基因产品化学性质及空间构型。
4.1基于DNA序列的检测方法
4.1.1PCR检测方法依据其检测对象不同分为4类：元件特异性PCR[7]、基因特异性PCR[8]、构建特异性PCR[9]、转化体特异性PCR[10]。通过PCR技术检测转基因转化载体携带的启动子、标记基因、终止子等特定序列，判断其是否为转基因作物。该方法特异性较好、效率较高、费用低，是目前我国农业转基因监管部门进行转基因监管检测的主要方法，目前已此类检测标准逾50项。该方法通过普通PCR或实时荧光定量PCR对转基因作物通用元件进行检测，是一种较快速、高效的方法，但缺陷是目前通量较小、周期较长，容易出现假阳性。4.1.2基因芯片法基因芯片法又称为DNA微探针阵列法，其实质就是高度集成化的反向斑点杂交技术，通过将外源基因的特异性片断制成检测芯片，与待测样本的DNA进行杂交，反应结果扫描后，通过计算机软件分析，来判断出待测样品是否为转基因产品[11]。该方法通量高，但是试验过程繁琐，尤其是费用很高，对实验设备要求高，可普及性较低。
4.2基于表达产物蛋白质的检测方法
以抗体、抗原为基础的免疫学蛋白质检测方法[12]，通过定性、定量外源基因表达产生的蛋白质来判断作物是否为转基因产品。外源表达蛋白的检测方法有3种：生化反应检测法；免疫学检测法，主要有Western杂交、ELISA法及免疫沉淀法；外源表达蛋白生物学活性的检测。外源表达蛋白的检测是转基因作物检测及安全性评价最有效的方法之一，但此种方法只针对某一个转化事件，需要采取逐个排除的方法来达到检测目的，繁琐、成本高，不适于大批量盲样检测。此外还要考虑转基因后基因表达沉默的问题，易出现漏检。4.2.1蛋白印迹法该方法利用特异性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白样品着色，通过着色的位置和着色深度，来获知特定蛋白质在目标样品中的表达情况，再通过电泳图谱分析，可定性及定量目标蛋白。4.2.2ELISA法阳性表达蛋白的抗体与被检测样品中的转基因蛋白结合，再与酶标抗体或酶标二抗结合，加入底物后通过酶促反应形成有色物质，根据颜色深浅或酶标仪检测结果进行判断。4.2.3试纸条法所谓的试纸条法，就是利用外源表达蛋白特异结合的抗体与显色剂结合后被固定在试纸条内，试纸条浸入含有外源蛋白的植物组织液中，当特异抗体与外源蛋白结合时，会呈现出特定的颜色，从而进行判断。目前，一张试纸条只能检测一种外源基因，而农作物种子尤其是玉米样品的盲样检测，可能会多到20多种转化事件，而且大部分转化事件的试纸条还没有研发成功，因此，此类方法更适合转基因科学研究中已知基因的阳性检测，还不适宜于市场监管中的大批量盲样检测。4.2.4蛋白芯片法蛋白芯片法与基因芯片法原理类似，可以定性定量检测目标蛋白。用不同的探针阵列测定外源基因的表达产物，弥补了基因芯片检测技术的不足。该技术对设备和技术要求较高，不具备普遍性。
4.3利用红外线检测转基因产品
基因检测范文5
【关键词】转基因食品；检测技术；进展
随着现代科技的快速发展，以基因工程为代表的现代生物技术也取得了令人注目的成绩，特别是与人们生活密切相关的转基因食品，更是得到受到世界范围的广泛关注。自1996年至2005年，全球范围内转基因作物的种植面积在10年内，均以2位数速度，逐年递增。转基因技术的快速发展，一方面推动了生产力的快速发展；另一方面就转基因食品的安全问题，也一直存在着争议。转基因技术是否会对人体产生不良反应，以及它对生态环境是否会产生负面影响，科学界一直都争论不休。
一、外源蛋白质检测法
（1）蛋白质印迹法。这种检测法主要是依据抗体抗原的差异性与特异性，并且与检测多样化复杂样品中某种蛋白的方法相结合的一种检测方法。蛋白质印迹法是将靶蛋白特异性的非标记性抗体与靶蛋白中的抗原决定簇结合，然后再将蛋白质125I-蛋白A的免疫球蛋白抗体检测已结合上去的抗体。但是蛋白质印迹法并不适用于定量分析，因为考虑到成本问题，以及操作难度问题，也不适用于高通量筛选检测。（2）ELISA。ELISA检测是把抗体与抗原的反应特异性与酶对底物的高效催化作用有机的结合在一起，依据酶作用于底物之后所产生的显色反应来对转基因成分进行鉴别。这种检测方法具有方便、快捷、成本低的特点，存在的问题有：一是所导入的蛋白质并不是在植物的所有组织中均有表达；二是复杂基质对检测结果构成干扰；三是转基因食品在加工的过程中，部分蛋白质可能会发生降解反应，所以ELISA检测，仅适用于没有加工过的原材料。（3）免疫试纸条法。与蛋白质印迹法的主要区别是，免疫试纸条法是以硝化纤维来代替聚苯乙烯反应板为固相载体来进行的。检测结果在较短的时间内就能够得出，通常只需要5～10分钟，主要问题是检测的灵敏度不高，且一种免疫试纸条仅能为一种目的蛋白质提高检测，不能对食品具体的转基因品系加以区分。
二、核酸水平检验法
（1）核酸印记法。具体操作是将被检测样品的DNA固定在尼龙膜上，再用带有标记的核酸探针进行杂交，最后通过对标记探针的信号进行检验来确定样品中是否含有转基因DN段，这种检验方法的灵敏度是比较低的。（2）PCR检测法。这一检测方法主要是对目标序列进行扩增，再采取特殊方法对扩增产物进行检验。常见的PCR检测法有定性PCR、复合定性PCR、PCR-ELISA、竞争定量PCR。一是定性PCR。这种检测方法主要是对特异的DN段实施PCR扩增，然后将得到的扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离，再运用凝胶成像系统对分离状况进行观测，定性PCR的灵敏度非常高。二是复合定性PCR。把两对及其以上的引物放入PCR检测系统之中进行扩增。三是PCR-ELISA。将带有地高辛、生物素标记的引物放入PCR反应系统之中，对目标DNA的序列加以扩增，并且把PCR产生物与固相板上特异性探针相结合，同时放入抗地高辛，使底物产生变色反应，利用酶标仪测出相应的吸光值，再加入标样，描绘出标准曲线，最后利用这一曲线进行半定量分析。四是竞争定量PCR。浓度未知的待测DNA与已知浓度的内标DNA在同一个反应管内进行PCR扩增，并将产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，再对电泳所产生的分离产物中的待测DNA与内标DNA的产物条带密度进行相关的线性回归分析，从而得出两种DNA的浓度等值点，以此对待测的DNA浓度进行定量分析。
三、其他检测方法
随着国内外对食品安全问题的持续关注，转基因食品的检测技术在持续不断的更新与发展，检测的水平也不断提高。这里面的近红外波谱技术原本是对谷物进行温度、脂肪含量、淀粉含量以及蛋白质含量进行分析的一种常规办法，而近几年来，这一技术主要应用于对转基因作物的检测领域，它的优势在于检测过程中，不需要对被检测物进行处理，操作简便快捷，且能够实现自动化处理，主要问题是不能够对食品的混合物进行检测。食品企业更是为了使产品走出国门，打入国际市场，站在全球战略的层面上进行考虑，必须加大检测转基因食品的投入与研究。除了要在检测技术上不断更新，不断应用之外，还必须逐步健全我国的转基因食品安全监督运行机制，完善相关的法律制度，才能保证转基因食品检测向着高灵敏度、高品质、低成本的方向发展，进入一个良性环境的状态。
参 考 文 献
[1]王勇，陈定虎，张辉玲．分子生物学技术在转基因食品检测中的应用[J]．广东农业科学．2007（2）
[2]孟陆丽，程谦讳，张谦益．转基因产品检测方法及应用[J]．粮食与油脂．2006（4）
基因检测范文6
关键词：DHPLC技术；基因突变；检测
1 DttPLC技术原理
变性高效液相色谱(DHPLC)是一种高通量、自动化的基因突变检测技术。该技术已在医学、癌症、药物等研究领域开展应用，与SSCP和DNA直接测序等突变检测技术相比，DHPLC具有灵敏性更高，特异性更强，廉价省时等优点。
DHPLC技术的原理是基于未解链的和部分解链的双链DNA在部分失活条件下具有不同保留的性质。这种部分失活条件可以采取升高温度的手段获得。所有基因组DNA的单拷贝均可通过PCR反应大量扩增，杂合子个体的DNA经扩增产生异源双链，由于错配位点的氢键被破坏，因此在异源双链上形成“鼓泡”，导致它与纯合子个体的DNA扩增产物——完全匹配的同源双链的解链特征不同。在部分加热变性的条件下，异源双链DNA分子更易于解链形成Y形结构，与固定相的结合能力降低。当流动相中乙腈浓度梯度增大时，异源双链将先于同源双链被洗脱出来，带有突变序列的样品呈现出异源双链和同源双链混合物的峰形特点，而不含突变序列的样品则只有同源双链的峰形。据此可检测出含有单个碱基的置换、插入或缺失的异源双链片段，从而提供有无突变的信息。
2 DHPLC技术在突变基因诊断中的应用
基因突变是指基因组DNA分子在结构功能上发生碱基对组成或排列顺序的改变，主要包括碱基的替换和小片段的缺失或插入，它是导致基因型疾病的重要原因之一。基因突变在生物医学研究中，尤其是在基因型疾病诊断及病理研究中有着非常重要的作用。随着人类基因组整体测序计划的发展，探索基因突变的任务变得十分迫切。
随着人类基因组整体测序计划的发展，探索基因突变的任务变得十分迫切。DHPLC技术自最早被用于分析人Y染色体单核苷酸多态性位点(SNP)以进行人种进化的遗传性研究；此后还用于筛查致病基因突变位点、分析单核背酸多态性以及基因启动子CpG岛甲基化修饰改变等研究；因其灵敏性及准确度均较高，操作实现了半自动化，检测周期短、费用低，尤其适合于基因结构复杂而无突变热点或突变频率低于20％的单基因变异，以及多基因致病突变。
(1)散发性卵巢癌p53基因突变定位于17染色体的p53基因是目前研究得最广泛的抑癌基因，迄今发现的人类肿瘤的2500种基因突变中，p53蛋白的393个氨基酸就有280个位点存在突变，其直接的后果是导致氨基酸的改变，最终使p53蛋白失活，丧失抑癌作用。杜明和丰有吉，利用DHPLC来检测50例散发性卵巢癌p53基因外显子5，8的突变，18例突变都可以使用DHPLC的方法发现，没有假阳性和假阴性。说明DHPLC可以用于临床筛查基因突变，并且对于异质性肿瘤而言，DHPLC检测基因突变无疑是最可靠的。
(2)胃癌组织基因突变鲁狲、徐惠绵、任群等人利用DHPLC对39例胃癌组织及血清中p53基因突变进行检测，并测序验证。在他们的研究中p53基因的突变率为21％(8/39)；其中肠型胃癌突变率40％(6/15)明显高于弥漫型胃癌8.33％(2/24)(P<0.01)；发现既往未见报道突变3例。这充分说明了DHPLC是一项较好的检测胃癌组织中基因突变的筛查方法
(3)汉族人I型多囊肾致病基因突变张树忠等人，通过采用DHPLC技术检测汉族人常染色体显性多囊肾病(AD－PKD)I型致病基因PKDl的突变：以来源于19个ADPKD家系的67名成员血样标本的基因组DNA为模板，通过长链PCR和巢式PCR联合扩增的方法扩增PKDl全编码区，然后采用DHPLC方法进行初步筛查，将存在异常色谱图的扩增产物经核苷酸测序，确定突变的具体位点和类型，共检测出14个致病突变，包括10个错义突变、1个插入突变、1个缺失突变、2个无义突变。他们实验结果充分说明了DH－PLC方法可以作为更为有效筛查汉族人ADPKDPKDl突变位点的检测途径。
(4)乳腺癌BRCAl基因突变BRCAl基因为“乳腺癌1号基因”，位于17q21，有22个编码外显子。目前已经发现约40％～50％的遗传性乳腺癌和卵巢癌患者BRCAl基因发生突变。李丹等利用聚合酶链反应PCR扩增BRCAl基因，该扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，直接进行DH－PLC分析，从124例乳腺癌患者中共发现9种突变，确定了9种乳腺癌患者可能发生的突变类型，为今后临床应用DH－PLC对高危人群BRCAI基因进行早期基因检测提供了9个位点，所有DPHLC检测显示峰型异常的样品经测序证明均存在突变或者SHP，证明该技术阳性检测率为100％。且具有操作简单、快速、敏感、准确且经济等特点。
3 DHPLC技术与其他技术在突变基因诊断中的联合应用
目前在核酸分析领域与HPLC联用的检测手段有紫外(ultraviolet photometric detector，UV)、荧光(fluorescencedetector)、质谱(mass Spectrometry，MS)等。其中紫外检测器(UV)凭借其良好的通用性成为应用最为广泛的检测器，但灵敏度不高的弱点使其使用受到一定的限制。在核酸分析和一些突变扫描方法中有时需要更高的灵敏度，这时具有更高灵敏度和选择性的荧光检测器成为首选。但是荧光检测器要求使用荧光标记物，且通常使用的染料如吖啶黄、溴化乙锭是有毒物质。Scalano实验室开发出SYBR Green，染料不仅具有更好的灵敏度，而且使用更安全。激光诱导荧光是目前灵敏度最高的检测方法之一。Hecker等采用荧光标记PCR引物、激光诱导荧光方式进行检测，证明DH－PLC方法可以区别含量相差500倍的两个等位基因，这使多份样本的混合检测成为可能。同时荧光标记单链，使色谱图的解释变得更加容易。美国Transgenomie公司在WAVEOR核苷酸片段分析系统技术平台基础上，开发出一种后荧光检测技术。在所有分析条件不变的情况下，被检测的核酸片段经DHPLC分离之后在混合室中与荧光试剂混合，然后进行检测，不仅可以提高灵敏度上百倍，而且不需要昂贵的荧光标记引物。近年来电喷雾离子化一质谱(EIS－MS)作为一种重要的结构分析工具与IR－RP－HPLC联用也已应用于核酸分析领域，该联用技术不仅可以确证被分离的单链DNA的成分特性，还可以确证扩增的PCR产物的基因型。众所周知，在核酸的质谱分析中为了获得高置信度的分析结果，对分析物进行适当的脱盐和去除小分子量杂质是必不可少的，这也正是HPLC－MS的魅力所在，但质谱的高成本使该项技术较难推广使用，
