摘要：脱氧核酶（deoxyribozymes，DNAzymes）是一类具有催化活性的人造脱氧核糖核酸（DNA），因其在生物传感领域存在巨大潜力而受到广泛关注。这些功能性寡核苷酸不仅可以作为特异性的分子识别元件，还能直接通过本身的酶催化活性来报告或者传递信号。近年来，基于DNAzyme的生物传感技术在食品安全领域的研究和应用得到了迅速发展。本文重点关注了近三年来的文献资料，综述了DNAzyme的催化机制和生物传感策略以及它们在食品安全快速检测中的研究进展，并讨论了该生物传感技术在食品样品分析物检测中可能的未来趋势和发展方向。
关键词：脱氧核酶（DNAzymes）；生物传感；食品安全；检测技术；生物传感器
脱氧核酶（deoxyribozymes，DNAzymes）是一类特殊的功能性寡核苷酸，其依赖于特定的核酸二级构象来发挥酶催化活性，正作为高效的功能元件广泛应用于生物传感领域[1,2]。DNAzymes元件经过巧妙设计后，能够发挥分子识别、信号转导、信号放大等一种或多种功效，已形成了多种类型的智能生物传感策略[3]。近年来，DNAzymes生物传感在食品安全检测领域展现出了较好的应用前景，已引起众多研究者的广泛关注[1]。这些功能性寡核苷酸具有酶的特性，能够催化各种化学反应，包括对DNA和RNA底物的裂解、连接和磷酸化等。一些DNAzymes的催化活性高度依赖于特定分子的存在，如金属离子和蛋白质，由于这一特性，这些DNAzymes可以用于开发能够检测这些特定分子的生物传感器。许多DNAzymes显示出较好的目标选择性，已被证实能够有效区分目标物和其他类似物，这使得它们能够被开发成为具有高特异性的低成本检测方法。本文对DNAzyme生物传感主要原理和策略进行了归纳，对食品安全领域中DNAzyme生物传感技术的相关研究进行了综述，重点关注了近3年来DNAzyme在食品安全检测的常见应用，并讨论了这种生物传感技术在未来发展的趋势和值得探索的方向。
1.基于DNAzyme的生物传感策略
1.1催化性核酸和DNAzyme的来源
自然界赋予了核酸（包括DNA和RNA）能够折叠成复杂三维结构的特性，这也是核酸功能多样性和反应性的重要分子基础。催化性核酸的发现来自于20世纪80年代末西德尼•奥特曼（SidneyAltman）教授团队和托马斯•切赫（ThomasCech）教授团队关于“RNA具有催化活性”的开创性工作。这类具有催化活性的RNA分子被称为核酶（ribozymes），打破了“酶的化学本质都是蛋白质”的传统观念，奥特曼教授和切赫教授也因相关杰出贡献而分享了1989年诺贝尔化学奖[4]。在1994年，杰拉尔德•乔伊斯（GeraldJoyce）和罗纳德•布瑞克（RonaldBreaker）首次人工筛选出了具有催化活性的DNA分子，这是催化性核酸研究历史上的另一项重大突破[5]。相较于本质为RNA的核酶可利用酶活位点的核糖核苷酸2'羟基（2'-OH）作为亲核基团来发挥催化作用，DNA分子因脱氧核糖核苷酸不含2'羟基而更为化学稳定，也需要依靠更特定的活性中心和分子机制来催化化学反应。事实上，迄今为止自然界中尚未发现具有催化活性的DNA分子。但自1994年以来，研究人员已从人工合成的DNA文库中成功获得了大量具有催化活性的DNAzymes[3]。DNAzymes的筛选得益于指数富集的配体系统进化技术（SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)，该技术也被广泛用来体外筛选适配体、核酶等功能性核酸。虽然SELEX在过去一直是一个较复杂的过程，但多年来这类筛选方法已得到优化，使该过程更为高效[6]。一旦DNAzyme序列被鉴定出来，之后可以很方便地以低成本大量合成产品，这也使得基于DNAzyme的生物传感器成为商业用途的理想选择。
1.2基于DNAzyme活性中心构象调控的传感策略
DNAzyme的酶催化活性高度依赖其催化活性中心的三维构象。以“8-17DNAzyme”这种经典的RNA切割型脱氧核酶为例，其遵循酸碱催化机制，活性中心为DNA单链借助非常规的碱基配对而卷曲形成“假结”状结构，其中G13鸟嘌呤可充当“碱性基团”并通过去质子化作用激活核苷酸的2'羟基[2]。此外，其活性中心内含有二价金属离子结合口袋，而Pb2+、Mg2+或Mn2+等金属离子的结合能够辅助酸碱催化反应。常见的一类DNAzyme生物传感策略是利用输入信号来调控DNAzyme催化活性中心的构象变化，包括核酸链构象和酶辅助因子结合构象[3]。一些DNAzyme是按照兼具适配功能和催化活性的要求而被筛选获得，能够通过结合目标小分子或蛋白所产生别构效应来特异性激活催化活性，它们也因此被称为适体酶（aptazyme）或别构效应脱氧核酶（allostericdeoxyribozyme）。在更为通用的设计中，额外的核酸适配体或其他功能核酸都可通过碱基互补配对作用来阻止DNAzyme关键核酸链构象的形成，在输入信号后可通过适配体竞争反应或核酸链置换反应[7,8]来激活DNAzyme的催化活性中心。随后，响应信号的输出可很方便地由DNAzyme催化的RNA切割效果来实现（以RNA切割型DNAzyme为例），而被切割的RNA片段也可设计成下一步传感的启动端[9]。此外，由于金属离子是DNAzyme常见酶辅助因子，其金属离子依赖的催化活性使得DNAzyme很适合用于各种金属离子的检测[10]。
1.3G四联体型DNAzymes作为报告分子
G四联体（G-quadruplex）与血红素结合后可以形成一种模拟过氧化物酶的DNAzyme，而G四联体不像其他类型的DNAzyme那样序列特异，通常不必要经过精密的体外筛选过程来获得。其结构基础是，富含鸟嘌呤(G)的DNA可以通过Hoogsteen氢键形成G四分体环状平面，而两个或更多的G四分体在阳离子（尤其是钾）配位作用下，可通过π-π堆叠形成G四联体结构[11]。G四联体-血红素复合形成的类过氧化物酶DNAzyme应用广泛，在各种各样的测定中都能被用作比色式信号报告元件。此外，G-四联体也能与一些荧光染料（包括卟啉类、噻唑橙类、硫磺素类等）结合形成荧光式信号报告元件[12]。
2.DNAzyme生物传感器在食源性致病菌检测中的应用
据估计，全世界每年有数亿人因食用受污染的食物而患病，造成数十万人死亡，并在低收入和中等收入国家造成巨大的经济损失[13]。食源性疾病主要由致病性微生物引起，尤其是大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌等食源性致病菌。此外，随着耐药型食源性病原体的出现，抗生素耐药的食源性感染给食品安全和公共卫生造成巨大威胁，并进一步加重了经济社会发展的负担。针对食源性感染开发快速检测策略是至关重要的，大量基于DNAzyme的生物传感器已被成功应用于食源性致病菌快速检测。
2.1大肠杆菌检测
大肠杆菌作为最常见的食物污染物之一，基于DNAzyme的生物传感器也被较早地开发用于检测这种食源性致病菌。TohidF.Didar研究团队报道了一种食品包装上的DNAzyme生物传感器（图1），通过将能特异性检测大肠杆菌的荧光DNAzyme探针微阵列共价连接到一层薄的、灵活的、透明的环烯烃聚合物膜上，实现对食品大肠杆菌污染的实时监测[14]。当这种RNA切割型DNAzyme结合大肠杆菌菌体或粗裂解混合物中的目标蛋白时，会活化其催化活性中心的特定三维构象，进而切割荧光-淬灭DNA底物的单个核糖核苷酸位点，使得修饰有淬灭基团的片段分离以产生荧光信号恢复。这种“哨兵式”的食品包装能够在不同的pH条件下(pH=3~9)至少稳定14天，可以检测出肉类和苹果汁中浓度低至103CFU/mL的大肠杆菌。许文涛研究团队[15]建立一种基于磁珠、DNAzyme和光致发光三重信号放大的荧光传感器，用于解决食源性致病菌检测中灵敏度低的问题。在检测过程中，大肠杆菌O157:H7特异性RNA切割DNAzyme可以在结合目标蛋白后切割靶RNA，并诱导滚环扩增反应(rollingcircleamplification，RCA)，进而增强铜纳米簇发光效应。该生物传感器在10CFU/mL~103CFU/mL范围内具有良好的线性关系，检出限为1.57CFU/mL。
2.2沙门氏菌检测
沙门氏菌是肠杆菌科的一员，是一种革兰氏阴性菌。沙门氏菌是食源性疾病暴发的主要原因之一，在有症状的食物中毒感染中极为常见[16]。沙门氏菌的检测是防止其传播的关键，近年来多种DNAzyme生物传感器也被开发用于沙门氏菌检测。许文涛研究团队结合DNAzyme和一种超聚合酶链式反应(superpolymerasechainreaction，S-PCR)，构建了一种快速、通用的沙门氏菌视觉检测方法[17]。通过目标基因启动S-PCR扩增反应而释放暴露的G四联体（G-quadruplex），与血红素结合后能形成DNAzyme功能结构而发挥类过氧化物酶活性，进而催化底物发生显色反应。该方法可在基因组提取样本中可检出浓度低至1.5拷贝/微升（copies/μL）的沙门氏菌基因组，肉眼即能观察到这种颜色变化。G四联体-血红素结合形成DNAzyme在比色式生物传感器中常充当酶催化型信号放大元件，也在一项利用TiO2纳米颗粒增强重组链置换扩增效率的沙门氏菌检测技术中发挥这类作用[18]。近期，黄加栋研究团队利用基于杂交链式反应(hybridizationchainreaction，HCR)自组装G四联体型DNAzyme介导等离子体耦合，建立了一种简便、快速的鼠伤寒沙门氏菌表面增强拉曼（Surface-enhancedRamanspectroscopy，SERS）检测策略[19]。此技术通过等温扩增自组装DNAzyme作为生物催化剂，将L-半胱氨酸氧化为半胱氨酸，进而实现SERS信号转导。该检测方法显示出较宽的线性范围(5~105CFU/mL)和较低的检测限(4CFU/mL，n=5)，其加标回收率为93.1~117%。
2.3金黄色葡萄球菌检测
金黄色葡萄球菌是一种广泛存在于食品中的重要致病菌，摄入被金黄色葡萄球菌污染的食物可以导致菌血症、肺炎，甚至死亡[20]。近期干宁研究团队开发了一种基于搅拌棒富集和DNAzyme辅助点击化学反应的超灵敏微流控免疫传感器，能实现对金黄色葡萄球菌的即时检测[21]。该方法利用4-巯基苯硼酸（4-mercaptophenylboronicacid）功能化搅拌棒富集细菌，继而将卵黄抗体(免疫球蛋白Y)和铜标记的聚多巴胺纳米颗粒与被捕获的菌体特异性结合。在酸性条件下能释放的二价铜离子，使得经炔基修饰的DNAzyme和经叠氮修饰的链霉亲和素-生物素复合物之间进行基于铜催化的叠氮-炔基环加成(Cu(I)-catalyzedazide-alkynecycloadditions，CuAAC)反应。最后，通过微流控芯片检测DNAzyme-链霉亲和素复合物来定量检测金黄色葡萄球菌。在最佳条件下，该免疫传感器对金黄色葡萄球菌的检测限为3CFU/mL，检测范围在10~2.5×104CFU/mL之间。
2.4副溶血性弧菌检测
副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐菌，是虾、鱼、蟹、贝类等海产品中常见的主要病原体之一，食用被副溶血性弧菌污染的食物可能导致人类胃肠道紊乱[22]。近年来已开发出一些DNAzyme生物传感器，能够及时、灵敏、准确地检测副溶血性弧菌。一种检测副溶血性弧菌的比色型适配体传感器已被报道[23]，其利用核酸适配体偶联磁性纳米颗粒捕获副溶血性弧菌，并因竞争作用而释放含有G四联体成分的cDNA，借助G四联体-血红素形成的DNAzyme催化过氧化物酶底物产生颜色信号。该检测方法在最佳条件下，线性范围为102~107CFU/mL，检出限可低至10CFU/mL，可被应用于污染三文鱼样品中副溶血性弧菌的检测。此外，张芳团队在等温扩增G四联体比色传感器中引入CRISPR技术，通过CRISPR/Cas12a特异性识别环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）产物而反式切割G四联体，进而阻断DNAzyme以及相应的类过氧化物酶活性的形成[24]。该级联方法被报道具有检出虾样品中6.1×102CFU/mL副溶血性弧菌的能力。干宁研究团队则将等温扩增生成G四联体的比色策略与微流控技术相结合，建立一种现场双模式快速检测方法，能够实现对副溶血弧菌的裸眼筛查和定量分析[25]。
2.5单核增生李斯特菌检测
单核增生李斯特菌是最常见的食源性致病菌之一，可以导致腹泻、败血症和脑膜炎[26]。其具有低温抗性，可以在低至0~4℃的冷藏温度下生长[27]，是冻肉、冰淇淋、即食食品等冷冻食品的重要污染风险。刘战民团队结合LAMP等温扩增和DNAzyme级联催化作用开发了一种原位信号放大电化学技术，用于无标记检测单增李斯特菌[28]。其阳性结果可通过颜色变化进行判读，并可通过电化学方法进一步定量分析，其检出限为6.8CFU/mL，对52.5~5.25×104CFU/mL的细菌具有良好的灵敏度。
3.DNAzyme生物传感器在真菌毒素检测中的应用
真菌毒素是真菌产生的有毒次生代谢物，会污染各种食物，包括干果、谷物和葡萄酒[29]。大量研究表明，许多真菌毒素具有致癌性、肝毒性、肾毒性和免疫毒性。考虑到其潜在的毒性作用，谷物中几种真菌毒素的最高可接受浓度已确立，如黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1，AFB1)为2μg/kg，赭曲霉毒素A(ochratoxinA，OTA)为5μg/kg，玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)为100μg/kg[30,31]。目前，真菌毒素监测的常规分析方法主要有高效液相色谱、气相色谱串联质谱和高效液相色谱串联质谱、薄层色谱、毛细管电泳等[32]。近年来研究者已经成功地设计了几种DNAzyme适配体生物传感器，用于对真菌毒素的快速检测。3.1黄曲霉毒素B1检测黄曲霉毒素是黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的强毒性次生代谢产物，其中以黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）毒性最强、分布最广，已被国际癌症研究机构列为1类致癌物[33]。陈晓青团队近期开发了一种基于适配体和G四联体型DNAzyme催化探针，配合基于磁性氧化多壁碳纳米管（magneticoxidizedmultiwallcarbonnanotubes，Fe3O4@oMWCNTs）的样品前处理技术，建立了食品样品中AFB1检测平台[34]。该探针在血红素和钾离子存在下能够高效催化底物发生颜色反应，而通过磁性氧化多壁碳纳米管的连续吸附和磁分离，可以有效地弱化过量血红素相关的高信号背景问题。该检测方法对AFB1具有较高的选择性和灵敏度，其检测限为0.02ng/mL。
3.2赭曲霉毒素A检测
赭曲霉毒素是由曲霉属、青霉属真菌产生的有毒次级代谢产物，其中以赭曲霉毒素A(ochratoxinA，OTA)毒性最大，具有致畸性、致癌性和致突变性，被归类为2B类致癌物[35]。近期，冯亮团队将金纳米团簇生长在由ZIF-8金属有机框架（metal-organicframeworks，MOFs）衍生的多孔碳上，形成纳米固相载体，并相继通过金硫键修饰和核酸杂交在纳米载体固化OTA特异性适配体和cDNA，这样的核酸杂交双链结构还对血红素起到“看门人”作用[36]。当OTA存在的情况下，双链杂交“看门人”结构被破坏，并裸露出大量G四联体结构，结合血红素后能原位形成DNAzyme。此“看门人”策略简化了DNAzyme封装过程，减少了非靶标响应性探针泄漏。由于DNAzyme具备电子传递功能和类过氧化物酶活性，该团队建立了一种双模式纸基分析装置，在1pg/mL~500ng/mL和50pg/mL~500ng/mL范围内，可实现对OTA的高灵敏电化学检测和可视化检测。
3.3玉米赤霉烯酮检测
玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是一种常见的真菌毒素，广泛存在于玉米、大麦、小麦等谷物中，其具有雌激素样分子结构，能扰乱生物体生殖激素平衡，引起生殖功能障碍[37]。王周平研究团队近期利用刺激响应型适配体功能化MOFs纳米材料和复合DNAzyme探针，建立了一种用于ZEN检测的高效比色传感器[38]。该传感器集合了ZEN特异性适配体的良好亲和力、MOFs的超高负载能力以及G四联体型DNAzyme优异的催化能力，对多种真菌毒素和常见食品成分的干扰具有良好的特异性，在最佳条件下，对ZEN的检测线性范围为0.01~100ng/mL,最低检出限为0.36pg/mL，能够有效应用于实际样品中ZEN的定量检测。
3.4真菌毒素多重检测
在当前食品安全领域，针对多种真菌毒素混合污染的多重检测仍是一个重要挑战。如图2所示，陈俊华研究团队基于催化发夹自组装（catalytichairpinassembly，CHA）和DNAzyme切割活性建立了真菌毒素检测传感系统[31]，在最佳条件下，对OTA、AFB1、ZEN的检出限分别为0.2pM、0.13pM和0.17pM，并具有较好的特异性和灵活性。该团队进而以OTA、AFB1、ZEN作为输入元件，以0和1编码真菌毒素，通过“AND-INHIBIT”、“INHIBIT-OR”、“OR-AND”和“OR-INHIBIT”逻辑运算，构建了多串联分子逻辑门。该分子逻辑门具有多种功能，为真菌毒素的多重检测提供了一种通用的传感策略。
4.DNAzyme生物传感器在食品中重金属检测的应用
由于很多情况下DNAzyme的催化活性高度依赖特定的金属离子，DNAzyme生物传感器很早就被用于金属离子的检测，特别是针对容易引起慢性中毒的铅（Pb）、汞（Hg）等重金属。水和土壤等环境中铅、汞污染往往容易富集到食品中，可对人体健康造成严重威胁，对其进行高效、高灵敏的检测至关重要。近年来，为了提高DNAzyme生物传感器检测重金属的灵敏度，研究人员的开发了多种信号放大方法来满足相应的实际检测需求。段忆翔团队结合DNAzyme介导的RNA切割策略和退火加速DNA杂交链式反应(annealing-acceleratedhybridizationchainreaction)，建立了针对Pb2+的无标记、无酶比色法检测方法[39]。DNAzyme的底物核酸链作为一种触发DNA，可以有效地启动杂交链式反应。然而，当Pb2+存在时，DNAzyme将底物核酸链切割而导致杂交链式反应效率显著下降，并最终引起胶体金纳米粒子的颜色变化。该方法对Pb2+的检测可在30分钟左右完成，肉眼可直接识别出显著的颜色变化。邓锐杰团队报道了一种无标签、双扩增的DNAzyme生物传感方法，用于铅污染的高灵敏“一锅法”检测[40]。该方法采用外切酶I介导的结构响应DNA切割来监测Pb2+辅助DNAzyme催化的无标记底物裂解过程，从而进一步放大响应信号。此方法可以检测低至0.12nM的Pb2+，检测范围为0.1nM至30nM，并能够准确检测自来水、牛奶和鱼肉中的Pb2+。针对DNAzyme易受环境中核酸酶消化以及生物稳定性不足等问题，研究人员通过将核酸底物和DNAzyme整合到单链序列中，并进行环化改造形成闭环的DNAzyme[41]。这种环状DNAzyme由于其稳定的分子内双链形成和封闭的结构对核酸酶消化具有优异的抗性，并可以在更宽的温度、盐浓度和pH范围内发挥切割活性。该研究将这种环状DNAzyme配合末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)生成G四联体，建立了一种用于Pb2+定量检测的无标记比色传感平台（图3），检出限为0.085nM；进一步引入酶切循环扩增以提高信号放大效率，可使传感器的检出限达到0.0015nM。近期，研究人员还报道了一种基于链置换扩增(stranddisplacementamplification，SDA)和杂交链式扩增(HCR)级联信号放大的DNAzyme荧光超灵敏传感器[42]，其对Pb2+的检测范围为16.8pM，在50pM到500nM范围内具有良好的线性关系，且具有良好的选择性。另有一种结合DNAzyme和CRISPR系统的高灵敏度铅离子检测方法也在近期被开发出来[43]，当铅离子被识别，其激活的DNAzyme会催化底物链断裂，导致单链DNA的释放，并与Cas蛋白/前导RNA结合形成功能复合物，进而激活CRISPR系统的反式切割活性以实现信号放大。
5.DNAzyme生物传感器在抗生素检测中的应用
抗生素具有良好的药代动力学特性，在人和动物的医疗领域已广泛应用多年。由于滥用抗生素治疗疾病和催促禽畜生长，存在于复杂环境和食品基质中的抗生素残留已对公众健康构成严重威胁[44]。因此，开发有效的方法，对食品样品中可能存在的抗生素残留进行准确、方便的检测，对其质量监测具有重要意义。
5.1氯霉素检测
氯霉素是一种广谱抗生素，作为一种低成本、高效的药物被广泛应用于食用动物的治疗。因此，微量的氯霉素可在肉类或牛奶中聚集，并可能通过食物链在人体内积聚，对人体健康造成潜在风险[45]。现有的氯霉素检测方法，如色谱、免疫学等，可能需要复杂的样品制备、昂贵的仪器和繁琐的检测程序[46]。李根喜研究团队将DNA/金属离子相互作用和银离子依赖DNAzyme介导的信号扩增相结合，建立了检测氯霉素的新方法[47]。当氯霉素被DNA适配体特异性识别后，DNA适配体中C-Ag+-C碱基错配形成的二级结构会发生改变，释放出预先捕获的Ag+。随后，游离的Ag+作为辅助因子可以激活Ag+依赖的DNAzyme，使其在电极表面进行底物DNA的快速切割，实现高效的信号放大。
5.2四环素检测
四环素类抗生素在畜牧业领域常被用于治疗细菌感染和促进动物生长，然而，四环素的滥用易导致其在许多动物性食品如牛奶、鸡蛋、蜂蜜和猪肉中残留，可通过食物链进一步进入人体，引起一些严重的疾病，如肝损伤、过敏反应、肠道菌群紊乱等[48]。此外，滥用四环素也可能促进细菌的耐药性，从而降低药物的治疗效果。吴远根研究团队提出了一种基于G四联体型DNAzyme的超灵敏比色生物传感器，用于四环素(tetracycline)、土霉素(oxytetracycline)、金霉素(chlortetracycline)和多西环素(doxycycline)等四环素类抗生素的高灵敏快速检测[49]。由于血红素和G四联体组成的DNAzyme具有类过氧化物酶催化活性，而四环素可以与血红素结合形成稳定的络合物，降低DNAzyme催化活性，使得显色反应受到抑制。该比色型生物传感器对四环素的检测限为3.1nM，在实际样品中对四环素的平均回收率为89%~99%。另有研究结合Mg2+依赖的DNAzyme和催化发夹组装(CHA)等温扩增技术，建立了乳品中四环素的无酶双扩增高灵敏检测方法[50]。通过四环素与特异性适配体竞争性结合，使得DNA1释放并与DNA2杂交形成DNAzyme结构，随后裂解底物而引发CHA反应，不断释放G四联体结构，在配合血红素形成DNAzyme催化后续的比色反应。在最佳条件下，该方法对四环素的检测范围在1pM~10nM之间，检出限为0.89pM，对四环素有较高的选择性。
5.3卡那霉素检测
卡那霉素是一种典型的氨基酸类抗生素，因其对革兰氏阴性菌具有较强的抑制作用而在畜牧业中被广泛应用。卡那霉素在人体内累积可引起听力损伤、肾功能紊乱等多种副作用。目前，在动物类食品中检测卡那霉素主要依靠高效液相色谱法、气相色谱法、酶联免疫吸附法、表面等离子体共振法等方法。但这些方法仍存在一些不足，如耗时、操作复杂、设备昂贵等，特别是检测生物样品中极低含量的卡那霉素[51]。唐盛团队报道了一种多重级联扩增DNAzyme比色式传感器，用于卡那霉素的超灵敏检测[52]。该方案通过两个卡那霉素适配体触发的竞争反应，使得Ni-Fe层状双氧化物(layereddoubleoxides，LDO)上形成G四联体和DNA发夹（hairpin）结构，进而依靠静电作用自组装成三维G4/LDO框架结构，形成一种具有增强型类过氧化物酶催化活性的新型DNAzyme，用于卡那霉素的比色法检测。在最佳实验条件下,该方法显示出高灵敏度,其检测范围在10fM至10nM之间(R2=0.992)，检测限为3fM(S/N=3)。蒋炳英团队开发了基于引物交换反应(primerexchangereaction，PER)信号放大技术和Mg2+依赖DNAzyme的无标记、高灵敏度的牛奶样品中卡那霉素荧光检测平台[53]。当卡那霉素与适配体结合，暴露了DNA发夹模板上的引物结合位点，随后引发PER反应，借助Bst-DNA聚合酶催化作用在恒温条件下自组装Mg2+依赖的DNAzyme结构。不断生成的大量DNAzymes在Mg2+辅助下能够切割发夹底物的rA位点，释放大量暴露的G四联体片段，后者在与有机染料硫黄素(thioflavinT)结合后会产生显著增强的荧光。该方法对卡那霉素的检出限为0.36nM，对卡那霉素和其他抗生素表现出良好的选择性。赖国松研究团队将核酸外切酶III催化的Zn2+依赖DNAzyme释放与DNAzyme驱动的链置换反应(SDR)相结合，建立了一种用于卡那霉素检测的新型比色生物传感器[54]。当卡那霉素与DNA发夹（hairpin）发生特异性识别反应时，含有DNAzyme结构的核酸链可以被外切酶III催化释放。随后DNAzyme能催化两个寡核苷酸发生连接反应并触发SDR反应，导致两种修饰有DNA连接子的金纳米颗粒发生聚集。该方法显示了5个数量级的宽线性范围，检测限可达8.1fg/mL，具有良好的选择性、重复性和可靠性。
6.DNAzyme生物传感器在农药检测中的应用
有机磷农药（organophosphoruspesticide，OPs）是一大类含有磷元素的有机化合物农药，由于其成本低、易合成、杀虫效率高，因而被广泛应用作杀虫剂和除草剂。然而，有机磷农药在各种环境(水、土壤和大气)中的残留对生态系统和食品安全构成了重大风险[55]。特别是OPs可以使乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)磷酸化，不可逆地抑制AChE活性，在造成中毒时可导致乙酰胆碱在神经系统、肌肉和腺体中积累，严重危害人体健康并可能造成致命后果[56]。当前检测OPs的气相色谱和气相色谱-质谱联用方法虽然具备高灵敏度和高特异性，但需要复杂和昂贵的设备、熟练的操作人员和较繁琐的前处理步骤，而传统酶抑制法对OPs的检测难以满足灵敏度方面的需求。为了克服这些缺点，近年来基于DNAzyme生物传感器已被开发用于超灵敏检测有机磷农药。基于核酸外切酶辅助的双信号级联扩增和DNAzyme自组装，研究人员构建了一种用于马拉硫磷超敏检测的无标记化学发光传感器[57]。该方案将G四联体/血红素形成的DNAzyme巧妙地编码到核酸发夹探针中，进而控制催化化学发光信号的输出。其所设计的双信号放大策略利用外切酶I和外切酶III，分别实现了目标物和次级目标物的循环利用，大大提高了适配体传感器的检测灵敏度。在最佳实验条件下，该DNAzyme传感器对马拉硫磷具有良好的线性响应能力，检出限为0.47pM，相对标准偏差为4.2~6.9%。焦必宁团队结合DNAzyme和CRISPR-Cas12a技术开发了高灵敏的酶抑制法有机磷农药荧光检测方法[58]。该方案设计了一种双酶级联反应来激活CRISPR-Cas12a系统，包括乙酰胆碱酯酶（Ache）介导的MnO2纳米片降解生成Mn2+和Mn2+激活DNAzyme切割活性。DNAzyme催化产生的短DNA链与前导crRNA杂交，从而激活CRISPR-Cas12a系统反式切割荧光-淬灭探针。在最优条件下，该方法对氧磷、敌敌畏和内吸磷的检出限分别为270、406和218pg/mL。得益于二氧化锰纳米片的优异性能和多级联酶促信号放大策略，此荧光分析方法在食品中有机磷农药的检测中具有巨大的潜力。
7.DNAzyme生物传感器在其他食品污染成分检测中的应用
7.1环境内分泌干扰物检测
双酚A(bisphenolA，BPA)是一种典型的环境内分泌干扰物，在工业上常用于环氧树脂和聚碳酸酯等高分子材料生产，容易在食品包装、饮料瓶、奶瓶等处存在残留[59]。双酚A在很低剂量下就会对人类健康产生不利影响，BPA的过量暴露可引起机体的生殖系统和免疫系统紊乱，也可能与某些类型的肿瘤相关[60]。可靠、高灵敏的双酚A检测方法对保护食品安全和人类健康具有重要意义，传统的BPA检测方法有高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法[61]。作为传统技术的替代方案，近年来陈俊华团队开发了基于DNAzyme生物传感的检测方法用于双酚A检测[62]。该方案采用抗BPA适配体作为特异性识别元件，通过将竞争反应激活了基于黏性末端介导链置换（toehold-mediatedstranddisplacement）的反应回路，并自组装形成Mg2+依赖的DNAzyme功能结构，进而切割荧光-淬灭探针来产生信号输出。该生物传感器具有较高的灵敏度，检测限为50fM，检测线性范围为100fM~1μM，在牛奶样品中BPA定量检测中显示的回收率为94%~106.4%。
7.2细菌内毒素检测
脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，也被称为内毒素，是所有革兰氏阴性细菌外膜的组成部分，是一种毒性极高的炎症刺激物，与发烧、腹泻和低血压等食源性疾病密切相关。目前，鲎试剂是分析LPS的常见方法，但它对pH值、温度以及其他干扰因素高度敏感。免疫分析法也被用于LPS的分析，但大多需要繁琐的操作步骤。近年来，基于DNAzyme光学和电化学传感器被开发用于LPS的快速检测。张娟团队设计并构建了一种腙化学（hydrazonechemistry）连接的DNAzyme，通过将DNAzyme设计为两个分别经过醛基和肼基修饰的片段，它们可以通过腙化学反应连接在一起，而LPS的存在可以阻抑此连接反应[63]。利用这一特性结合DNAzyme切割单链核酸的催化能力，构建了腙化学辅助DNAzyme对软饮料样品中LPS和5-羟甲基糠醛的检测方法。该团队近期还报道了DNAzyme发挥催化作用的同时会释放氢氧根离子的机制，设计了氢氧根离子释放介导的比色策略，并将此策略成功地用于LPS的快速检测[9]。该检测方法通过将DNAzyme设计为两个分别经过醛基和羟胺基修饰的片段，它们可以通过肟化学（oximechemistry）反应连接在一起，而LPS的存在可以阻抑此连接反应。利用这一特性配合DNAzyme氢氧根离子释放的机制，可简便地对LPS信号进行捕获、输出和放大，从而实现对LPS准确、灵敏的检测。
7.3放射性核素检测
放射性核素能够严重污染环境，通过在土壤、地下水和海水中的迁移和累积，最终可进入食物链和人体[64]。环境和食物链中的铀污染严重威胁公共安全和人类健康，摄入铀化合物可导致机体肾脏、肝脏、骨骼、肺和神经系统造成严重损伤。定量检测铀污染的常见方法有电感耦合等离子体质谱法(Inductivelycoupledplasmamassspectrometry，ICP-MS)、X射线荧光法和原子发射光谱法等，但存在仪器昂贵、样品前处理复杂等问题。邓锐杰研究团队报道了一种基于G四联体型DNAzyme的无标记比率型生物传感器，能够精确检测铀污染和生物吸附[65]。该方案通过UO22+激活DNAzyme的催化作用而剪切底物链，并利用分裂的两种G四联体探针来感应DNAzyme剪切反应。随后利用DNA双链染料（SYBRGreenI）和G四联体染料（N-methyl-mesoporphyrinIX）来测定DNAzyme探针的双链结构和G四联体结构，从而以比率法检测UO22+。归因于酶催化反应和荧光测定步骤的分解，该方法在较宽的温度范围内（18℃~41℃）都能稳定地检测UO22+，对UO22+和Hg2+、Mn2+、Cu2+、Cd2+、Pb2+、Co2+、Ni2+、Al3+等金属离子具有较高的选择性，并能定量且准确地检测水体和鱼类中的铀污染。
8.结语
本文综述了基于DNAzyme功能元件的生物传感设计策略，重点介绍了DNAzyme生物传感在食源性致病菌、真菌毒素、重金属离子、抗生素、有机磷农药等食品污染成分检测方面的最新进展。DNAzymes的催化活性依赖于核酸序列、三维构象以及相应的辅助因子，而其催化的化学反应包括RNA切割、DNA切割、DNA或RNA连接、DNA磷酸化以及基于G四联体的类过氧化物酶反应。在巧妙设计下，DNAzyme可以通过构象变化和级联反应完成信号的传导和放大，使得其在作为生物传感器时可以进行高灵敏的检测。此外，DNAzymes还具有良好的热化学稳定性、易于分子修饰、合成成本低廉等优点，方便与核酸扩增等信号放大手段配合，也很容易集成到比色法、荧光法和电化学法等分析报告系统。这些优势使得DNAzyme传感非常适合于建立简单便携的检测设备，如手持式阅读器，侧流层析装置，纸基微流控等。综上所述，多种基于DNAzyme的生物传感器已成功应用于食品安全检测，其在现实应用中的灵敏度、特异性和可行性也迅速发展。为了在防卫食源性疾病和避免食物浪费之间做好平衡，开发食品包装内传感器有很好的应用前景，有望实现不需要打开包装而输出易于检测的污染和变质信号[14]。这些柔性包装上反映食品安全和新鲜的动态指标，将可能打破食品安全对固定、粗略保质期的依赖。在当前食品安全领域，针对多种真菌毒素混合污染的多重检测仍是一个重要挑战。考虑到DNAzyme在合适设计下能够一并发挥分子识别、信号转导、信号放大中的数种功能，最近研究人员结合DNA逻辑门等策略开发了用于真菌毒素多重检测的DNAzyme传感器[31]，这些研究为实现灵活的多重检测提供了通用方案，有望在更多目标物和更多领域扩展研究和应用。研究人员通过将DNAzyme和核酸底物整合成单链闭环的DNA探针，使得DNAzyme抵抗环境中的核酸酶消化[41]。将DNAzymes的结构改造成三维形式，也可能不依赖化学修饰而提高固相对DNAzymes的吸附，抑制非特异性蛋白吸附而提高信噪比。尽管近年来DNAzyme传感取得了巨大的进步，但很少有报道这类传感器达到酶或抗体传感器的商业化水平[3]。为了满足对真实样品的实际检测需求，DNAzyme生物传感技术仍存在一些难点亟待解决：1）虽然DNAzymes能够在较宽泛的条件下保存，但大多数报道的DNAzymes的实际酶活强度受离子浓度、缓冲体系、pH值和温度等因素的影响较为显著；2）对于需要使用有机溶剂来前处理食物样品的检测目标物，DNAzymes对有机溶剂的耐受性仍相对不足；3）在许多DNAzyme传感策略中，DNAzymes需要固定在固相界面上，因而不同批次的固定化效果差异以及非特异性吸附问题等会直接影响整体催化模块的响应性能或者产生相应的测量误差；4）食品安全快速检测的操作环境一般较少排除环境核酸酶的影响，耐受环境核酸酶的DNAzymes还相对较少；5）大多数DNAzymes的催化活性相对不足，难以满足快速高灵敏检测需求；6）对于食源性致病菌选择性适体酶（aptazyme），选择性区分致病菌、非致病菌甚至耐药菌仍存在挑战，已获得的这类DNAzymes的数量仍难以满足食源性致病菌的多重检测实际需求。针对这些限制着DNAzyme传感应用的难点问题，较为根本的解决办法指向DNAzymes的人工筛选阶段，使用更低的目标浓度和更短的反应时间以及更严格更先进的体外筛选体系可能是未来发展趋势。另一方面，为DNAzyme修饰额外的官能团也可能直接提高其催化活性或其他功能。此外，针对食物样品复杂基质的配套前处理技术和配套工作缓冲体系对于DNAzyme传感器的商业化也至关重要。随着对DNAzyme传感技术和检测装置的不断发展，其他如样本采集、样品预处理、多路复用等功能也会逐渐被集成，基于DNAzyme生物传感小型化检测设备有望在将来加快实现商业化。
作者:邵芙蓉 赵尊全 白家磊 曹高芳 高志贤 单位:滨州医学院公共卫生与管理学院 事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
