细胞与分子生物学技术范文1
器官和组织的缺损或衰竭是临床遇到的极具危害性的医学难题,尽管目前人们通过器官或组织移植、外科再造和使用机械装置等治疗手段,解决了一些现实问题,但这些方法均存在不少缺陷。因此,人们一直在寻求一种新的治疗方法。随着多学科成果和技术不断交叉、融合和相互渗透,逐渐形成了一门新的交叉学科——医学组织工程学。作为一场意义深远的医学革命，在医学界它被誉为是继细胞生物学和分子生物学之后， 生命科学发展史上又一新的里程碑。
1 医学组织工程概述
组织工程学概念的提出始于20世纪80年代末,由于其重要的科学意义、巨大的临床应用前景、潜在的开发价值,受到了各国科学界的重视。医学组织工程学利用工程学和生命科学的原理来研究和发展具有生物活性的人工替代物,融合了细胞生物学、工程科学、材料科学和临床医学等相关知识。核心理念就是将体外培养的高浓度的正常细胞扩增后，吸附在生物材料上,形成具有三维空间结构的复合体，然后将复合体植入组织器官的病损部位,种植的细胞在生物材料被机体逐渐降解吸收过程中继续生长繁殖,形成新的具有相应形态和功能的组织和器官,从而达到修复创伤和重建功能的目的［1］。其最大优点是可形成具有生命力的活体组织，进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代，根据组织器官缺损情况进行塑形，达到完美的修复。
目前组织工程学的研究手段已经不再局限于初始阶段的细胞生物学和动物实验技术、分子生物学技术，而是广泛应用基因克隆技术、转基因技术、移植免疫学技术、生物材料合成与改良技术、生物材料的编织技术、生物力学技术、影像学技术和生物反应器等先进技术［2］，极大地提升了组织工程学的研究水平和其自身的发展速度。与传统的自体或异体组织、器官移植相比,克服了以创伤修复创伤的缺陷,将从根本上解决组织、器官缺损的修复和功能重建等问题。
2 种子细胞
种子细胞是医学组织工程的生命源泉，它要确保在体外培养时有很强的增殖能力，并能定向分化，同时要保持其原来的生理性状。大多数观点认为种子细胞进入新的微环境后，会对新的微环境中的调节信号做出反应，从而定向分化为目的细胞。同时具备这些特点的干细胞就成了种子细胞的首选。应用干细胞治疗疾病较传统方法还具有低毒性，一次药有效；不需要完全了解疾病发病的确切机理；避免产生免疫排斥反应等诸多优点。在临床治疗中，造血干细胞应用较早，在提高治疗有效率和缩短疗程方面优于常规治疗，且效果令人满意。
按分化潜能干细胞基本上可分为三种类型：一类是全能性干细胞，它具有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞（简称es细胞），它可从早期胚胎的原始胚细胞及原始生殖细胞中分离培养获得，具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，能分化出成体动物的所有组织和器官。由于在医学和生物学上具有巨大的潜力，而备受各国的高度重视，使其成为当前生物工程领域的核心问题之一，在这一领域，世界性的研究开发竞争正在迅速展开。es细胞最诱人的前景是生产组织和细胞, 用于“细胞疗法”, 为细胞移植提供源源不尽的无免疫性的材料。任何涉及丧失正常细胞的疾病都可以通过移植细胞来治疗, 包括帕金森病、糖尿病、外伤性脊髓损伤、细胞变性病、心肌病和骨损伤等［3］。尽管es细胞培养体系和来源问题研究已经取得了巨大进展, 但应用于临床还存在很多技术上的难题：其中最为重要的是其分化问题, 目前关于es细胞自我更新机制及其向不同组织细胞分化的机制均尚不清楚, 因此如何防止其在体外培养时发生分化以及如何诱导得到纯化的分化细胞尚待研究；由于人胚胎干细胞来自具有发育成一个个体潜力的人胚胎,所以其研究不可避免地引发伦理道德问题的争议，并且在实际应用中还不能避免免疫排斥。
另一类是多能性干细胞，这种干细胞具有分化为多种细胞组织的潜能，一般认为其具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。人们可望从自体中分离出成体干细胞，在体外定向诱导分化为靶组织细胞并保持增殖能力，将这些细胞回输入体内，从而达到长期治疗的目的。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。成体干细胞是普遍存在的，常位于特定的微环境中，问题关键在于如何寻找和分离各种组织特异性干细胞。成体干细胞具有多分化潜能，其中骨髓基质细胞和脂肪源干细胞已有大量研究及部分临床应用，在个体化治疗中已用于骨、软骨、心肌再生等领域；在群体化治疗中需要解决同种异体移植的免疫原性问题，采用基因敲除技术或rna 清除技术去除抗原可能解决异基因细胞同种移植的免疫反应，但也有可能影响被敲除基因的其他功能［4］。最近，美国和日本相继公布了从人皮肤成纤维细胞转化为胚胎干细胞样细胞的研究成果，为解决这些问题带来了曙光，但要实现应用这一目标，还要进行更多、更深入的研究。
还有一类干细胞为单能干细胞，这类干细胞只能向一种类型或与之密切相关的两种类型的细胞分化。 其中以脂肪源、肌源、上皮源及神经源干细胞为代表，作为组织工程的种子细胞, 或以细胞治疗的方式进行了广泛研究, 并已有临床应用的报道。
3 支架材料
支架材料在医学组织工程研究中起中心作用，可为细胞提供黏附、增殖、分化并进而为组织的形成提供载体，还起到模板作用，引导组织再生和控制组织结构。作为理想的生物支架材料至少应具备以下特点: ①良好的生物相容性：植入机体内不会引起炎性反应和毒性反应损害新组织的功能，维持正常细胞功能发挥; ②良好的可塑性：根据目的组织器官加工成特定的三维结构;③具有缓释功能：支架的降解速率可根据不同细胞组织再生速度进行调整，而且能彻底被新生的自然组织所替代;④支架的表面化学特性和表面微结构适合细胞粘附。因此寻找一种既具有良好生物相容性和生物降解性又具有特定形状和连通三维多孔结构的支架材料是组织工程成败之关键因素。
近年来,人们不仅在组织工程的最早产品人工皮肤领域进行了更为完善的研究和开发, 同时,在诸如人工骨、软骨、神经、血管材料等各系统,都进行了大量的研究和探索。目前研究的组织工程支架材料各自有各自的优点但也有不可避免的缺陷。国外研究较多的是pga、pla、pl2ga 等。这些材料具有可标准化生产、可降解、细胞相容性好等优点,但是这类材料本身亦存在一些固有不足, 如生物相容性差及机械强度不稳定等。基于这些原因, 研究人员一方面探索对聚醋类材料进行表面修饰, 同时也在积极寻找其它类型的支架材料。通过对材料表面进行修饰, 改善细胞与支架材料的相互作用; 通过模拟细胞生长微环境, 制备仿生材料,提高材料的亲水性、对细胞的黏附性, 促进细胞的分化增殖。将合成材料与天然材料有机结合, 已成为未来组织工程材料发展的新趋势。
研制复合材料、仿生材料、改性天然材料、纳米材料, 是当前支架材料研究的主要方向。越来越多的学者设计出具有合适降解度、良好通透性、组织相容性好的软骨细胞体外培养支架材料。新材料的开发要求具有良好的各项生物学特性。通过将缓慢释放的生长因子或相关的基因整合到材料中, 形成具有生物活性的生物材料, 可以使种子细胞能在更接近于体内环境的生物材料上增殖、分泌基质、最终形成组织。
在组织工程材料的合成与制备中通过采用纳米技术对生物材料表面的改性或者直接采用纳米材料或复合材料,不仅能提高细胞对材料的黏附能力,也能提高材料的生物相容性,同时通过材料表面与细胞间相互的生物作用,能刺激并诱发所期望的细胞效应,有利于细胞的分化和增殖，纳米材料以其与传统材料无可比拟的生物学性能,已在组织工程和生物材料研究中显示出广阔的应用前景。纳米技术、组织工程技术和生物技术的发展与综合,将为培养支架的研究提供新的选择。
4 生物活性因子
人体内的生长因子是通过细胞信号传递影响细胞活力的一类多肽因子,通过自分泌、旁分泌及内分泌作用,促进或抑制细胞生长、繁殖、迁移、黏附和基因表达的作用。在医学组织工程研究中,也需要在损伤组织的修复与病损器官的再生与功能重建中供给生长因子以促进种子细胞的分化和增殖。目前实验中常用的生长因子有成纤维细胞生长因子（fgf) 、转化生长因子（tgf- β) 、胰岛素样生长因子（igf) 、血小板衍化生长因子（pdgf) 、骨形态发生蛋白(bmp) 等等。它们不仅可单独作用, 相互之间也存在着密切关系,实验证明复合使用效果更好［5］。
在医学组织工程领域，生物活性因子对外源性生长因子或类生长因子作用的药物大多采用缓释技术，使其促再生作用持续一段时间。已有很多缓释材料在研究中，但目前尚未解决缓释体的有效释药浓度与组织器官再生所需药物浓度的相适应性。生物活性因子应用的另一个问题是多因子的协同作用及有序作用仍不清楚。
5 组织构建
医学组织工程的最终目的是构建组织器官修复体内缺损。构建组织工程化人体组织或器官, 涉及种子细胞在生物反应器中大规模培养、扩增技术,生物力学信号施加和化学信使生长因子或细胞因子的控制释放技术等多项关键技术。现在部分组织工程化组织已在临床应用中取得了初步的疗效, 充分体现了它在未来医学应用中的巨大潜力。最早经批准用于治疗和投入市场的移植物之一是组织工程皮肤植片。目前各国科学家们正在为多种组织, 包括骨骼、肝脏、动脉、神经、胰脏、皮肤、肾脏和膀胱, 构建组织工程结构［6］。但是体内环境是一个复杂的综合体, 除了各种生长因子、细胞间相互作用以及局部酸碱平衡等因素以外, 局部生物力学刺激也是一个重要因素。构建理想的组织还有很长的路要走。
就现在而言，医学组织工程领域所遭遇的最大的挑战之一是需要为复合组织和器官构建一个功能血管网。因为不论对于哪种组织和器官,血管形成都是关键性的；另外, 单一的器官中含有多种不同的细胞, 同时分离和扩增几种不同的细胞, 目前在技术上有一定的难度；其次, 在构建过程中维持严格的三维结构也是现有技术手段无法解决的难题。
6 展望前景
人体是一个具有复杂的形态结构、完善的功能的整体, 要完全模拟人体的组织和器官并非易事。虽然经过近20年的研究，医学组织工程已取得非凡的进展，应用组织工程的原理与方法, 已能构建多种组织并成功的修复相应的组织缺损,诸如皮肤、骨和软骨等组织和器官更是成绩斐然［7］。但是还有许多理论和技术问题有待进一步解决：在种子细胞的培养方面, 细胞的筛选和纯化是一个公认难题；在组织再生过程中发挥特异调节细胞增殖和分化作用的生长因子，可控性缓慢释放技术依然不完善；组织工程化组织在体外或体内形成过程中的演变规律如何？这些演变规律与正常组织发育、再生及创伤修复等过程有何异同，对这些问题目前仍然缺乏全面系统的了解。
医学组织工程的产业化无疑能够创造极大社会效益和经济效益，我国的组织工程研究从无到有逐步发展壮大起来,并取得了重要的研究成果。目前在研究开发上已经逐渐从临床前研究进人到临床试验阶段,如果我们能够创造出具有我国自主知识产权的组织工程产品, 率先应用于临床, 这样不仅可挽救众多病人的生命和肢体,促进相关学科的科技进步,更能造福于人类, 为形成新的知识经济产业打下基础。 【参考文献】
［1］ 王国正.组织工程研究［j］.中国医学科学院学报，2003,25(1):35.
［2］ sedov vm,andreev d,smirnova td,et al.the efficacy of cell therapy in the treatment of patients with tropic venous of lowes limbs［j］.angiol sosud khir，2007,13(1):67-75.
［3］ 鄂征，刘流.医学组织工程技术与临床应用［m］.北京：北京出版社，2003：16.
［4］ chen xl, li zl, zhang wb，et al. experimental study of maxillary sinus lifting with tissue engineered bone［j］.zhonghua kou qiang yi xue za zhi，2007，42（10）：610-613.
［5］ hwang ws, ryu yj, park jh, et al. evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst ［j］. science，2004, 303(3): 1669-1674.
细胞与分子生物学技术范文2
[关键词] 神经细胞；膜片钳技术；单细胞RT-PCR
[中图分类号]R34 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）04（a）-015-02
膜片钳技术(patch-clamp technique)是1976年由Neher和Sakmann[1]在电压钳基础上发展而来的一种记录细胞膜离子通道电生理活动的技术。后经Hamill[2]等进一步完善，其电流测量灵敏度已达1 PA,空间分辨率达1 m，时间分辨率达10 s，并已发展出许多适合不同需要的记录模式。它能分辨通过细胞膜单个通道的电流,对通道电导及其动力学特性、药理学特性和调节机制进行研究，为通道分型提供了可靠标准；同时它扩展了电生理技术的应用范围，以往难以研究的哺乳类动物小细胞或脆性很大的细胞等，均可采用膜片钳技术进行研究。另外，应用膜片钳技术还可准确监测出与细胞分泌相关的膜电容的微小变化，因而它还是一种研究细胞分泌机制的电生理新方法。
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是一种在体外由引物介导的特定DNA序列的酶扩增，能快速特异的扩增所需目的基因或DN段，是一种用途广泛且有效的核酸扩增技术。目前，PCR技术已广泛应用于基因分离、克隆和核酸序列分析，突变体和重组体构建，基因表达调控研究及基因多态性分析等。RT-PCR是将RNA的反转录（RT）与cDNA的PCR相结合的技术。首先经反转录酶作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
膜片钳与单细胞RT-PCR相结合的目的是为了确定单细胞内多基因表达的方式。该技术应用于神经细胞的研究, 从电生理学和分子生物学角度揭示了神经细胞功能活动与结构之间的相互联系,使单个神经细胞离子通道的生物物理学和药理学特性得以表现，同时可以在同一细胞筛选出特异性的mRNA表达。
1基本原理
Eberwine等[3]于1991年首先将膜片钳与单细胞RT-PCR技术结合起来，具体方法是:将逆转录酶、dNTP(DNA合成底物)及引物等在膜片钳记录之前加到电极内液中，使细胞内mRNA在膜片钳记录过程中即被逆转录生成cDNA，然后对生成的cDNA进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳进行分析。这两种技术的结合可对形态相似而电活动不同的细胞做出分子水平的解释。
1995年，美国哈佛大学医学院的Sucher和斯坦福大学的Deitcher[4] 在Neuron杂志上发表文章，首次介绍了膜片钳与单细胞RT-PCR技术结合在单个神经元研究中的应用，在完成对神经元离子通道的药理学和生物物理学特性观察后，研究同一细胞上特异mRNAs的表达情况。其具体操作是:在严格防止RNA酶污染的条件下先完成全细胞膜片钳记录，再将该细胞内容物吸入到记录电极中,然后用所研究的离子通道亚单位特异性引物将取自单细胞的mRNA逆转录成cDNA后进行PCR扩增，进而检测特异的mRNA。
膜片钳技术既可以对单细胞电生理功能进行研究，又可以借助其电极形成的吸收通道，吸取单个细胞，对其进行单细胞水平的分子生物学研究。借助于膜片钳电极，在相差显微镜观察下，直接用电极将待选取的单个细胞吸取出来，将其转入Eppendorf管，然后进行RT-PCR.
2研究进展
2.1分析神经元离子通道
Srinivasan Kanumilli等[5]运用膜片钳和单细胞RT-PCR技术，对成年鼠小脑和小脑蒲肯野神经元中的CaV2.1转录本进行表达分析，发现单个小脑蒲肯野细胞虽然表达多种CaV2.1转录本，但其种类比小脑中的少。他提出不同类型的CaV2.1转录本可在不同脑区和脑神经元中进行选择性表达。Mechaly I等[6]应用膜片钳和单细胞RT-PCR研究2种不同类型哺乳动物的可兴奋细胞（海马神经元和非神经头发囊状上皮细胞），发现在这两种细胞中Nav1.2 mRNA 和Nav1.6 mRNA表达最多,而Nav1.3 mRNA 和Nav1.7 mRNA分别在胚胎海马神经细胞和新生儿的头发囊状上皮细胞有适度表达。Lidong Liu等[7]应用膜片钳和单细胞RT-PCR技术，在分离的2~5个月的SD雄性大鼠前舌蕈状味觉感受器细胞上研究延迟整流钾(DRK)通道的表达，发现其上有许多种来自KCNA, KCNB和 KCNC 亚家族的DRK通道，其中 Shaker Kv1.5通道(KCNA5)是蕈状味觉感受器细胞主要的DRK通道。
2.2观察神经元受体分布
Whyment等[8]应用膜片钳和单细胞RT-PCR技术分析新生大鼠脊髓交感神经元组胺受体mRNA的表达，观察到75％交感节前神经元表达H1受体的mRNA而未表达H2，H3和H4受体的mRNA。该研究首次报道了交感节前神经元中表达H1受体，并推测组胺通过对H1受体直接的突触后效应对交感节前神经元的兴奋性进行调节。Julia E. Fries等[9]应用膜片钳和单细胞RT-PCR技术研究增殖性玻璃体视网膜病变病人视网膜Müller 细胞中P2Y受体亚型的类型，发现Müller 细胞表达P2Y1，P2Y2，P2Y4，P2Y6受体。Sergeeva OA等[10]在急性分离的TM神经元中,运用全细胞膜片钳和单细胞RT-PCR技术研究AMPA受体特征。发现所有神经元上都有AMPA受体GLUR2的mRNA，75%的神经元有GLUR1的mRNA，其次是GLUR4（56%）, GLUR3（0％）。
2.3分析神经元的分子基础
Sosulina L等[11]运用膜片钳、单细胞RT-PCR及无监督聚类分析方法,依据电生理特性和分子参数的不同把大鼠侧杏仁核神经元分成五类。第一类是投射神经元，此类神经元具有低发放频率，对长期去极化刺激具有频率适应性等电生理特性并表达囊泡膜谷氨酸转运体1（VGLUT1）。其根据电紧张性的不同和是否存在血管活性肠肽（VIP）又分class IA和class IB两类。其余四类都是含有谷氨酸脱羧酶(GAD67)的中间神经元。第二类神经元产生快速棘波，并伴有一些早期的频率适应。第三类神经元无频率适应而产生快速棘波，它与第两类神经元的区别在于后者存在VIP和相对较少的神经肽Y(NPY)及生长抑素(SOM)。第四类和第五类通过分子标记不能明确区别，但可根据膜电位值和棘波图形的不同进行区分。Hüttmann K等[12]通过膜片钳和单细胞RT-PCR技术研究顽固性颞叶癫痫病人的侧杏仁核神经元特性，发现投射性神经元具有棘状树突, 不同程度频率适应性的动作电位和γ-氨基丁酸受体耦联的内向整流K+通道(Kir)。而中间神经元的树突无棘或很少棘,动作电位小且常常是自发的,且无γ-氨基丁酸受体。单细胞RT-PCR发现，在投射神经元中表达Kir通道亚型Kir3.1 和Kir3.2及囊泡膜谷氨酸转运体VGLUT1和VGLUT2；而中间神经元也表达Kir通道亚型Kir3.1 和Kir3.2，但其缺乏VGLUT1 和VGLUT2受体。结果表明,根据形态学、电生理和分子生物学标准可以区分人脑杏仁核投射神经元和中间神经元。
2.4研究药物对神经细胞的作用
Zhong CB等[13]运用全细胞膜片钳和单细胞RT-PCR技术分析急性分离的东莨菪碱诱导的认知缺损的大鼠海马锥体神经元延迟整流钾电流的特征以揭示由胆碱能损伤导致记忆缺失的离子机制。他发现海马锥体神经元IK电流密度增大、振幅峰值变高；Kv2.1 mRNA增加,而Kv1.5 mRNA没有明显的改变，提示海马锥体细胞Kv2.1 mRNA表达增加可能是IK增加的原因及东莨菪碱诱导记忆缺陷的离子基础。Mark Fry等[14]应用全细胞膜片钳和单细胞RT-PCR技术分析了Adiponectin对大鼠最后区（AP）神经元的作用，观察到60％大鼠AP神经元对Adiponectin敏感，且对Adiponectin敏感的所有AP神经元均表达AdipoR1 and AdipoR2 两种Adiponectin受体。
3展望
膜片钳与单细胞RT-PCR技术相结合应用于神经科学领域的研究, 从分子生物学和电生理角度揭示了神经细胞的功能活动与结构之间的相互联系，也使得检测单个细胞的基因改变成为可能。该技术能够精确地研究特定单细胞的基因表达，成为研究功能基因组学的有力工具。而许多疾病的发生都是由于单个细胞的分子改变引起的，因此准确地找到发生改变的细胞对于疾病的诊断、机制的研究及防治都有重要的意义。但由于对技术的高度要求以及对外界干扰的高度敏感，单细胞RT-PCR 的应用受到了一定的限制。因此这项技术在体系上有待于进一步的完善，在应用上有待于进一步的扩展。
[参考文献]
[1]Neher E,Sakmann B.Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres[J].Nature,1976,260(5554):799-802.
[2]Hamill OP,Marty A,Neher E,et a1.Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patche[J].Pflugers Arch,1981,391(2):85-100.
[3]Eberwine J,Yeh H,Miyashiro K,et a1.Analysis of gene expression in single Live neurons[J].PANS,1992,89:3010-3014.
[4]Sucher NJ,Deitcher DL.PCR and patch-clamp analysis of single neurons[J].Neuron,1995,14(6):1095-1100.
[5]Srinivasan Kanumilli, Elizabeth W. Tringham, C. Elizabeth Payne, Alternative splicing generates a smaller assortment of Cav2.1 transcripts in cerebellar Purkinje cells than in the cerebellum[J].Physiol Genomics, 2006, 24(2): 86-96.
[6]Mechaly I, Scamps F,Chabbert C,et a1. Molecular diversity of voltage-gated sodium channel alpha subunits expressed in neuronal and non-neuronal excitable cells[J].Neuroscience, 2005,130 (2)：389-396.
[7]Lidong Liu,Dane R, Hansen,Insook Kim, et a1. Expression and characterization of delayed rectifying K+channels in anterior rat taste buds[J].Physiol Cell Physiol, 2005, 289: C868-C880.
[8]Whyment AD,Blanks AM,Lee K,et a1.Histamine excites neonatal rat sympathetic preganglionic neurons in vitro via activation of H1 receptors[J].Neurophysiol ,2006,95(4): 2492-2500.
[9]Julia E. Fries, Iwona M. Goczalik,Wheeler-Schilling,et a1. Identification of P2Y Receptor Subtypes in Human Müller Glial Cells by Physiology, Single Cell RT-PCR,and Immunohistochemistry[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2005;46:3000-3007.
[10]Sergeeva OA,Amberger BT,Vorobjev VS,et a1. AMPA receptor properties and coexpression with sodium-calcium exchangers in rat hypothalamic neurons[J].Neuroscience, 2004,19 (4), 957-965.
[11]Sosulina L,Meis S,Seifert G,et a1.Classification of projection neurons and interneurons in the rat lateral amygdala based upon cluster analysis[J].Molecular And Cellular Neurosciences 2006,33 (1): 57-67.
[12]Hüttmann K,Yilmazer-Hanke D,Seifert G,et a1.Molecular and functional properties of neurons in the human lateral amygdala[J].Molecular And Cellular Neurosciences,2006,31(2):210-217.
[13]Zhong CB，Pan YP，Tong XY, et a1. Delayed rectifier potassium currents and Kv2.1 mRNA increase in hippocampal neurons of scopolamine-induced memory-deficient rats[J].Neuroscience Letters,2005, 373(2):99-104.
细胞与分子生物学技术范文3
关键词：电子显微镜技术；农学专业；教学；应用
中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2014）05-0069-03
电子显微镜包括透射电子显微镜和扫描电子显微镜，它是一种研究物体超微结构精密分析仪器，主要用于研究样品的内部结构和表面形态特征的变化，在动物、植物、生物、医药、物理、化工材料等自然科学领域的科学研究中发挥着重要作用[1，2]。近年来，随着电镜技术的不断发展与其他技术学科的紧密结合，在动物医学、动物科学、农学、园林、食品与药品、草业、水利、机械交通等农学门类自然学科专业领域的应用更加广泛。因此，在农业高等院校本科和研究生教学中开设《电子显微镜技术》课程，可以为各专业学科的教学提供技术支持。新疆农业大学将《电子显微镜工作原理与应用》课程设定为全校本科生和研究生的公共选修课，有效地提升了各学科整体教学质量和科研能力。
一、《电子显微镜工作原理与应用》课程的教学内容与要求
1.《电子显微镜工作原理与应用》课程的教学内容。《电子显微镜工作原理与应用》课程理论教学内容包括：电子显微镜的概述、组织超微形态结构和功能、透射电镜的结构和工作原理、透射电镜的操作和使用、透射电镜的样品制备、扫描电镜的结构和工作原理、扫描电镜的操作和使用、扫描电镜样品制备技术、电镜样品制备实例，共九个部分。本科生理论课教学10学时，研究生理论课教学20学时。
《电子显微镜工作原理与应用》课程实验教学内容包括：电子显微镜的结构和使用操作、生物样品透射电镜制备方法、材料样品透射电镜制备方法、生物样品扫描电镜制备方法、材料样品透射电镜制备方法，共五个部分。本科生实验教学20学时，研究生理论课教学30学时。
2.《电子显微镜工作原理与应用》课程的教学要求。（1）《电子显微镜工作原理与应用》课程本科生教学要求。本科生教学中主要要求学生了解电子显微镜的结构和操作原理，动植物组织细胞超微结构、功能和细胞表面形貌特征，理化材料的晶体结构和形貌特点，常规生物样品和理化材料的制备技术方法。在实验教学中要求学生了解仪器的操作方法、生物样品的制备过程，掌握常规生物样品和理化材料的制备技术方法，使学生能够掌握电子显微镜技术在动植物组织细胞超微结构和理化材料研究中的应用。（2）《电子显微镜工作原理与应用》课程研究生教学要求。研究生教学中不仅要求学生要掌握电子显微镜的结构和操作原理，动植物组织细胞超微结构、功能和细胞表面形貌特征，理化材料的晶体结构和形貌特点，常规生物样品和理化材料的制备技术方法，而且还要求学生掌握电子显微镜的细胞化学定位技术、扫描电镜临界点干燥技术等特殊检测技术。
在实验教学中要使学生掌握仪器的操作方法，如超薄切片技术、半薄切片技术、负染技术、细胞化学定位技术、扫描电镜临界点干燥技术、离子溅射技术、细胞冰冻蚀刻技术等样品制备方法，使学生能够学会运用电子显微镜技术对动植物组织细胞超微结构和功能的研究方法和技术手段。
二、电子显微镜技术在农学门类高等院校教学中的应用
1.电子显微镜技术在农学专业实验教学中的应用。透射电子显微镜可以观察植物细胞的细胞壁、生物膜、叶绿体、线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体、微体、中心体、细胞骨架和细胞质内含物（如糖原、脂类、蛋白质），以及核膜、染色质、核仁的超微结构形态，通过对超微结构的学习和了解植物的生理代谢过程、病理变化机制，以及在外界因素的影响而导致形态结构和功能的改变[3，4]。为植物学、植物生理学、植物病学、植物生物学等学科学习奠定了理论基础，也为植物超微形态学的研究提供了技术手段。
2.电子显微镜技术在动物医学专业实验教学中的应用。在动物微生物学教学中，因病原微生物粒径微小，光学显微镜难以识别其特有结构，而通过TEM可以清晰地观察到细菌的特殊结构，如菌体鞭毛、菌毛、芽孢、荚膜等结构；病毒的囊膜、衣壳；霉病菌菌丝和孢子形态。通过电子显微镜的学习可以有助于学生对病原学的识别与理解，电子显微镜是病原学教学的有效工具[5]。
在动物病理学教学中，动物机体在致病因素作用下会导致细胞发生形态和功能上的改变，通过TME可以观察到病变区细胞的细胞器的损伤，对研究疾病的发生机制和致病机理和临床诊断提供有力的依据。例如，在肾活检、肿瘤诊治中电镜技术发挥了重要作用。电镜技术与免疫学技术相结合产生了免疫电镜技术，在超微结构和分子水平上研究各组织细胞的形态和功能，它可以对细胞表面及细胞内部的抗原进行定位，可以了解抗体合成过程中免疫球蛋白的分布情况、抗原—抗体复合物的结构细节以及免疫损伤引起细胞的病理变化[6]。
3.电子显微镜技术在动物科学专业实验教学中的应用。动物科学教学主要针对动物营养与饲养、饲料资源开发、饲料配方与饲料工艺设计，以及饲料与饲养企业管理等学科的研究，旨在满足人们日益增长的动物副食品饮食的需求。在动物科学的教学中将学习各种动物的养殖（包括养牛、养羊、养鹅、观赏动物饲养等），动物营养、遗传、繁殖、兽医学、牧草学、生态学、农业机械、农区规划、肉制品加工学等。在学习动物营养、遗传因素以及环境因素对动物生长发育的影响，可以通过电子显微镜观察动物组织细胞超微结构变化，来探讨和研究动物生长发育的特点，因此电子显微镜技术是动物科学教学和研究的重要技术手段。例如：应用扫描电镜检测鹿类毛的微观形态结构时可以明显观察到鹿毛的鳞片形态在科间、属间和种间存在的差异，同种不同个体毛的鳞片形态有差异，同一个体同一根毛样的不同部位也有差异[7]。
4.电子显微镜技术在食品与药品学专业实验教学中的应用。食品与药品学专业是以生命科学、食品科学和药品科学为基础，研究食品的营养、药品的安全与健康的关系，食品营养与安全保障、药品的安全与人类健康，通过对食品生产、加工的管理和控制，保证食品的营养品质和卫生质量，促进人体的健康。例如：荔枝的果实在采收后3～4天即开始变褐、变质、霉烂极不耐贮，通过用扫描电镜技术观察果皮结构，果皮的鲜红色是栅状组织细胞含大量花色甙所致，此花色甙流失，果皮即呈褐色。荔枝的外果皮仅有一层细胞外壁薄，角质层也薄，防止水分散失的能力差，果内的水分可部分地通过角质层散失到果外[8]。再如，运用扫描电镜对多种常见可食用淀粉颗粒的超微形貌进行观察，将考察的所有种类淀粉颗粒分为：块茎形、棒形、球形、扁平形、复粒结构、棱角圆滑和棱角尖锐多面体形及肾形等类别，通过扫描电子显微镜对淀粉颗粒超微形貌特征上加强国内淀粉产品的质量监管提供可靠参考[9]。
5.电子显微镜技术在园林专业实验教学中的应用。林学与园艺学专业是农业的重要组成部分，学习和掌握果树、蔬菜、花卉及观赏树木的栽培与繁育技术。园艺学科属于应用基础和应用型研究学科，是以农业生物学为主要理论基础，研究园艺作物生长发育和遗传规律的一门学科，也是研究园艺作物起源与分类、种质资源、遗传育种、栽培、病虫害防治及采后处理、贮藏加工等应用技术与原理的综合性学科。例如，观察五倍子乙醇提取物对表皮葡萄球菌的体外抗菌活性及其在电镜下菌细胞形态超微结构的变化时，采用新的中药抑菌实验方法对五倍子乙醇提取物进行表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度测定，用电镜观察用药后细菌细胞的形态改变。在电镜下观察经五倍子处理的表皮葡萄球菌细胞的超微结构，扫描电镜显示菌细胞形态大小不等，排列不整齐，大多数菌细胞的细胞壁破裂。在透射电镜下，菌细胞细胞壁结构、层次不请，胞浆膜层次不分明，细胞质内含物大多消失，细胞浆内包含体和染色体模糊不清[10]。再如，用扫描电镜对黑龙江产十种不同科属、不同生境的蕨类植物的孢子囊和叶表皮进行了详细观察，结果表明蕨类植物的孢子囊和叶表皮在扫描电镜下，显示出更为丰富的形态特征，并表现出细致而稳定的异同点，可作为蕨类系统分类的现代手段，能更好地应用于疑难科属的分类研究[11]。
6.电子显微镜技术在农业工程学专业实验教学中的应用。工程学是研究自然科学应用在各行业中的应用方式、方法的一门学科，同时也研究工程进行的一般规律，并进行改良研究。在农学专业中工程学专业主要包括水利科学专业、机械与交通专业、化学专业等学科。在工程学专业中建筑材料的质量与性质，对于工程建设至关重要。例如：对纳米材料特性的研究一般与粒径的大小分布及形状等微观结构有着重要的关系，扫描电子显微镜（SEM）和透射电镜（TEM）等，可以在极高的放大倍数下直接观察纳米颗粒的形貌和结构，特别是测量纳米颗粒的大小，既直观又非常方便，所以电子显微分析是研究纳米材料的一种重要手段，而其中透射电镜则是最常用的检测设备之一。透射电镜是基于传统电子束技术上发展起来的，它分辨率高、放大倍数高，分辨本领已达到了0.1～012nm，所得到的纳米图像直观清晰，可以揭示物质内部的微细结构，广泛应用于材料科学与生命科学领域，是研究纳米材料的常用重要分析仪器之一[12]。
三、展望
在农业技术快速发展的进程中，对农业人才专业素质的培养有了更高的要求。因而在教学过程中，就要使学生能够更扎实地掌握其专业基础知识和科学研究能力，在未来的农业科学的研究中，对样本显微和超微结构的研究也就越发深入，因而电子显微镜技术在农学专业的应用也越加广泛。因此，将电子显微镜技术应用于农业高等院校的科研和教学，使学生对动植物以及材料科学超微结构的认识有更加清晰地了解，为农业专业的人才培养和农业现代化发展提供技术保障，也可以为农业的发展提供重要的技术手段。
参考文献：
[1]汪克建，孙善全.提高研究生电镜实验教学质量的几点体会[J].山西医科大学学报，2010，12（3）：296-298.
[2]陶忠芬，江海东.浅谈电镜技术实验教学的体会[J].局解手术学杂志，2009，5（18）：338.
[3]项晓人，袁莉民，杭向前.透射电镜超微低倍观察植物材料的制样方法[J].江苏农学院学报，1993，14（2）：79-80.
[4]吴立新，陈方玉.现代扫描电镜的发展及其在材料科学中的应用[J].武钢技术，2005，6（43）：36-40.
[5]汤雪明，戴书文.生物样品的环境扫描电镜观察[J].电子显微镜学报，2001，3（20）：217-223.
[6]李连宏，孙雷，唐建武.电镜在病理诊断与医学研究中的应用[J].大连医科大学学报，1998，4（20）：8-10.
[7]孙中武，高海钰，毕冰.鹿类动物毛的扫描电镜分析[J].东北林业大学，2003，4（31）：29-32.
[8]潘洵操，谢宝贵.荔枝果皮的扫描电镜观察[J].园艺学报，1996，3（23）：227-230.
[9]王绍清，王琳琳，范文浩.扫描电镜法分析常见可食用淀粉颗粒的超微形貌[J].食品科学，2011，（32）：74-79.
[10]李仲兴，王秀华，时东彦.五倍子提取物对表皮葡萄球菌的抗菌作用及其扫描和透射电镜观察[J].中国中医药信息杂志，2004，10（11）：867-869.
[11]邢怡，党安志，刘保东.黑龙江产十种蕨类植物孢子囊和叶表皮的扫描电镜观察[J].植物研究，2004，4（24）：413-419.
[12]刘仁林，虞功清.植物透射电镜样品制备技术的改进[J].江西林业科技，2008，（1）：41-43.
细胞与分子生物学技术范文4
关键词 纳米技术；纳米生物学；DNA纳米技术
20世纪80年代才开始研究的纳米技术在90年代获得了突破性进展。最近美国《商业周刊》列出了21世纪可能取得重大突破的三个领域：一是生命科学和生物技术；二是从外星球获取能源；三是纳米技术。所谓纳米技术(Nanotechnology)是指在小于100 nm的量度范围内对物质和结构进行制造的技术，其实就是一种用单个原子、分子制造物质的科学技术［1］。纳米技术在新世纪将推动信息技术、生物医学、环境科学、自动化技术及能源科学的发展，将极大的影响人类的生活，衣、食、住、行、医疗等方面。本文将围绕纳米技术给21世纪的生物医学可能带来影响作一概述。
1 纳米生物学的研究对象
有人把在纳米尺度(水平)上研究生命现象的生物学叫做纳米生物学。纳米结构通常指尺寸在1 nm～100 nm范围的微小结构。1纳米等于10-9m，即1m的十亿分之一。我们知道，细胞具有微米(10-6m)量级的空间尺度，生物大分子具有纳米量级的空间尺度。在它们之间的层次是亚细胞结构，具有几十到几百纳米量级的空间尺度。显然在纳米水平上研究生命现象的纳米生物学，它的研究对象就是亚细胞结构和生物大分子体系。由于纳米微粒的尺寸一般比生物体内的细胞、红细胞小得多，这就为生物学研究提供了一个新的研究途径即利用纳米微粒进行细胞分离、疾病诊断，利用纳米微粒制成特殊药物或新型抗体进行局部定向治疗等。
2 纳米技术在生物医学方面的应用
2.1 测量和控制生物大分子
纳米技术与扫描探针显微镜(Scanning probe microscopes,SPMs)相结合，便具有了观察、制造原子水平物质结构的能力，为生物医学工作者提供了直接在亚细胞水平或分子水平研究生命现象的应用前景［2，3］。扫描探针显微镜是指利用扫描探针的显微技术，常用的有扫描隧道显微镜(STM,它是Scanning Tunneling Microscope的简称)和 原子力显微镜(AFM,它是Atomic Force Microscope的简称)。STM的原理是利用电子隧道效应测量探针和样品间微小的距离，又将探针沿样品表面逐点扫描，从而得到样品表面各点高低起伏的形貌。当探针和样品表面间的距离非常近达到一个纳米时，同时在它们之间施加适当电压，在它们之间会形成隧道电流，这就是电子隧道效应。这时探针尖端便吸引材料的一个原子过来，然后将探针移至预定位置，去除电压，使原子从探针上脱落。如此反复进行，最后便按设计要求“堆砌”出各种微型构件。
Hafner(1999)等［4］报道了碳纳米管的制备方法，整个过程如同用砖头盖房子一样。隧道电流的大小和探针与表面间的距离有关，因此通过隧道电流的测量可以确定这距离的值。STM观测的样品要有导电性，用AFM就没有这种要求。AFM的原理是用探针的针尖去“触摸”样品表面，将探针沿表面逐点扫描，针尖随着样品表面的高低起伏作上下运动。用光学方法精确测量针尖这种上下运动，就可以得到样品表面高低起伏的图像。用AFM还可以测量分子间作用力的大小以及不同环境中分子间作用力大小的变化。扫描探针显微镜又是操作生物大分子的工具。用它们可以扭转或拉伸生物大分子，从而研究单个生物大分子的运动学特性。STM和AFM在平行于样品表面的方向上的空间分辨率达到0.1 nm。已知样品中原子间距离的量级是0.1 nm ，所以STM和AFM的空间分辨率达到了分辨单个原子的水平。它的时间分辨率取决于要扫描的样品范围和像素点数目，用它们测量固定观测点时，时间分辨率达到ns甚至ps，扫描一幅面积是10 nm×10 nm的样品时，中等象素密度的时间分辨率约是1秒［5］。显而易见，利用STM、AFM等技术，好象使用“纳米笔”一样，可以操纵原子分子，在纳米石版印刷术中构造复杂的图形和结构［6］。
2.2 磁性纳米粒子的应用
德国学者报道了含有75%～80%铁氧化物的超顺磁多糖纳米粒子(200～400 nm)的合成和物理化学性质［7］。将它与纳米尺寸的SiO2相互作用，提高了颗粒基体的强度，并进行了纳米磁性颗粒在分子生物学中的应用研究。试验了具有一定比表面的葡聚糖和二氧化硅增强的纳米粒子。在下列方面与工业上可获得的人造磁珠作了比较：DNA自动提纯、蛋白质检测、分离和提纯、生物物料中逆转录病毒检测、内毒素清除和磁性细胞分离等。例如在DNA自动提纯中，用浓度为25 mg/mL的葡聚糖 nanomag R和SiO2增强的纳米粒子悬浊液，达到了≥300 ng/ μL的DNA型1～2 KD的非专门DNA键合能力。SiO2增强的葡聚糖纳米粒子的应用使背景信号大大减弱。此外，还可以将磁性纳米粒子表面涂覆高分子材料后与蛋白质结合，作为药物载体注入到人体内，在外加磁场2125×103/π(A/m)作用下，通过纳米磁性粒子的磁性导向性，使其向病变部位移动，从而达到定向治疗的目的。例如10～50 nm的Fe3O4的磁性粒子表面包裹甲基丙烯酸，尺寸约为200 nm，这种亚微米级的粒子携带蛋白、抗体和药物可以用于癌症的诊断和治疗。这种局部治疗效果好，副作用少。
2.3 纳米脂质体—仿生物细胞的药物载体
脂质体（Liposome)是一种定时定向药物载体，属于靶向给药系统的一种新剂型。20世纪60年代，英国Bangham AD首先发现磷脂分散在水中构成由脂质双分子层组成的内部为水相的封闭囊泡，由双分子磷脂类化合物悬浮在水中形成的具有类似生物膜结构和通透性的双分子囊泡称为脂质体。70年代初，Rahman YE等在生物膜研究的基础上，首次将脂质体作为酶和某些药物的载体。纳米脂质体作为药物载体的优点：①由磷脂双分子层包封水相囊泡构成，与各种固态微球药物载体相区别，脂质体弹性大，生物相容性好；②对所载药物有广泛的适应性，水溶性药物载入内水相，脂溶性药物溶于脂膜内，两亲性药物可插于脂膜上，而且同一个脂质体中可以同时包载亲水和疏水性药物；③磷脂本身是细胞膜成分，因此纳米脂质体注入体内无毒，生物利用度高，不引起免疫反应；④保护所载药物，防止体液对药物的稀释，及被体内酶的分解破坏。纳米粒子将使药物在人体内的传输更为方便。对脂质体表面进行修饰，譬如将对特定细胞具有选择性或亲和性的各种配体组装于脂质体表面，以达到寻靶目的。以肝脏为例，纳米粒子—药物复合物可通过被动和主动两种方式达到靶向作用：当该复合物被Kupffer细胞捕捉吞噬，使药物在肝脏内聚集，然后再逐步降解释放入血液循环，使肝脏药物浓度增加，对其它脏器的副作用减少，此为被动靶向作用；当纳米粒子尺寸足够小约100～150 nm且表面覆以特殊包被后，便可以逃过Kupffer细胞的吞噬，靠其连接的单克隆抗体等物质定位于肝实质细胞发挥作用，此为主动靶向作用。用数层纳米粒子包裹的智能药物进入人体后可主动搜索并攻击癌细胞或修补损伤组织。
纳米粒作为输送多肽与蛋白质类药物的载体是令人鼓舞的，这不仅是因为纳米粒可改进多肽类药物的药代动力学参数，而且在一定程度上可以有效地促进肽类药物穿透生物屏障。纳米粒给药系统作为多肽与蛋白质类药物发展的工具有着十分广泛的应用前景［8］。
2.4 DNA纳米技术和基因治疗
DNA纳米技术(DNA nanotechnology)是指以DNA的理化特性为原理设计的纳米技术，主要应用于分子的组装。DNA复制过程中所体现的碱基的单纯性、互补法则的恒定性和专一性、遗传信息的多样性以及构象上的特殊性和拓扑靶向性，都是纳米技术所需要的设计原理［9］。现在利用生物大分子已经可以实现纳米颗粒的自组装。将一段单链的DN断连接在13 nm直径的纳米金颗粒A表面，再把序列互补的另一种单链DN断连接在纳米金颗粒B表面，将A和B混合，在DNA杂交条件下，A和B将自动连接在一起［10］。利用DNA双链的互补特性，可以实现纳米颗粒的自组装。利用生物大分子进行自组装，有一个显著的优点：可以提供高度特异性结合，这在构造复杂体系的自组装方面是必需的。
美国波士顿大学生物医学工程所Bukanov等研制的PD环(PD?loop)(在双链线性DNA中复合嵌入一段寡义核苷酸序列)比PCR扩增技术具有更大的优越性；其引物无须保存于原封不动的生物活性状态，其产物具有高度序列特异性，不像PCR产物那样可能发生错配现象。PD环的诞生为线性DNA寡义核苷酸杂交技术开辟了一条崭新的道路，使从复杂DNA混合物中选择分离出特殊DN段成为可能，并可能应用于DNA纳米技术中［11］。
基因治疗是治疗学的巨大进步，质粒DNA插入目的细胞后，可修复遗传错误或可产生治疗因子(如多肽、蛋白质、抗原等)。利用纳米技术，可使DNA通过主动靶向作用定位于细胞；将质粒DNA浓缩至50～200 nm大小且带上负电荷，有助于其对细胞核的有效入侵；而最后质粒DNA插入细胞核DNA的准确位点则取决于纳米粒子的大小和结构。此时的纳米粒子是DNA本身所组成，但有关它的物理化学特性尚有待进一步研究［12］。
2.5 纳米细胞分离技术
20世纪80年代初，人们开始利用纳米微粒进行细胞分离，建立了用纳米SiO2微粒实现细胞分离的新技术。其基本原理和过程是：先制备SiO2纳米微粒，尺寸大小控制在15～20 nm,结构一般为非晶态，再将其表面包覆单分子层。包覆层的选择主要依据所要分离的细胞种类而定，一般选择与所要分离细胞有亲和作用的物质作为附着层。这种SiO2纳米粒子包覆后所形成复合体的尺寸约为30 nm。第二步是制取含有多种细胞的聚乙烯吡咯烷酮胶体溶液，适当控制胶体溶液浓度。第三步是将纳米SiO2包覆粒子均匀分散到含有多种细胞的聚乙烯吡咯烷酮胶体溶液中，再通过离心技术，利用密度梯度原理，使所需要的细胞很快分离出来。此方法的优点是：①易形成密度梯度；②易实现纳米SiO2粒子与细胞的分离。这是因为纳米SiO2微粒是属于无机玻璃的范畴，性能稳定，一般不与胶体溶液和生物溶液反应，既不会沾污生物细胞，也容易把它们分开。
3 发展趋势
跨入21世纪后的未来二三十年，数学、化学、物理学等基础研究的进展将扩大纳米技术的应用范围，使纳米技术与物医学的联系更加紧密，其发展趋势是：①生体相容性好的钛合金等物质将逐步开发［13］，并进入临床试验阶段；②纳米技术与分子生物学技术相结合，将有助于揭示生物大分子各级结构与功能的破译；③纳米生物技术将使药物的生产实现低成本、高效率、自动化、大规模，而药物的作用将实现器官靶向化［14］； ④纳米生物技术应用于分子之间的相互作用、分子复合物和分子组装的研究将在病毒结构、细胞器结构细节和自身装配机制上取得进展［15］；⑤纳米生物技术将使生物活性分子诊断、检测技术向微型、微观、微量、微创或无创、快速、实时、遥距、动态、功能性和智能化的方向发展。
有人预测，二三十年后，医生使用纳米技术只需检测几个细胞就能判断出病人是否患上癌症或判断胎儿是否有遗传缺陷。妇女怀孕8个星期左右，在血液中开始出现非常少量的胎儿细胞，用纳米微粒很容易将这些胎儿细胞分离出来进行诊断。在人工器官外面涂上纳米粒子可预防移植后的排异反应。使用纳米技术的新型诊断仪器只需检测少量血液，就能通过其中的蛋白质和DNA诊断出各种疾病。
参考文献
［1］ Keahler T.Nanotechnology: basic concepts and definitions［J］.Clin Chem,1994,40(9):1797.
［2］ Permiakov NK,Ananian MA,Sorokovoi VI,et al.Scanning probe microscopy and medico biological nanotechnology:history and prospects［J］. Arkl Patol,1998,60(5):9.
［3］Heinz WF,Hoh JF .Spatially resolved force spectroscopy of biological surfaces using atomic force microscopy［J］. Trends Biotechnol,1999,17:143.
［4］ Hafner JH,Cheung CL,Lieber CM. Direct growth of single walled carbon nanotube scanning probe microscopy tips［J］. J Am Chem Soc,1999,121:9750.
［5］唐孝威，胡钧.测量和控制生物大分子［J］.世界科技研究与发展,2000，22(4):16.
［6］Piner RD,Zhu J,Xu F,et al. Dip?pen nanolithography［J］. Science,1999,283:661.
［7］许孙曲，徐小妹编译.用新型二氧化硅增强的磁性纳米粒子作分子生物学研究的工具［J］.国外医学生物医学工程分册,2000,23(1)：62.
［8］Carino GP,Mathiowitz E. Advanced drug delivery［J］. Reviews,1999,35:249.
［9］Seeman NC.DNA nanotechnology:novel DNA constructions［J］. Annu Rev Biopgys Biomol struct,1998,27:225.
［10］Mirkin CA,Letsinger RL,Mucic RC,et al.A DNA based method for rationally assembling nanoparticles into maeroscopic materials［J］. Nature,1996,382(6592): 607.
［11］Bukanov NO,Demidov VV,Nielsen PE,et al.PD?loop: a complex of duplex DNA with an oligonucleotide［J］. Proc Natcl Sci USA,1998,95(10):5516.
［12］Schofield JP,Caskey CT.Non?viral approaches to gene therapy［J］. Br Merd Bul,1995,51(1):56.
［13］刘玲编译.钛和贱金属合金金属陶瓷冠的适合性［J］.国外医学生物医学工程分册,2000，23(4)：252.
细胞与分子生物学技术范文5
1.1细胞分离与染色
纳米细胞分离技术的出现有助于解决生物医学中快速获取细胞标本的难题。将15~20nm的SiO2包覆粒子均匀分散到含有多种细胞的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液中,利用梯度原理,通过离心技术快速分离所需要的细胞[1]。用这种方法很容易将怀孕仅8周左右的孕妇血样中极少量的胎儿细胞分离出来,通过对其染色体的分析,判断胎儿是否有遗传缺陷。应用纳米免疫磁珠检测早期肺癌患者循环血液中的肿瘤细胞,可以监测肺癌的转移情况[2]。
纳米颗粒也为建立新的细胞染色技术提供了新的途径。段箐华等[3]用联吡啶钌配合物[Ru(Ⅱ)(bpy)3]2+、异硫氰酸罗丹明B(TRITC)、异硫氰酸荧光素等荧光分子标记SiO2纳米颗粒,实现了体外对B淋巴细胞、肝癌细胞、早期凋亡乳腺癌细胞、系统性红斑狼疮细胞的特异性识别。异硫氰酸荧光素标记的SiO2纳米颗粒表面接特异抗体,可用于免疫学检测[4]。
1.2纳米造影剂
无机纳米粒子因其形状、尺寸和组成的不同而具有独特的物化性能,可用作新型生物造影材料,能提供良好的检测信号对比度和生物分布度,提高诊断效率,并有望将现有的解剖学层面的造影技术推向分子水平,即“分子造影”[5-7]。纳米造影剂一般需要3个组成部分:(1)无机纳米粒子核,如金、氧化铁等,用以实现造影增强效果;(2)水可分散的壳层,如聚乙二醇等,用以提高无机纳米粒子核的溶液稳定性;(3)赋予靶向功能的生物活性分子,如蛋白、多肽和抗体等。
高分子修饰的氧化铁纳米粒子,如葡聚糖包裹的超顺磁性氧化铁纳米粒子已被用于临床以提高解剖学层面的磁共振造影[8],也被用于分子造影[9]。传统的检测方法对Ⅰ、Ⅱ期癌症检出率小于15%,使用高磁共振对比度的造影剂能够提高早期癌症的检出率。例如,乳腺癌细胞过度表达人上皮增长因子受体2基因(HER2/neu)[10],将磁性纳米粒子(MNPs)偶联上HER2的抗体赫赛汀,就可以将SK-BR-3乳腺癌细胞检测出来[11]。用MNPs偶联赫赛汀探针还可以测出不同细胞的HER2表达量[12]。同样,可以用偶联了rch24抗体的Fe3O4靶向癌胚抗原来诊断结肠癌[13];用偶联了HmenB1抗体的FePt-Au来靶向成神经细胞瘤细胞(CHP134)过度表达的聚唾液酸(PSA)[14]。合金MNPs,如FePt@CoS2等兼具造影和治疗功能。
FeP@tCoS2纳米粒子被HeLa细胞摄入以后,在癌细胞的酸性环境中释放出的Pt+能导致癌细胞凋亡[15]。SiO2@Fe3O4@Au纳米粒子可以用于磁共振造影和治疗,当其与抗HER2基因抗体偶联后有明显的T2加权造影效果,再加上持续的光照,由金壳产生的能量能将癌细胞杀死,起到治疗作用[16]。
金纳米粒子因为其独特的表面等离子共振效应被用作光学造影剂和传感器[17-19]。利用金纳米粒子的表面易于功能化的特性,El-Sayed等[20]在金纳米粒子表面偶联表皮生长因子抗体(anti-EGFR),使金纳米粒子靶向富集在表皮生长因子高表达的口腔上皮癌HOC313细胞上。与普通上皮细胞HaCaT相比,经表面改性的金纳米粒子在HOC313细胞中表现出了更清晰的造影效果。以壳聚糖为纳米载体的复合微球成功地将包覆的金纳米粒子与药物一同送入细胞核,起到了细胞核给药和细胞核造影的双重功能,实现了金纳米粒子的多功能化[21-22]。
半导体纳米粒子(又称量子点)已经被用作荧光探针,用于细胞标记和光学探针[23-24]。美国华盛顿大学的研究人员用蛋白将一个量子点内核包裹在一个直径为3nm的超薄金壳中,使两部分的光电特性不受彼此的干扰,从而首次实现了将半导体和金属纳米粒子结合在一起而仍能保留各自的功能,量子点可用于荧光成像,金球则可用于散射成像。
1.3纳米传感器和新型纳米诊断技术
虽然对纳米传感器的研究时间较短,但其优点是不容置疑的。由生物大分子构成,利用化学能进行机械做功的分子马达纳米传感器,使其尖端插入活细胞内而又不干扰细胞的正常生理过程,来获取活细胞内多种反应的动态化学信息、电化学信息。如利用ATP酶作为分子马达的纳米传感器能进入人体细胞,完成在人体细胞内监测和药物释放等任务,可以连续监测体内代谢变化,对肺部小血管内NO和CO的监测结果对于高血压和心血管疾病的诊断和治疗具有重要意义[25]。其他的分子马达还包括RNA聚合酶、肌球蛋白和驱动蛋白等[26]。在糖尿病治疗中可将纳米生物传感器置于真皮层检测葡萄糖水平,从而指导给药。斯坦福大学的科学家最近利用纳米科技及电磁效应发明了一种生化传感器,这种传感器可以及早发现癌症的早期症状,利于对患者及时进行治疗。
随着隧道扫描显微镜和原子力显微镜的问世,人们能够在纳米尺度上了解生物大分子的精细结构及其与功能的关系,并动态获取生命信息[27]。利用原子力显微镜可以在纳米水平揭示肿瘤细胞的形态特点,通过寻找特异性的纳米结构改变实现对肿瘤的早期诊断,从而解决肿瘤诊断的难题[28]。
2纳米药物载体和纳米药物
纳米药物与传统的分子药物(molecularmedicine)的根本区别在于它是颗粒药物(particulatemedicine)。广义的纳米药物可分为两类:一类是纳米药物载体,即指溶解或分散有分子药物的各种纳米颗粒,如纳米球、纳米囊、纳米脂质体等。二是纳米药物,即指直接将原料药物加工成的纳米颗粒,或利用崭新的纳米结构或纳米特性,发现基于新型纳米颗粒的高效低毒的治疗或诊断药物。前者是对传统药物的改良,而后者强调的是把纳米材料本身作为药物[29]。
2.1纳米药物载体
实现细胞和亚细胞层次上药物的靶向传递和智能控制释放,是降低药物毒副作用、提高治疗效果的共性问题。纳米粒子介导的药物输送是纳米医学领域的一个关键技术,在药物输送方面具有许多优越性。目前,用作药物载体的材料有金属纳米颗粒、生物降解性高分子纳米颗粒及生物活性纳米颗粒等[30]。理想的纳米药物载体应具备以下性质:毒性较低或没有毒性;具有适宜的制备及提纯方法;具有合适的粒径与形状;具有较高的载药量;具有较高的包封率;对药物具有良好的释放特性;具有良好的生物相容性,可生物降解或可被机体排出;具有较长的体内循环时间,并能在疗效相关部位持久存在等。
2.1.1抗肿瘤药物载体肿瘤的纳米靶向治疗以纳米粒为载体,将药物或制剂定向于肿瘤部位,可以大幅度提高药物的生物利用率,提高疗效,降低用药量,减少毒副作用,已成为国际肿瘤药物研制中的热点和前沿。
恶性肿瘤周围及其实质有大量的新生毛细血管形成,这些血管通透性高,400~600nm以下的纳米颗粒可穿过血管到达肿瘤组织。Alexiou等[31]在动物模型上用磁性纳米粒负载抗癌药物进行区域动脉灌注,外加磁场定位浓集,发现纳米粒子随血液流入肿瘤部位并渗透到肿瘤组织内,提高了药物的治疗指数。Mu等[32]将生物可降解聚合物PLGA纳米粒、VitaminE、TPGS和抗肿瘤药物紫杉醇混合在一起,药物可较容易地到达肿瘤部位而发挥靶向效应作用。杨凯等[33]在治疗口腔癌颈淋巴结转移灶时,将抗癌药物葫芦素BE装载到聚乳酸纳米微粒上,发现药物可靶向到达病变部位,毒副作用和局部刺激作用显著减小。
恶性肿瘤的纳米粒磁导靶向热疗也是有效的方法,热疗本身可以破坏肿瘤细胞。将磁性纳米粒子经包裹或修饰后选择性地注射到肿瘤部位,然后施加交变磁场,纳米粒子受到交变作用而产热,可提高放疗和化疗的效果。口腔颌面部肿瘤位置相对表浅,是最适合作磁导靶向化疗和磁导靶向热疗的部位。此外,由于纳米脂质体载体具有较好的药物、基因和成影剂包封率,在肿瘤造影成像等方面显示出较好的优势[34]。
2.1.2中枢神经系统(CNS)药物载体血脑屏障对于维持CNS的相对稳定起着重要作用,但其毛细血管连接紧密,大多数药物很难通过血脑屏障进入CNS。因此,如何使CNS药物跨越血脑屏障从血液进入脑内且发挥药效是药物传递系统需要解决的一个难题。纳米粒子作为药物载体,为不能透过血脑屏障的CNS药物入脑提供了新途径。Sun等[35]以聚乳酸为基质,制备了装载异硫氰酸荧光素-右旋糖酐的纳米粒,并将纳米粒用聚山梨酯-80包衣,给小鼠尾静脉注射后发现纳米粒可主动靶向脑组织。Kepan等[36]同时给小鼠注射采用聚山梨酯-80包衣的甲氨蝶呤聚氰丙稀酸丁酯纳米粒子(PBCA-NP),未包衣NP及甲氨蝶呤溶液,通过检测脑脊液及脑组织内药物浓度显示,采用聚山梨酯-80包衣的甲氨蝶呤PBCA-NP能显著提高脑内甲氨蝶呤药物浓度。Petri等[37]研究显示,泊洛沙姆-188包衣的PBCA-NP与聚山梨酯-80包衣的PBCA-NP均能显著提高阿霉素的抗脑肿瘤活性。
Oliver[38]发现,用聚山梨酯-80修饰的PBCA-NP通过血脑屏障的机理,部分是由于载体降解产生的毒性打开了脑血管内皮的紧密连接。Ulbrich等[39]发现,用人血清白蛋白纳米粒子包无跨血脑屏障能力的药物洛哌丁胺(loperamide),并与转铁蛋白或转铁蛋白受体的单克隆抗体OX26共价结合后,能够借助血脑屏障上转铁蛋白受体介导的胞吞作用进入脑组织,产生强烈的抗伤害性药效。将神经生长因子载入表面经聚山梨酯-80修饰的PBCA-NP,注射帕金森病小鼠模型后可在21d内持续发挥抗帕金森病的疗效[40]。抗菌药物环丙沙星(ciprofloxacin)装载入表面修饰了HIV-1反式激活蛋白(TAT)的聚乙二醇纳米粒子,利用TAT能将异源蛋白导入细胞内或穿过血脑屏障的特点,通过检测发现该抗菌药物能被人类星型胶质细胞摄取,此法还可用于使其他抗生素跨越血脑屏障,从而治疗脑部感染[41]。
2.1.3其他胰岛素(insulin,INS)的降糖疗效明显,但普通制剂的INS口服给药不易吸收,且容易被胃蛋白酶、胰蛋白酶和肠激酶等降解,因此目前临床上INS的常规给药途径为注射给药。大量的研究工作证实,口服纳米囊可保护INS不被酶破坏,提高INS的生物利用度,减少用药次数。Mesiha等[42]制备的聚氰基异丁酯丙烯酸纳米粒可将药物作用时间从6h延长至72h,生物利用度更好。Merisko等[43]制得INS纳米粒,通过体外实验证明其有良好的缓释能力。Christiane等[44]用生物聚合物和非生物聚合物复配制得纳米粒子,可将INS包裹在纳米粒子的内核,对INS的包封率可达到约96%,并且实验证明有很好的缓控释效果。纳米药物控释系统还被用来防治血管再狭窄[45]。
再狭窄是冠状动脉经皮腔内成形术(PTCA)后常见而严重的并发症,运用微孔球囊介入导管将纳米粒子自由分散形成的乳状悬浮液置于PTCA部位,可以达到防治再狭窄的效果。另外,载药纳米粒子进入动脉壁后,随着可降解材料的逐渐水解,其内含的药物便缓慢持续释放出来,从而实现药物在动脉内局部定位。用纳米颗粒,包括纳米胶束、纳米脂质体等作为基因转移载体,已引起医学界广泛重视。其原理是纳米颗粒作为载体将DNA、RNA、PNA(肽核苷酸)、dsRNA(双链RNA)等基因治疗分子包裹其中,或者通过静电引力或吸附将治疗分子固定在其表面形成复合物,在胞吞作用下纳米颗粒进入细胞,释放基因治疗分子,发挥治疗效能[46]。
2.2纳米药物
直接以纳米颗粒作为药物的应用之一是抗菌药物。纳米抗菌药物具有广谱、亲水、环保、遇水后杀菌力更强、不会诱导细菌耐药性等多种性能。以这种抗菌颗粒为原料,成功地开发出了创伤贴、溃疡贴等纳米医药类产品。例如,纳米二氧化钛树脂基托材料具有一定的抗变形链球菌和抗白色念珠菌的效果,当树脂基托中抗菌剂的浓度达到3%时,即可达到满意的抗菌效果[47]。郭春兰[48]用纳米银医用抗菌敷料对142例患者的手术切口进行护理,所有切口均无感染并Ⅰ期愈合,同常规使用普通无菌敷贴覆盖切口的方法相比,平均每例的愈合时间提前1.69d。
无机纳米颗粒作为新型的抗癌药物为肿瘤治疗提供了新的思路。Liu等[49]用Gd@C82(OH)22处理荷肝癌的小鼠,在10-7mol·kg-1的注射剂量下能有效地抑制肿瘤生长,同时对机体不产生任何毒性。其抑瘤效应不是通过纳米颗粒对肿瘤的直接杀伤起作用,而是可能通过激活机体免疫来实现对肿瘤的抑制作用。纳米羟基磷灰石在体外对恶性肿瘤细胞产生明显的抑制作用,而对正常细胞作用甚微,可望通过进一步的研究获得一种区别于传统的化疗药物的纳米无机抗癌药物[50-51]。此外,有的物质纳米化后出现新的治疗作用,如二氧化钛纳米粒子可抑制癌细胞增殖[52];二氧化铈纳米颗粒可以清除眼中的电抗性分子并防治一些由于视网膜老化而带来的疾病[53]。
3组织修复和再生医学中的纳米材料
将纳米技术与组织工程技术相结合,构建具有纳米拓扑结构的细胞生长支架正在形成一个崭新的研究方向。相对于微米尺度,纳米尺度的拓扑结构与机体内细胞生长的自然环境更为相似。纳米拓扑结构的构建有可能从分子和细胞水平上控制生物材料与细胞间的相互作用,引发特异性细胞反应,对于组织再生与修复具有潜在的应用前景和重要意义[54]。将纳米纤维水凝胶作为神经组织的支架,在其中生长的鼠神经前体细胞的生长速度明显快于对照材料[55]。向高分子材料中加入碳纳米管可以显著改善原有聚合物的传导性、强度、弹性、韧性和耐久性,同时还可以改进基体材料的生物相容性。研究发现,随着复合物中碳纳米管含量的增加,神经元细胞和成骨细胞在复合材料上的黏附与生长也越来越活跃,而星形细胞和成纤维细胞的活性则呈现同等程度的下降[56-57]。Freites[58]设计的人造红细胞输送氧的能力是同等体积天然红细胞的236倍,可应用于贫血症的局部治疗、人工呼吸、肺功能丧失和体育运动需要的额外耗氧等。Murphy等[59]成功合成了模拟骨骼亚结构的纳米物质,该物质可取代目前骨科常用的合金材料,其物理特性符合理想的骨骼替代物的模数匹配,不易骨折,且与正常骨组织连接紧密,显示出明显的正畸应用优势。
纳米自组装短肽材料RADA16-I与细胞外基质具有很高相似性,RADA16-I纳米支架可以作为一种临时性的细胞培养人工支架,它能很好地支持功能型细胞在受损位置附近生长、迁移和分化,因而有利于细胞抵达伤口缝隙,使组织得以再生。有研究人员[60]利用RADA16-I纳米支架修复了仓鼠脑部的急性创伤,并且恢复了仓鼠的视觉功能。RADA16-I形成的水凝胶可用作新型的简易止血剂,用于多种组织和多种不同类型伤口的止血。
4纳米中药
“纳米中药”是运用纳米技术制造的粒径小于100nm的中药有效成分、有效部位、原药及其复方制剂[61]。纳米中药不是简单地将中药材粉碎至纳米数量级,而是针对组成中药方剂的某味药的有效部位甚至是有效成分,进行纳米技术加工处理,赋予传统中药以新的功能。
中药纳米化可以使细胞破壁,大大提高中药有效成分的渗透性或溶解度,提高生物利用度;利用纳米化的中药所具有的缓释功能和靶向给药功能,在提高药效的同时降低毒副作用;利用中药的纳米包覆技术能改变一些中药制剂的亲水、亲油性,提高临床疗效。例如,用纳米粉碎技术将中药黄芩、黄连、黄柏、地榆超微粒化,添加纳米锌、硒等微量元素,加广谱强效纳米银系(AT)抗菌剂、麦饭石纳米粉、远红外二氧化钛、电气石在传统中药配方基础上制成的纳米中药,用于烧烫伤的治疗,提高了药物疗效[62]。将超临界二氧化碳萃取技术用于中药挥发油提取和中药有效成分的提取,通过包覆技术把中药挥发油和中药有效成分制备成纳米药物。超临界二氧化碳萃取技术已广泛用于对菖蒲根、金丝桃叶、月桂叶、肉豆蔻、苍术、高良姜等的有效成分进行提取和对紫苏、香薷、防风、辛夷、苍术、厚朴、细辛、木香等挥发油的提取[63]。
对中药挥发油采用包合技术制备包合物,用纳米尺度的分子材料(主要是环糊精类)作为载体材料,形成不到2nm的药物超微粒,其内径为0.7~0.8nm,可容纳几个药物分子,这样的包合物又称为分子型包囊[64]。由于载体是种多羟基物质,且羟基排列于筒状结构的外壁,极易分散于水中,筒内侧可包裹水难溶性的药物分子,从而大大提高水难溶性药物在水中的溶出和体内的吸收,提高生物利用度,还可降低药物的刺激性,增加药物的稳定性。药物脂质体制剂在纳米中药的研制中也得到了日益广泛的关注。如纳米雄黄脂质体[65]、辛夷挥发油纳米脂质体[66]、马钱子碱脂质体的研究[67];鱼腥草挥发油纳米脂质体的制备及其肺靶向效果[68]等。
纳米中药的研究和应用仍处于起步阶段,存在许多亟待解决的问题,如纳米中药的药效不确定性及可能的毒副作用、纳米中药的有效成分和稳定性难以控制等。但目前已经取得的一些成果表明,纳米中药的研究极大地丰富了中药的剂型,对中药的研究和开发产生了巨大的推动作用。这方面研究的深入能在纳米中药的制药技术、药效等诸方面建立更多具有自主知识产权的专利技术和创新方法,促进中药制剂的标准化和国际化,提升中药的市场竞争力。
5纳米医学材料的安全性
纳米材料在医学领域已应用于药物载体、癌症治疗、基因治疗、抗菌材料、组织工程、医学诊断等方面,给人类带来了许多好处。然而,有关纳米材料毒理学的报道也很多[69-70]。由于纳米材料具有小尺寸效应、表面和界面效应以及量子尺寸效应等特性,可能引发特殊的生物学效应,给人类健康和环境带来负面影响。例如,Yeo等[71]指出具有抗菌效果的纳米银可在水生环境中蓄积,对斑马鱼胚胎发育有毒性作用。
从纳米医学材料大小与DNA、蛋白质、病毒等生物分子的尺寸相当这一事实很容易想到,即使化学组成相同,纳米物质的生物毒性也可能不同于微米尺寸以上的常规物质[72]。根据常规物质研究所得到的毒理学数据库与安全性评价结果,可能不适用于纳米物质;现有的安全评价方法、技术又都不太适用于纳米医学材料对人体风险评价[73]。这些问题正是目前纳米医学材料安全性评价的困难所在。
纳米材料的安全性评估是一个全球性关注的问题,美国、欧盟、日本纷纷斥巨资展开纳米材料的安全性研究,我国也已将其列入国家“973”重点基础研究规划项目。纳米技术涉及很多学科,如电子、生物、物理、化学等等。因此,对医用纳米材料安全性的评估不是单一的某个学科可以完成的,而是需要临床医学、基础医学、毒理学、物理学、分子生物学、化学和环境科学等多学科的融合,充分利用各种先进的分析技术,开展多学科的综合研究。
6展望
虽然纳米医学刚刚问世,但其发展的巨大潜力已经展示在我们面前。21世纪是纳米科技的世纪,人们将以全新的角度和视野看待生物医学问题,在纳米水平上可以更加深入地研究各种组织的结构和功能,并充分发挥其优势。纳米医学技术的发展必将为基础与临床研究带来新的机遇,为现阶段尚不能解决的问题带来新的思路和方法。
细胞与分子生物学技术范文6
话说生物学是一门驳杂的自然科学，最近沸沸扬扬的转基因技术之争，以及再之前的克隆人之患，都是属于生物技术范畴。别误会，生物学不是专门给人添堵的，通过它我们可以更好地认识自己发展自己！
书归正传，近年来生物学界最热门的研究课题不是这两位，而是今天要出场的IPS（induced pluripotent stem cells）技术，IPS技术，中文名叫诱导多能干细胞技术，作为一个脱胎于克隆，却避开了伦理学尴尬，根植于理论性极强的分子生物学，又具有很强实用性的前端技术，IPS甚得科研工作者与老百姓的欢心。
等等，这是啥？通俗来说，这项技术就是运用各种手段，对动物已发育的细胞进行一定操作，使得其“返老还童”，成为一个可以分化成任意器官、任意组织的原始细胞。哦，那怎么就甚得欢心了？咱们设想一个情境，有一天很不幸，你的右手被鳄鱼咬掉并吞进肚子里，这个时候，你跑去找生物学家，生物学家从你的口腔上皮取一点上皮细胞。过了几天之后，一个一模一样的右臂出现了，生物学家给你接上，没有任何免疫排斥反应，你又可以四处玩耍自由自在了！很神奇对不对？如果这项技术能够继续发展下去，只要你不是脑死亡，再大的外伤也不用怕了。想想还真有点科幻小说里的小激动！
不对呀，作者你跑题了吧？说好的女性主义呢？恩，IPS领域的最新进展表明：“小鼠的孤雌生殖已经成功，孤雌胚胎干细胞提供了唯一可行的建立真正干细胞库的方案，可以为任何需要的病人提供与其免疫系统相匹配的细胞”。好嘛，又晕了！大白话就是：“现在的技术已经达到了可以只用小鼠卵细胞就培养出干细胞，甚至可以培养出小鼠了！而人类也完全类似的！”也就是说，在技术水平上，人类已经到只要有女性存在，便可以繁衍后代，而不需要男性参与的程度。那么，不久之后技术在发展点，也可以“孤雄生殖”不需要女性咯？很遗憾，中科院周琪研究员告诉我们：“孤雄生殖的受精卵在形成的早期便全部死掉”。唉，男人们不要哭了！
可是，这还并不是个例。家蚕、鱼、蟾蜍等多种动物的孤雌生殖实验早就获得了成功。比如，朱洗等研究者早在1961年便成功地将人工单性生殖的蟾蜍，经冬眠和催青，最终培养出了世界上第一代没有外祖父的蟾蜍。但请注意，所有的实验室的成功案例，都是卵细胞，都是孤雌生殖，都是雌性在遗传上的优势体现。男人哭吧哭吧，不是罪。
而在自然环境下，许多无脊椎动物及一些脊椎动物（某些鱼类和两栖类、蜥蜴、火鸡）的卵子，本身就有自然的单性生殖。再举几个例子，目前已发现有近30种蜥蜴是进行孤雌生殖，且一代又一代繁殖，后代皆为雌性。而蚜虫是在秋季进行有性生殖，到春天后又行单性生殖，两种生殖方式呈现周期替进行。还有一种比较奇怪的，卵子需要进入，以促使卵的活化，并最终导致卵发育，但没有遗传信息参与子代的发育，如银鲫就是这样。总结下，就是自然环境下也有许多生物可以进行无性繁殖，但也依旧只限雌性。我说那边哭的兄弟，眼泪流干了就过来继续听吧，快讲完了。
