细胞凋亡范例6篇

更新时间:2023-05-11 15:41:11

细胞凋亡

细胞凋亡范文1

1 神经元凋亡的慢性炎症学说

近年的免疫组织化学研究表明,许多神经疾病尤其AD患者脑内有强烈的局灶性炎症反应,组织培养及分子生物学方法也证明脑细胞可产生许多炎性细胞因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β等)、补体蛋白及其他免疫分子。这些炎性蛋白质及小胶质细胞(microglia, Mi)活化同AD病变间的密切关系,使人们提出了神经元退化的炎症学说。近年来有关β-淀粉样蛋白(amyloid protein β,A β)激活免疫炎症过程而间接造成神经退行性病变的假说获得了不少新的证据。AD患者脑内的Aβ类不溶性大分子以及胞外的NFTs,极易被吞噬细胞发现,因而作为慢性刺激物质而逐渐积累,并刺激炎症反应不断加强,造成AD的慢性炎症状况。

AD的许多促发因素如遗传、年龄、环境因素等均可诱发初始病变(如AD的SP及NFT),这些病变即使引起某些神经元死亡,也是较为轻微的,因而病变进展缓慢;然而这些初始病变可激发炎症反应,后者发展至一定程度则导致更多神经元死亡,造成更多的病变,进而激发更严重的炎症反应,如此形成一个不断加强的自身毒性环路(autotoxic loop)。这个正反馈环路导致了临床所观察到的AD及其类似疾病在起始阶段进展较缓,到某个时期病情才急剧恶化。由此可见,慢性炎症可能是AD发病机制的必要因素。AD是一种由Aβ沉积,通过激活周围Mi产生细胞因子和神经系统免疫炎症应答,加速神经细胞死亡,而致记忆减退和认知障碍的疾病。而记忆与颞叶海马CA1区神经元活性有关,提示AD发病机制之一可能是Aβ等启动CA1区神经元细胞凋亡。

2 神经元凋亡的诱导

细胞凋亡(PCD)是由细胞基因控制的一种主动死亡过程,特定基因由于种种原因编码自杀性蛋白而致DNA裂解。愈来愈多的证据表明,大多数动物细胞皆能自我致死,而且这种普遍性的自杀程序能由发自其他细胞的信号所激活或抑制。例如许多发育中的脊椎动物神经元的生存依赖于与其连接的靶细胞分泌的神经营养因子(NTF),若NTF缺乏可致神经元发生PCD。细胞的PCD也受外源性因素的影响,但诱导PCD的内源性与外源性因素都必须通过特定基因而发挥作用。

2.1 淀粉样蛋白与神经毒 越来越多的证据表明,Aβ是各种原因诱发AD的共同通路,是AD形成和发展的关键因素[5]。分子克隆研究证明,Aβ来自一分子量更大的β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein, APP)。目前多数学者认为,Aβ在大脑皮层内的蓄积是AD病理发生过程中的一个早期必然事件,超前于其他脑区 损伤和临床症状数年[6]。在发生顺序上,Aβ的出现早于神经纤维缠结、轴索缺乏营养等病理变化以及临床症状。最为直接的证据是Aβ在一定条件下能表现出神经毒性。90年代初,Yankner等首先观察到较高浓度的Aβ能引起神经元退化和死亡,并证实引起毒性的必需结构是其25~35位的氨基酸序列(Aβ25~35)。最近发现,Aβ的神经毒性包括两个方面[7],一是增强或放大各种伤害性刺激如低糖、兴奋毒素、自由基等的细胞损伤效应,一是直接的细胞毒性。实验发现,多数细胞与Aβ接触后就能表现出细胞肿胀、染色质浓缩、核内DNA断裂等细胞凋亡典型的形态和生化特征[8],仅在少数细胞内或与兴奋毒素共存时才表现出神经元肿胀、膜溶解、乳酸脱氢酶释放等坏死(necrosis)的特征[9]。Aβ的神经毒性涉及到复杂的分子机制,主要包括促进自由基的形成、破坏细胞内的Ca2+稳态[7],降低K+通道的功能[10],增强致炎细胞因子(cytokine)引起的炎症反应[11]。由于多种因素相互影响给研究带来了相当大的难度。

2.2 炎性细胞因子和神经毒

2.2.1 白细胞介素6(IL-6):在中枢神经系统(CNS),IL-6主要由Mi和星形胶质细胞(astrocyte, As)产生,其受体也广泛存在于丘脑、海马、皮层等脑区的神经元膜上。IL-6的神经元毒性作用主要在转基因小鼠脑内得到证实。Campbell[12]报道,IL-6转基因小鼠具有严重的神经疾病症状,表现为瘦小、行为异常、震颤、共济失调和癫痫。神经病理特征为,海马与小脑出现明显的神经元退化,尤其是海马CA1区域树突萎缩,树突空泡化和树突数目减少,并且伴随着高表达的IL-6 mRNA和高水平的IL-6。这些结果表明,脑内IL-6水平的升高是导致转基因小鼠神经元退化的主要原因。此外IL-6转基因小鼠研究还发现,隔一海马胆碱能通路的功能受到严重损害[13],由于隔一海马通路参与记忆印迹的形成,因此脑内高水平的IL-6有可能影响学习与记忆功能。

有关IL-6与Aβ或APP关系的研究已有报道[14]。在原代培养的大鼠皮层神经元实验中,IL-6 200 ng/mL与神经元接触6 h之后,APP mRNA的表达增加了大约一倍。由于IL-6与APP或Aβ共存于AD的SP内,提示IL-6对APP的表达具有直接调控作用,可以促进APP产生,进而导致Aβ沉积,诱发AD。α2-M是已知最强的蛋白酶抑制剂,与IL-6共存于AD皮层与海马SP内。曾有报道[15],在培养的人神经元细胞株内,α2-M 可抑制APP的正常分泌,导致Aβ形成增加。在人SH-SY5Y神经元细胞培养实验中,α2-M的基础合成很低,但用IL-6刺激后其合成被强烈诱导,α2-M水平大约增加了20倍[16]。这些结果提示,IL-6与α2-M在AD脑内的共存具有功能性联系,IL-6可能通过诱导α2-M合成,进而抑制APP的正常酶解,导致Aβ生成与沉积异常增加,从而诱发AD病理发生。

2.2.2 肿瘤坏死因子-α(TNF-α):LPS可刺激Mi产生TNF-α,As也可能产生少量TNF-α。在人胚胎原代神经元培养中发现,TNF-α有增强N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体介导的神经毒性作用[17],且对人神经元细胞HN33.1有细胞毒作用。大鼠神经细胞培养中,TNF-α通过作用于As间接发挥了细胞毒性而引起神经元的损伤。直接将TNF-α注射到小鼠小脑,可引起普遍性损伤。TNF-α可引起牛及啮齿类动物的Mi通过PCD机制发挥细胞毒作用。但这一作用在人类尚没有被发现。

2.2.3 转化生长因子-β(TGF-β):TGF-β是具有多功能作用的细胞因子,它可由多种细胞产生,在胚胎发生期的神经细胞发育过程及免疫炎症反应过程中,TGF-β都具有重要作用。大鼠新皮层神经细胞培养中,TGF-β可减少由细胞毒物、缺氧、缺血或谷氨酸引起的细胞损伤,而起到了神经保护作用[18]。使用人类胚胎皮层细胞培养,也发现了TGF-β可减轻由Aβ引起的神经细胞损伤。TGF-β对神经细胞的这些保护机制目前并不清楚。相反的结果也发现,TGF-β可能具有细胞损伤作用。由于其抑制了星形细胞谷氨酰胺合成酶的活性而增加了外源性谷氨酸造成的神经细胞损伤。也有报道TGF-β伴随Fos-Iacz的表达而参与细胞凋亡过程。

2.3 一氧化氮(NO)与神经毒 在人的中 枢神经系统,As是产生NO的主要细胞,IL-1β是一个关键性因子,可直接刺激人As产生NO[19]。TNF-α及IFN-γ可加强IL-1β的作用。实验也证明这些白细胞介素处理过的As能产生足够量的NO,而造成神经细胞损伤[19]。Mi产生的NO具有细胞毒性作用,它可能参与神经损伤及神经退行性疾病的病理过程。NO合酶抑制剂或能抑制Mi活性的物质均可减轻Mi介导的神经元损伤。此外,能释放NO的硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)能直接杀伤培养中的人类胚胎皮层神经元。炎症条件下,脑内的胶质细胞可以表达诱生型一氧化氮合酶(inducible NOS, iNOS),产生大量NO,导致神经元坏死或凋亡。一般情况下,持续与低水平的NO或过氧亚硝酸盐接触引起神经元凋亡,而短暂与高水平的NO或过氧亚硝酸盐接触则引起神经元坏死。

此外目前的研究结果也证实,前列腺素E2(PGE2)直接与海马神经元接触引起了神经元凋亡性死亡[20]。一些神经递质如多巴胺(DA),谷氨酸盐(glutamate, Glu)等可使某些神经元细胞凋亡。Glu是Mi激活后产生的一类神经毒物质,它是一种兴奋性氨基酸(EAA)。目前认为,神经细胞的缺血缺氧、退行性病变、变性、炎性损伤等都可能与EAA的神经毒性有关。Yamada和Hatanaka报道[21],在20 d胎大鼠海马神经元培养中,Glu与神经元接触15 min,可引起海马神经元显著退化。

3 神经元凋亡的基因调控

PCD是受遗传基因调控的,在调控PCD的过程中常有新基因表达,合成新的蛋白。在调控的信号中有的是起正调节作用,也有的是起负调节作用。不同的细胞由不同的基因诱导PCD。这些基因有:ced-3/ced-4、nedd2、TRPM-2、Fas(Apo-1)、c-fos、c-jun、c-myc、野生型p53等。抑制PCD的基因有:ced-9、bcl-2、突变型p53等[22]。此外,IL-1β转化酶家族是一些新发现的细胞“死亡蛋白”,与ced3、nedd2具有高度同源性,在炎症因子诱导的神经元PCD中起重要作用。

IL-1β转化酶(IL-1 beta-converting enzyme, ICE)是存在于许多哺乳动物细胞内的一种蛋白酶,是近年来研究较多的“死亡蛋白”之一。人类ICE最初是在单核细胞中发现的一种半胱氨酸蛋白酶,可使非活性的前体IL-1β(相对分子质量为33 000)在116位天冬氨酸和117位丙氨酸之间酶解为具有活性的相对分子质量为17 000的IL-1β细胞因子。ICE与线虫细胞死亡基因ced-3有高度同源性[23]。Kumar等先克隆出鼠nedd-2基因,长3.7 kb,其基因编码的蛋白可促进鼠细胞的凋亡,LinWang以nedd-2为模板通过PCR扩增制备探针从人胎脑cDNA文库筛选出人nedd-2基因,其编码的氨基酸序列和ICE/ced-3顺序同源。转染小鼠ICE基因或ced-3基因,使其过度表达均可引起小鼠纤维母细胞出现凋亡。另外,在发生凋亡的细胞中可见成熟的IL-1 β分泌增多。这一结果提示,ICE/ced-3基因可能是决定细胞死亡基因之一[24]。目前认为ICE在由Fas、TNF及一些炎症因子等诱导的细胞凋亡中起重要作用。ICE是Fas、TNF及炎症因子介导的主要通路,其研究的重要性可想而知。AD患者神经细胞退行性改变有ICE参与。由于细胞死亡基因ced-3与nedd-2和ICE为同种物质,是引起细胞凋亡的重要酶,多种因素均可激活该基因,ICE产生可在细胞内产生一种细胞死亡蛋白,而ced-3、nedd-2和ICE为同种物质,是引起细胞凋亡的重要酶,多种因素均可激活该基因,ICE产生的IL-1β对神经细胞起直接或间接毒性作用,导致神经元凋亡。证明ICE表达促进神经细胞凋亡,而对ICE表达的调节,寻找一些抑制ICE活性的药物,对一些凋亡过多的疾病如AD及Parkinson病有重要的治疗潜力。

4 抗炎药物抑制神经元凋亡的可能性

20世纪的神经科学已获飞速发展,但造成神经元死亡的原因尚未明了,以致许多全球性致死性神经疾病一直缺乏有效的防治手段。AD发病的炎症学说启发人们用抗炎药物减缓或阻止AD发病。它不同于近10多年惯用的两种治疗方法,即基于 胆碱学说的各种AchE抑制剂如他克林(tacrine)、新斯的明等和以吡烷酮醋胺为代表的促智药(nootropic drugs),被用来试图改善大脑皮层的代谢能力,进而减轻痴呆程度[25]。上述治疗方法并不能减缓皮层神经元的急剧损毁,因而无消除病变的根本原因。人们转而思索用抗炎疗法来抑制神经元死亡。这个设想已被临床试验所证实,有人在用非甾体类抗炎药物(NSAID)吲哚美辛(indomethacin, IM)治疗AD的一项有安慰剂对照的双盲试验中发现,接受100~150 mg/kg IM治疗的患者,其认知功能的改善明显优于安慰剂对照组[26,27],然而尚需要更大规模的临床试验及进一步研究,以筛选出选择性调节免疫炎症反应和抑制神经元死亡的新药。

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细胞凋亡范文2

【关键词】中性粒细胞;凋亡;烧伤

严重烧伤后体内激活的炎性细胞生成和释放大量细胞因子,机体炎症反应失控,机体代谢增加,免疫功能紊乱,被认为是导致伤后SIRS的重要发病基础,也是当前烧伤死亡的主要原因,PMN凋亡和功能的改变,在细胞、组织和器官的损伤中及MODS中发挥重要作用[1]。中性粒细胞(PMN)凋亡的异常可加剧或延长炎症过程和持续的组织损伤,成为烧伤后炎症损伤的重要环节之一。临床上对炎症反应的治疗开始扩大到一系列对炎症介质的调控和拮抗,如对PMN的活性进行调控可能改善炎症反应。本文就PMN凋亡与烧伤关系的近年来研究进展做一综述。

1PMN凋亡的概念及病理生理意义

细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程,其发生需要基因的表达和蛋白质的合成,整个过程受由遗传机制决定的程序化调控,又称为程序性细胞死亡。正常的细胞凋亡是一种生理现象,如果受到破坏,将引起一系列病理改变。PMN是主要的炎症细胞,在炎症过程中无论是数量上还是功能上都处于重要地位。一般情况下,PMN寿命很短,凋亡是使PMN失活的重要途径,其自发凋亡对急性炎症的消退、继发组织损伤的预防起重要作用。在凋亡过程中,PMN丧失原有的生物学功能并在包膜完整状态下被吞噬细胞清除掉,此时不但可避免大量细胞内毒性物质的释放,而且释放抑制炎症反应的因子,如TGF-β,PGE2等,炎症得以收敛[2]。若PMN凋亡延长,则其在清除病原微生物的同时会继续发挥生物学功能,释放一些生物活性物质,吸引更多的炎症细胞和炎性介质,增强炎症反应并造成自身组织的损伤。许多报道证实烧伤、重症感染、全身炎症反应综合征和再灌注损伤的病人均伴有外周血PMN凋亡延迟。由于PMN可通过多种途径损伤机体,粒细胞的凋亡延迟就意味着持续的炎症反应,并进一步可导致多脏器功能衰竭。

2PMN凋亡的基因调控

Bcl-2及其家族基因有抑制细胞凋亡和促进细胞凋亡两组基因,它们相互作用从而对细胞凋亡进行调控,是重要的细胞凋亡调控基因。PMN常规表达半衰期相对较长的促凋亡蛋白Bax、Bak、Bid和Bad,这些促凋亡蛋白的持续表达,使PMN寿命短暂(6-10小时);同时PMN也表达半衰期相对较短的抗凋亡蛋白A1、Bcl-xl、Mcl-1(半衰期仅2-3小时),一般情况下,半衰期长的促凋亡基因(主要是Bax)的活性占优势,促进粒细胞凋亡。但当机体受到炎症损伤时,抗凋亡蛋白合成增加,粒细胞出现凋亡延迟[3]。研究显示,体外PMN培养中Bcl-xl、Mcl-1基因表达逐渐下降且很快消失,认为此与PMN的自发性凋亡的进程有关,并且将Bcl-2基因转移至小鼠后,PMN凋亡受到一定程度的抑制[4]。PMN caspase 3的活化是PMN凋亡过程中一个必需环节,其下游的蛋白激酶C同工酶的活化及其向核内转移是确保核酸内切酶活化的关键,从而使细胞核DN段化,加速PMN凋亡[5]。P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)则在PMN延长其寿命期限过程中发挥重要作用。抑制P38MAPK活化可加速PMN的凋亡过程,而增强其活性则延迟PMN的凋亡。此外,细胞外信号调节激酶(ERK)的活化可延迟PMN的凋亡。P38MAPK和ERK两种途径间可能存在相互促进和制约的关系[6]。

3PMN凋亡的影响因子

3.1抑制因子PMN凋亡在基因调控基础上还会受到许多炎症相关因子的影响,如IL-1、2、6、8、15、GM-CSF、G-CSF等可抑制PMN凋亡。一些细菌毒素、可溶性免疫复合物、前列腺素E2及激素水平的提高等均可抑制PMN的凋亡。机体发生炎症反应过程中细菌所产生的少量琥珀酸也能抑制PMN凋亡。颜光涛[7]等研究显示,磷脂酶A2内外源性阻断剂4-溴苯甲酰溴甲烷可明显减弱促凋亡作用。IL-6、IL-18及烧伤血清刺激后可引起PMN凋亡延迟[8]。

3.2促进因子加速PMN凋亡的有TNF-α、超氧离子O2-、某些蛋白水解酶及一些病毒如EB病毒、A型流感病毒等;一些药物也可加速其凋亡,如柳氮磺胺吡啶、低浓度金诺分等;此外,实验表明PLA2激动剂脂多糖、钙离子载体及高浓度的丁二酸等促进PMN凋亡[7]。

4PMN凋亡与烧伤

4.1烧伤后PMN凋亡的变化及影响因素大量实验表明,严重烧伤后外周PMN凋亡发生延迟。冯刚等[9]应用流式细胞技术动态观察严重创伤病人后一周内多个时相点PMN凋亡率的变化,发现创伤病人各时相点外周PMN凋亡率明显降低,表明严重创伤病人外周PMN凋亡显著抑制。李志清等[10]的实验显示,伤后一天内不同时相点的PMN凋亡百分率明显降低,烧伤大鼠血清刺激24h后,PMN凋亡百分率显著降低,表明严重烧伤后或在烧伤血清刺激下大鼠PMN凋亡延迟。另有实验显示严重烧伤后痂下水肿液也抑制PMN凋亡,并表明烧伤血清和痂下水肿液抑制细胞凋亡均呈剂量依赖关系[11]。烧伤血清抑制细胞凋亡的能力是通过减少对人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的中和抗体。GM-CSF增加PMN的粘附性和延长其活性,在烧伤血清中抑制PMN细胞凋亡可能发挥重要作用[12]。郑江等[13]实验显示严重烫伤大鼠PMN凋亡率显著降低的同时血清IL-6和IL-1α水平在伤后均显著升高,PMN caspase-3的活性降低,认为IL-6和IL-1α等细胞因子可能是重要的影响因素,细胞内caspase-3激活的减少可能是烧伤后PMN凋亡延迟的机制之一。还有人认为热损伤引起的PMN凋亡延迟部分与P13激酶/蛋白激酶活化增加了Bcl-xl的表达有关[14]。此外,近年来有研究报道,烧伤后bcl-2呈现出增加的变化,是烧伤患者血浆抑制PMN凋亡的重要因素之一[15]。

4.2烧伤后PMN凋亡的意义PMN凋亡后主要靠巨噬细胞吞噬清除,限制其介导的机体损害。实验显示严重烧伤后大鼠血巨噬细胞(Mφ)凋亡百分率较正常大鼠血清刺激后增多,腹腔Mφ对凋亡PMN吞噬能力降低,加上烧伤引起的PMN本身凋亡延迟,凋亡的PMN不能被Mφ吞噬完全,最终坏死,释放毒性内容物,是引发SIRS的重要因素之一,PMN凋亡的进程影响着炎症的发展和转归[10]。细胞凋亡的生物化学特征是由于细胞内切酶的激活,细胞中DNA断裂,以核小体为单位进行DN段化。在白细胞凋亡中PMN凋亡占72%,PMN凋亡率决定了核小体的水平。Anne Morrison等[16]检测创伤后失血性休克患者核小体水平,发现非感染者核小体水平比感染者高2.5倍到3倍,核小体的增加在全身感染中起到一定保护作用,由此可见,外周血PMN凋亡的增加可降低感染率。此外,PMN凋亡率可作为预测严重创伤病人病情程度和预后的指标[9]。

4.3PMN凋亡的调节许多研究表明,调节PMN的凋亡可改善全身炎症反应,加速创面愈合。Zhang PH等[17]观察地塞米松对正常血清和烧伤血清诱导烧伤早期PMN体外自发凋亡的影响,结果显示,烧伤血清较正常血清诱导PMN凋亡减少,bcl-2、NFκB蛋白表达增加;加入地塞米松后,PMN凋亡增加;且NFκB蛋白表达减少,表明地塞米松可减轻烧伤血清对PMN凋亡的抑制作用,其机制可能与NFκB蛋白表达下调有关。魏在荣等[18]采用重度烧伤大鼠模型,利用低剂量环磷酰胺(cyclophosphamide,CY)进行干预,观察大鼠骨髓PMN的变化,结果显示,烧伤后给予低剂量GY,PMN凋亡率增加,持续时间延长,PMN数量开始减少的时间延迟,由此得知,低剂量CY可保持烧伤后早期PMN的数量,使其充分发挥生物学功能,又能加速严重烧伤早期大鼠骨髓PMN的凋亡,调控其排空。

PMN持续或过度产生或释放细胞毒素加剧了炎症反应和组织损伤,Janinov V等[19]认为能够降低PMN活性和加速其凋亡的物质,如天然多酚,能够改善持续性炎症反应的病理状态,并认为PMN的氧化和凋亡可作为药理干预的潜在目标,拟PMN的抑制作用可被看做是对炎症过程药理调制的新战略,支持了抗炎症的内在机制。黄新莉等[20]采用体外分离和培养人血PMN,研究硫化氢(H2S)对人PMN凋亡的影响,结果表明NaHS可促进PMN凋亡,其机制可能与其上调P53蛋白的表达有关。此外,氮激光照射可增加烧伤后PMN的凋亡,减轻局部炎症和改善烧伤创面愈合[21]。

PMN是体内重要的炎症细胞,一般而言,PMN自发凋亡被抑制,其寿命会延长,生物学功能也会相应增强;反之,PMN自发凋亡被促进,它的寿命会缩短,其生物学功能也会相应减弱,PMN凋亡是其介导的炎症反应终止的最主要步骤。在炎症控制与治疗中,明确PMN凋亡在全身性炎症反应中的作用及其相关影响因素十分必要,有利于为调节机体严重烧伤后炎症反应开辟一条新途径。

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细胞凋亡范文3

1900年,Regand首次认识到发生过程中存在着生殖细胞的退化。对大鼠等啮齿目动物的研究表明,生精过程中实际产生的数量比理论预测减少25%~75%[1]。20世纪70年代,Kerr等提出细胞凋亡(apoptosis)的概念,包括程序化细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)和非程序化细胞死亡(nonprogrammedcelldeath,NPCD),提示细胞凋亡在男性生殖中具有重要影响[2]。现已证实,生殖细胞退化是通过细胞凋亡实现的。在发生各个阶段,都存在自发性的生精细胞凋亡。但不同时期凋亡细胞数目有很大差异,原位检测表明,在发生过程中主要是精原细胞和精母细胞发生凋亡,而细胞凋亡很少发生。精原细胞特别是A精原细胞凋亡是导致数少的主要原因,其凋亡均发生在有丝分裂期间。精母细胞凋亡发生在减数分裂过程中的细线前期、偶线期,特别是粗线期。就是通过精原细胞不断增殖,同时过量的受到损伤的生精细胞不断凋亡,来控制细胞数目,维持发生的动态平衡。本文就生殖细胞凋亡的生理意义、机制和影响因素作一综述。

1生精细胞凋亡及其生理意义

生精过程是指精原细胞经过多次有丝分裂,最后发育成,其中存在精细复杂的调节机制。生精细胞凋亡主要发生在三个阶段:首先是在A型精原细胞的有丝分裂;其次是精母细胞的减数分裂;最后是发生的过程[3]。生精细胞的凋亡还与生精上皮处于生精周期阶段有关,不同发育阶段的生精细胞对相同刺激因素反应性不同,由此推测生精细胞凋亡有多种调节机制。现研究较多的是在激素和局部加热诱导下,生精细胞凋亡的调控机制,着也是目前较有希望的男性节育调节手段[4]。生精细胞凋亡具有重要生理意义,参与维持发生过程的动态平衡,维持支持细胞与生精细胞的最佳比例,清除基因异常生殖细胞,调节生精过程中数量和质量,是机体保持生殖遗传稳定的重要防御机制。在病理状态下,细胞凋亡则导致少精或无症发生[5,6]。

2生精细胞凋亡机制

2.1Bcl-2蛋白家族它包括促凋亡的蛋白(Bax、BAD、Bak、Bik、Bok、Diov、Hrk、BID和抑制凋亡的蛋白(Bcl-2、Bcl-xlr、Mcl-1、Bcl-w、Bfl-1/A1)。他们分别控制着细胞死亡通路的各个阶段。Furuchi和Rodriguez发现[7,8],过分表达Bcl-2的转基因大鼠,会出现精原细胞增生,并且生精细胞凋亡的机会也减少。Bax缺失的大鼠会导致减数分裂前期生精细胞不正常积累,从而造成生精过程紊乱,以致没有生育能力。另外一些Bcl-w缺失的大鼠也没有生育能力[9]。这些资料都证实了Bcl-2蛋白家族的选择性表达对生精过程异常重要。

2.2肿瘤抑制蛋白P53P53蛋白和Bcl-2蛋白家族一样调控着细胞内的死亡信号途径。许多研究报告证明P53在生精细胞的凋亡中起着关键的作用,包括自发性的和损伤诱使的生精细胞的凋亡[10]。缺P53基因的大鼠虽然生长发育正常,也有生育能力,但是在射线作用或实验睾后表现出生精细胞凋亡的滞后,并且凋亡数目也减少[11,12]。尽管大多数的资料表明P53仅调节有丝分裂的生精细胞的活性来控制细胞凋亡,近来也有资料表明它也在生精细胞的减数分裂和减数分裂后期起着关键的作用,从而影响细胞凋亡。

2.3caspase-3蛋白酶caspase-3是一种活化胞浆的蛋白酶,它是一种死亡蛋白酶,凋亡细胞通过它的数目的增多从而启动凋亡的级联反应。Kumi-Diaka用5,7,45-三羟异黄铜(genistein)作用于TM4细胞株后[13],同时发现了细胞的凋亡和坏死并且caspase-3的酶活性提高,因此表明在用genistein引起的内生精细胞和支持细胞的凋亡可能包括启动caspase-3蛋白激酶这一信号通路的作用。

2.4Fas/CD95系统Fas信号系统由相互作用的蛋白Fas(CD95/APO-1)和FasL(CD95L/APO-1L)组成。Fas是属于TNF受体家族的一种I型跨膜蛋白,它广泛存在于各种组织中。FasL是II型的膜蛋白,它以跨膜和可溶性的分泌形式(sFasL)存在[14,15]。sFasL可以在远距离范围内调控表达Fas蛋白的细胞凋亡。免疫组化的结果证明,支持细胞在它们的质膜上表达FasL,而生精细胞则选择表达Fas[16]。现在已有多种证据证明Fas信号系统启动生精细胞的凋亡:(1)在混合培养的支持细胞和生精细胞中加入FasL的反义核苷酸(阻断了FasL的翻译),明显看到生精细胞凋亡数目的减少;(2)Fas和FasL的mRNA的表达量随着动物年龄的不同而不同,在大鼠中是16~33天最多,而此时刚好是大鼠生精细胞凋亡的高峰;(3)加入模拟FasL功能的Fas的激动剂(一种抗Fas的抗体,Jo-2),生精细胞的数目大大减少。此外,在一些有害化合物引起的损伤中,Fas系统也与生精细胞的凋亡密切相关。Boekelheide[17]用MEHP诱使损伤的实验表明,随着生精细胞凋亡数目的增多,Fas和FasL的表达量也提高,并相应达到峰值。而且,Fas的活性部分RIP和FAP-1的表达也增多。因此,Fas/FasL是一个重要的旁分泌系统,它不仅影响生精细胞生理条件的凋亡,控制着生精过程的稳态,而且也在有毒物质诱使的损伤中极大地影响了生精细胞数目。

3生精细胞凋亡与激素

3.1睾酮(testosterone,T)又称生精激素,由间质细胞合成、分泌。大量研究表明,睾酮水平的降低是生精凋亡的重要原因。利用间质细胞毒性物质——乙基二甲基磺酸盐(EDS)处理大鼠,2天后中检测不到3β-羟类固醇脱氢酶,8天后凋亡指数增加,长时间EDS处理,粗线期精母细胞和细胞的凋亡明显增加[18]。睾酮是通过与支持细胞合成的雄激素受体(AR)特异结合发挥其生物学效应的。睾酮在精原细胞、精母细胞的发育及细胞的变态过程起作用,较高水平的睾酮对精原细胞的发育是必须的。睾酮有选择地在生精周期VII-VIII阶段起调节作用。抑制睾酮分泌、VII-VIII期的生精细胞首先发生凋亡[19]。另有研究结果显示,切除大鼠垂体后,体积明显缩小,发生停滞在初级精母细胞阶段,给予大剂量的外源睾酮可重新诱导发生。给予成年大鼠甲氧乙酸选择性破坏间质细胞,睾酮血清水平降低,生精细胞凋亡明显增加[20]。

3.2促卵泡激素正常发生过程需要促卵泡激素(folliclestimulatinghormone,FSH)存在。大量研究表明,FSH是灵长类发生启动的主要调节者之一,促卵泡激素被拮抗或其水平降低,都能使生殖细胞发生凋亡。FSH通过支持细胞上其唯一的受体FSHR发挥其作用。陈雪雁等[21]提取RNA进行斑点杂交发现FSHRmRNA的杂交信号全部位于支持细胞,于XIII-I期最强,VII-VIII期最弱,在II-VII期处于中等水平。可推测FSH主要作用于XII-I期,调节精原细胞的分裂和精母细胞的减数分裂过程,决定进入形成期的圆形细胞的数量。缺乏FSH导致粗线期精母细胞凋亡。Tesarik等[22]体外培养生殖细胞和支持细胞发现FSH和睾酮有作用的交叉点,睾酮可增强FSH对生殖细胞凋亡的调控作用,二者协同作用,共同维持正常的发生过程。

3.3促性腺激素释放激素丘脑下部分泌的促性腺激素释放激素(gonaditrophin-releasinghormone,GnRH)使垂体释放FSH和LH,FSH、LH分别刺激支持细胞和间质细胞做出应答,为发生创造微环境。用GnRH拮抗剂处理大鼠,生精周期特异阶段生殖细胞凋亡明显增加。Sinha-Hikin等[23]发现,给成年大鼠-GnRH拮抗剂后5天(VII-VIII阶段)和7天(VII-VIII和IX-XI阶段)生精细胞凋亡DN段明显增加,14天(I、II-IV、V-VI和VII-XIV阶段)达最高值。

3.4催乳素关于催乳素(prolactin,PRL)对生精细胞凋亡的研究相对较少,Yazawa等[24]对日本红腹蝾螈的研究发现,PRL水平提高只会导致生精周期中倒数第2期凋亡发生,推测可能是时间和细胞类型的特殊性引起的,也可能是PRL受体(PRLR)只在倒数第2期表达,或者PRLR全程都表达,只不过在倒数第2期细胞信号系统的组成跟其他期不同所致。他凋亡作用,这主要取决于FSH/PRL的比例。在分子水平上对PRL促进生精细胞凋亡的研究相当匮乏。用PRL类似物质(CHX)处理后,内caspase活性有高表达,并且可能由一种新的未经确定的caspase来介导[25]。PRL的许多功能表现为促进增生,但其促进凋亡的机制还有待进一步深入研究。

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细胞凋亡范文4

Proapoptotic activity of truncated human apoptosisinducing factor on HeLa cells

【Abstract】 AIM: To observe the expression of truncated human apoptosisinducing factor (AIF) gene and its effect on HeLa cells. METHODS: After AIF1-120 gene was successfully cloned, the shorter truncated human AIF gene (AIF1-400) was constructed by deleting the Nterminal mitochondrial localization sequence(MLS), the coding sequence of flavine adenine dinucleotide (FAD) binding domain and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) binding domain of AIF protein.The truncated human AIF gene (AIF1-400) was inserted into the pIRES2EGFP and pcDNA3 eukaryotic expression vectors, and the coexpression vectors were then transfected into HeLa cells with LipofectAMINE. The expression of the truncated AIF gene and its effect on HeLa cells were detected by fluorescence microscope analysis and MTT test. RESULTS: The eukaryotic expression vector containing the truncated human AIF (AIF1-400) gene was successfully constructed. The AIF protein could be detected in the transfected HeLa cells. After transfection, typical cell apoptotic changes were observed under an electron microscope. MTT test showed that the proliferation of HeLa cells was significantly inhibited. CONCLUSION: The expression of the truncated human AIF(AIF1-400)gene can induce the apoptosis of the transfected human HeLa cells.

【Keywords】 apoptosisinducing factor; HeLa cells; apoptosis

【摘要】 目的:观察人截短型凋亡诱导因子(AIF1-400)对HeLa细胞的促凋亡作用. 方法:在AIF1-120基因克隆成功的基础上进一步改造,构建截去AIF基因线粒体定位信号,FAD结合结构域和NADH结合结构域(1-400位氨基酸)编码序列的AIF1-400基因,将其克隆入pcDNA3和pIRES2EGFP真核表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,通过荧光显微镜观察,MTT检测等方法检测该基因在转染细胞中的表达及其对肿瘤细胞的促凋亡活性. 结果:经酶切鉴定与测序证实,带有AIF1-400的真核表达载体构建成功.瞬时转染后出现细胞形态变化,随转染时间的延长转染细胞数减少,荧光变弱. 经间接免疫荧光检测可观察到截短型AIF蛋白位于细胞质中,部分已位于细胞核内. MTT法检测发现AIF1-400转染后对细胞生长有明显的抑制作用. 结论:AIF1-400仍然具有诱导HeLa细胞凋亡的作用.

【关键词】 凋亡诱导因子;HeLa细胞;细胞凋亡

0 引言

凋亡诱导因子(apoptosisinducing factor ,AIF)是1996年发现的一种凋亡诱导蛋白,全长为613个氨基酸(aa),成熟的AIF分子为559个aa,由3部分构成:1个FAD结合结构域(122~262 aa和400~477 aa),1个NADH结合结构域(263~399 aa)和1个C末端结构域(478~610 aa). 在细胞中表达后定位于线粒体膜间隙中[1]. 当凋亡信号刺激时可检测到AIF分子从线粒体释放到细胞质,然后转位到细胞核内,直接介导细胞核发生凋亡[2-4]. 研究表明AIF介导的细胞凋亡在胚胎形成时期起重要作用[5]. 体外实验证明,显微注射AIF分子能引起分离的细胞核中部分DNA丢失,染色体周边凝集和DNA呈大片段断裂(~50 kb). 这些作用不受广谱caspases抑制剂zVAD. fmk的抑制,也不受Bcl2过量表达的影响[1],代表着独立于caspase信号通路之外的另一条凋亡途径[5]. 在成功构建AIF1-120基因的基础上[6],我们对AIF基因的结构[7]进行了进一步截短并构建AIF1-400基因,旨在研究其对HeLa细胞的促凋亡活性.

1 材料和方法

1.1材料

pcDNA3AIF1-120质粒为第四军医大学免疫学教研室构建, E.coli DH5α菌种、 人HeLa细胞系为第四军医大学免疫学教研室保存和培养;载体pcDNA3由第四军医大学免疫学教研室保存;载体pIRES2EGFP( Clontech公司);Taq DNA聚合酶,DNA限制性核酸内切酶,T4 DNA连接酶(TaKaRa公司);新生牛血清(杭州四季青生物公司);RPMI 1640及脂质体LipofectAMINETM2000( Invitrogen公司);山羊抗人AIF多克隆抗体(Santa Cruz公司);FITC标记兔抗山羊二抗(中杉公司).

1.2方法

1.2.1引物设计

根据AIF的基因序列设计引物为zy1(5′TTT GGT ACC GAA TTC CACC ATG GAG CCC AAT GTT GAG TTG GCC3′)和zy2(5′TTT TCT AGA GTC GAC TCA GTC TTC ATG AAT GTT GAA TAG3′).

1.2.2AIF1-400真核表达载体的构建

以质粒pcDNA3AIF1-120为模板,用zy1和zy2进行PCR,扩增出AIF基因 400位氨基酸密码子以后的片段. 将该基因片段经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后克隆入pcDNA3载体的相应位点, 并转化E.coli DH5α菌株, 挑克隆,提取质粒,酶切鉴定,鉴定正确的克隆由北京奥科公司测序,将测序正确的质粒命名为pcDNA3AIF1-400. 同时构建绿色荧光蛋白共表达载体pIRES2EGFPAIF1-400.

1.2.3细胞转染于细胞

转染前24 h,用胰酶消化生长至对数期的HeLa细胞,于放置玻片的24孔板中培养,待细胞达80%汇合率时进行转染. 细胞爬片先用无血清RPMI 1640洗2次,加0.5 mL无血清RPMI 1640. 将1 μg pIRES2EGFPAIF1-400质粒DNA和2 μL LipofectAMINETM2000分别加于50 μL无血清RPMI 1640中,轻轻振摇5 min,混匀,制成转染液,室温静置20 min后,将转染液逐滴加入爬片细胞中,轻轻混合,置37℃孵育6 h,弃去转染液,加含100 mL/L新生牛血清的RPMI 1640. 分别于转染后24,48和72 h取出玻片,用40 g/L多聚甲醛固定5~10 min后,于荧光显微镜下观察细胞形态. 对照组细胞转染pIRES2EGFP空载体,处理方法与实验组相同.

1.2.4间接免疫荧光检测

将HeLa细胞加至24孔板的玻片上,用脂质体法转染pcDNA3AIF1-400,同时转染pcDNA3AIF1-120作为阳性对照,pcDNA3作为阴性对照,于转染后48 h取出爬片,用PBS(pH7. 4)洗3次,40 g/L多聚甲醛固定5~10 min,再经3 mL/L TritonX100穿膜处理后,依次加入1∶100的山羊抗人AIF蛋白的多克隆抗体和1∶100的FITC标记的兔抗山羊二抗. 以PBS洗后,将细胞爬片倒置于载玻片上于荧光显微镜下观察.

1.2.5MTT法测定细胞存活率

将HeLa细胞接种于96孔板中,脂质体法分别转染pcDNA3,pcDNA3AIF1-400. 每孔转染0.2 μg质粒DNA,于37℃,50 mL/L CO2孵箱中培养,分别于转染后24,48,72和96 h进行MTT检测. 检测时每孔加入5 g/L MTT 20 μL, 37℃孵育4 h后吸去培养液,每孔加入150 μL DMSO溶解结晶,各组均设4个复孔,检测样品的光吸收值,计算平均值,绘制生长曲线.

2 结果

2.1AIF1-400的克隆及鉴定

以pcDNA3AIF1-120质粒为模板,用引物zy1和zy2进行PCR,扩增出约为650 bp的片段(图1),与预期大小一致,将该片段克隆入pcDNA3的相应位点,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定,测序证实我们所获得的序列完全正确,命名为pcDNA3AIF1-400. 将测序正确的AIF1-400用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后克隆入pIRES2EGFP相应位点,命名为pIRES2EGFPAIF1-400(图2).

2.2AIF1-400基因在HeLa细胞中的表达分别取

pIRES2EGFPAIF1-400及pIRES2EGFP转染24,48和72 h后的细胞爬片荧光显微镜观察,瞬转后试验组与对照组相比,对照组生长状态良好,实验组细胞出现细胞形态变化,随转染时间延长,转染细胞数减少,荧光变弱(图3).

图3AIF1-400在HeLa细胞中的表达及转染后的HeLa细胞形态变化×200

2.3间接免疫荧光检测转染pcDNA3组的细胞中,AIF呈点状分布,而转染

pcDNA3AIF1-120及pcDNA3AIF1-400组的细胞中截短型AIF蛋白位于细胞质中,部分已经位于细胞核内(图4).

A: 1~3: pcDNA3组; B: 1~3: pcDNA3AIF1-120组; C: 1~3: pcDNA3AIF1-400组.

2.4AIF1-400基因对HeLa细胞增殖的影响

pcDNA3AIF1-400转染后其基因的表达对细胞生长有明显的抑制作用(图5).

3 讨论

细胞凋亡是所有多细胞生物所具有的一种基本特征,有重要的生理意义. 目前普遍认为,caspases是介导细胞凋亡的主要分子,但是在大部分应激诱导的哺乳动物凋亡模型中,caspases的抑制剂并不能完全阻止细胞凋亡的发生[8-10]. 近年来发现,有独立于caspases信号通路之外的另一条凋亡途径存在,即存在由AIF直接介导的细胞凋亡途径[4-5,11-12]. AIF在多种组织中广泛分布,基因定位于X染色体上. AIF前体蛋白在细胞内合成后,通过其N末端的线粒体定位信号可有效地穿入线粒体膜间隙,然后在102位甘氨酸处水解掉MLS,其余部分再与黄素腺嘌呤二核苷酸结合,并重新折叠为具有促凋亡潜能的成熟AIF分子. 当凋亡信号刺激时,可检测到AIF分子从线粒体释放到细胞质,然后转位到细胞核内,直接导致核的早期凋亡形态变化,包括大片段DNA断裂的产生和初期的外周染色体的凝集[1,13]. 基因敲除实验发现,AIF/γ小鼠胚胎期可致死. 在进一步体外模拟哺乳动物早期胚胎发生过程中发现,AIF的促凋亡活性是小鼠形态发生过程中胚体腔形成所必需的[5], 而且该过程是AIF独立作用的结果.

以往的研究证实AIF1-120[6]及 AIF1-352[13]等截短分子均具有促凋亡活性. 我们的研究用PCR的方法扩增出了去除AIF基因线粒体定位信号FAD和NADH结合结构域(1~400 aa)编码序列的AIF1-400基因,克隆入pcDNA3及pIRES2EGF的真核表达载体后,转染HeLa细胞.

将pIRES2EGFPAIF1-400基因瞬转HeLa细胞后,出现细胞形态变化,随转染时间延长,转染细胞数减少,荧光变弱. 经间接免疫荧光检测可观察到截短型AIF蛋白位于细胞质中,部分已经位于细胞核内. 用MTT法检测发现AIF1-400转染后基因的表达对细胞生长有明显的抑制作用.

AIF的致凋亡作用不受caspases的抑制剂(如zVAD. fmk,IAP等)的抑制,也不受上游凋亡信号的控制,具有作为肿瘤杀伤分子特殊的优越性. 我们对AIF基因进行了改造,构建了AIF1-400基因,并初步证实人AIF基因去除线粒体定位信号,FAD和NADH结合结构域后仍具有促凋亡活性,与AIF基因相比,这种截短型AIF基因由于具有分子质量小的特征,更有利于应用.

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细胞凋亡范文5

摘要:就近年来中药抑制细胞调亡的文献进行整理,从中药调控细胞凋亡途径、影响凋亡信号传导、调控凋亡相关基因表达、调控细胞因子4个方面进行系统综述。认为中药在抑制细胞凋亡方面有较好的作用。

关键词:凋亡;中药;综述

中图分类号:R2-03 文献标识码:A

文章编号:1007-2349(2007)11-0046-03

细胞凋亡(apoptosis)是一种细胞生理性死亡的形式,是多细胞有机体为保持身体组织稳定、调控自身细胞增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞自动性死亡过程,在机体的生长发育、衰老、免疫调节、内环境稳定以及肿瘤、感染、自身免疫性疾病等生理病理过程中均有重要意义。机体通过凋亡过程来清除体内不需要或有害细胞,或通过抗凋亡过程维持细胞功能。抑制凋亡在维护生命个体的稳定、抗衰老等过程中有很重要的作用。近年来有关中药抑制细胞凋亡的研究日渐增多,研究涉及缺氧、缺血等因素导致的神经系统、心脑血管、胃肠功能损伤的保护、肿瘤治疗(放、化疗)后骨髓、免疫功能损伤的防治等方面。中医药可对细胞凋亡过程的不同环节进行调节,进而抑制细胞凋亡,维持机体内平衡,阻止组织病理过程的恶化。

1 通过调控细胞凋亡途径抑制凋亡

机体内存在多条细胞凋亡的信号转导途径,其中内源性的线粒体细胞色素C途径和外源性的死亡受体途径所介导细胞凋亡是目前研究较多的途径。

1.1 通过调控线粒体细胞色素C途径抑制凋亡 许多研究结果均表明,线粒体在细胞凋亡过程中起着“主开关”作用,是最重要的途径之一,其通过Cyt-C途径诱导细胞凋亡。在细胞凋亡信号的刺激下,会使caspases激活,胞质Ca2+水平升高,产生ceramide,诸如此类的改变会直接或间接地引发线粒体通透性转变孔道(PTP)开放,使能量产生中断,线粒体内膜跨膜电位(ψm)的下降,并导致外膜破裂,释放出Cyt-C等各种活性蛋白,Cyt-C从线粒体内释放是关键的一步。胞浆内的Cyt-C在dA7P存在下,与凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)结合,诱导caspase-9前体的寡聚化,并形成凋亡体。凋亡体的形成可激活caspase-9,继而活化Caspase-3,启动Caspase的级联反应,引起细胞凋亡。

有研究以缺氧/缺糖再给氧为模型,观察清开灵注射液对神经细胞线粒体膜电位的保护作用。结果发现清开灵注射液能显著降低细胞内Ca2+浓度,抑制细胞凋亡,提高线粒体膜电位和活性,认为清开灵注射液可抑制缺氧一缺糖再给氧损伤所致的线粒体膜电位的降低、抑制神经细胞内钙超载与抑制细胞凋亡有关。

1.2 通过调控死亡受体途径抑制凋亡 凋亡还可以通过死亡受体通路介导,现知死亡受体途径主要包括Fas/FasL途径和TNFa/TNFR途径。死亡受体家族成员包括7NFRl、TNFR2、Fas/CD95、TRAlL-Rs等,当死亡受体与其相应的配基(死亡配体)特异性结合后,将凋亡信号由胞外传人胞内,在连接分子的媒介下,激活Caspase,导致细胞凋亡。

1.2.1 通过调控Fas/FasL途径抑制凋亡 中药可以通过调控Fas/FasL的表达,抑制受损细胞的凋亡。参附注射液对培养的乳鼠心肌细胞缺氧及缺氧/复氧时凋亡相关基因Fas/FasL蛋白表达影响研究发现,结果缺氧4.5h及10.5h后,心肌细胞Fas/FasL蛋白的阳性表达指数(positive expressionindex,PEI)参附注射液组明显低于缺氧组;参附注射液可通过下调Fas/FasL蛋白表达,参附注射液组还见到caspase-3活性下降,提示参附注射液抑制乳鼠心肌细胞凋亡是通过Fas/FasL-caspase-3途径实现的。

1.2.2 通过调控TNFa/TNFR途径抑制凋亡 研究还发现中药通过调控7NFa/TNFR途径抑制细胞凋亡。枸杞多糖对老年大鼠T细胞过度凋亡及相关基因表达研究发现,枸杞多糖可以下调促凋亡的TNFRl基因mRNA表达并上调抗凋亡的Bcl-2基因mRNA表达,降低老年大鼠T细胞的过度凋亡,从而改善老年大鼠T细胞过度凋亡的状态。

2 通过影响凋亡信号传导抑制凋亡

细胞抗凋亡的信号转导是在内外生存因子的刺激下,激活多种信号偶联途径的信号转导过程。常见的凋亡信号传导途径有磷脂酰肌醇-3-激酶(P13K)/蛋白激酶B(PKB或称为AKT)途径,RAS-MAPK途径,NF-κB途径,N()途径等。

2.1 P13K/PKB途径 P13K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶,PKB是P13K的靶蛋白之一,P13K与PKB是促进凋亡作用的重要调节因子;其过量表达可抑制细胞的凋亡。黄芪多糖(APS)对2型糖尿病大鼠肾组织胰岛素信号分子表达的研究发现,认为黄芪多糖降低2型糖尿病大鼠血糖水平的机制可能与提高糖尿病大鼠肾组织中胰岛素受体(InsR)、胰岛素受体底物-1(IRS-1)、P13K水平,增加组织对胰岛素的敏感性,改善胰岛素信号转导有关。

2.2 RAS-MAPK途径 丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPKS)参与细胞凋亡的信号转导过程。MAPKS级联反应包括MAPKKK,MAPKK与MAPK等3个顺序的活化过程。每一种激酶又由不同成分组成。MAPK包括ERK,jNK/SAPK,P38。有研究探讨肝星状细胞丝裂原活化蛋白激酶(HSCs MAPK)通路中ERK、JNK的活化情况,以及丹参药物血清对磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(P-ERK)、磷酸化氨基末端蛋白激酶(P-JNK)表达,肝纤维化大鼠经丹参药物血清干预后较对照组均显著降低,正常大鼠经丹参药物血清干预后较正常大鼠对照组也均显著减少。表明活化的HSCs中ERK、JNK保持着较高的磷酸化水平,两者介导的信号转导通路是HSCs活化和增殖的重要途径之一;阻断MAPK信号通路可能是丹参治疗肝纤维化的重要作用途径之一。

2.3 NF-κB途径 在大多数细胞类型中,NF-κB在胞浆中与抑制亚单位lκB结合形成无活性的复合物。在TNF诱导的细胞凋亡过程中,可刺激lκB的磷酸化作用及降解作用。使NF-κB能从复合物中释放并活化,活化的NF-κB迅速转位进入胞核,继而作用于靶基因,诱导基因表达,编码前炎性蛋白,如IFN,细胞因子,生长因子,细胞黏附因子,红细胞生成素与MHC-I类分子等,抑制NOS的生成,并诱导编码凋亡抑制蛋白C-IAPl,C-IAP2基因表达,诱导抗凋亡基因Bcl-2,Bcl-x1的表达。探讨人参皂甙对心血管疾病的保健和防治机制的研究发现,结果显示内毒素脂多糖(LPS)促使HUVEC NF-κB向细胞核内转移,人参皂甙则能阻止 LPS诱导的NF-κB核内转移;能完全阻止LPS致内皮细胞核提取物NF-κB DNA结合活性;IJs能使HUVl3C PAl-1蛋白及mRNA表达显著增强,人参皂甙则使LPS的这种作用明显减弱。认为人参皂甙对心血管疾病的防治机制之一可能是通过NF-κB途径拮抗LPS致HUVEC PAI-1的表达。

2.4 NO途径 NO对细胞的增殖与存活有双重效应。它可以通过多种机制诱导细胞的凋亡,但在一些特定环境中,NO又可在一些细胞类型中作为凋亡的潜在抑制剂。川芎嗪对多巴胺诱导PCI2细胞凋亡的保护作用的研究发现,认为川芎嗪可抑制DA引起的PCI2细胞凋亡,此作用可能与降低NO生成有关。NO的抗凋亡作用还与caspase水平有关。在死亡配体依赖与配体非依赖的凋亡中,NO均能抑制caspase的活性。黄芪、当归注射液可通过促进NO的生成、诱导caspase3表达促进体外培养的血管平滑肌细胞凋亡。同时还可通过上调bcl-2表达而抑制其阻止氧自由基破坏细胞结构,起抗细胞凋亡作用,通过抑制粘着斑激酶的表达,调节其对细胞增殖和凋亡的影响。已发现,NO在某些细胞类型的线粒体中起抗凋亡作用。如在鼠肝线粒体中,生理浓度的NO能可逆性的抑制PTP的开放,机制是通过膜的去极化与Ca2+的积聚作用。

2.5 其他 胞浆中游离的Ca2+作为第二信使在凋亡信号传递过程中起关键作用;细胞核内钙离子浓度的持续升高是导致细胞凋亡的主要原因。细胞凋亡时最显著的变化是DNA的断裂,钙离子可直接激活核酸内切酶促进DNA断裂,也可通过激活蛋白酶、磷酸酶和磷脂酶,导致染色质结构完整性的丧失。葛根素及由红参和麦冬有效成分制成的参麦注射液对脑缺血/再灌注中神经细胞均有一定的抑制作用。作用机制可能是阻断Ca2+内流和/或胞内钙库的释放。从抑制神经细胞内钙超载。

目前发现在某些细胞中,cAMP是引起细胞凋亡的信号。细胞内cAMP浓度的上升可激活cAMP依赖性蛋白激酶,使靶细胞上某些丝氨酸和苏氨酸磷酸化,从而影响这些蛋白的生物学功能,引起细胞凋亡。黄精多糖对正常小鼠血糖水平无明显影响;但可显著降低肾上腺素诱发的高血糖小鼠的血糖值;其机制可能是降低肾上腺素模型小鼠肝脏中cAMP的含量,通过抑制凋亡减轻高血糖肝脏的损害。

3 通过调控凋亡相关基因表达抑制凋亡

Bcl-2基因家族是最重要的细胞凋亡调控基因。抗凋亡基因bcl-2和bcl-xL是Bcl-2家族蛋白成员中主要的抗凋亡分子。bax基因是Bcl-2家族中重要的促凋亡基因。另外,p53、c-myc、Fas、c-fos等基因均是参与调控细胞凋亡的重要基因。有研究用黄芪注射液进行治疗贫血小鼠,提示黄芪注射液可通过上调抗凋亡蛋白Bcl-XL表达减轻骨髓有核细胞的凋亡,并促进红系、巨核系造血。丹参对持续性非卧床式腹膜透析(CAPD)相关性腹膜硬化模型大鼠腹膜间皮细胞凋亡有抑制作用,其机理是下调Fas基因的蛋白表达,上调Bcl-2基因的蛋白表达。c-los是一种转录调节因子,正常情况下在脑内水平极低。c-fos不适当的过度表达可干预细胞核的修复功能,导致细胞凋亡。有实验表明。c-fos可能诱导脑缺血一再灌流时海马CAl区细胞晚期促凋亡基因的表达,共同调控细胞凋亡,而中药有效成分葛根素可通过下调凋亡相关基因c-fos的表达,减少神经细胞的凋亡,从而具有保护神经的作用。

4 通过调控细胞因子抑制凋亡

细胞因子(cytokine,CK)是机体细胞分泌调节细胞增殖、分化与死亡的一大类因子。与凋亡有关的细胞因子有氧自由基、氧化低密度脂蛋白(OX2LDL)及某些细胞因子等。清热解毒方泻心汤可显著降低实验性AS大鼠血清MAD水平,增强SOD活性,降低OX2LDL及N()水平等,从而抑制血管细胞过度凋亡。细胞因子如TNF(Tumomecrotiefactor)具有多种生物学功能,TNF在体外可诱导肿瘤细胞、树突状细胞及大鼠肝细胞出现凋亡,其中TNF-α与凋亡的关系更为密切,能与TNF受体结合,引起细胞内贮存Ca释放,引起细胞内游离Ca2+浓度升高,从而激活Ca2+依赖性核酸内切酶,引起DNA片段断裂和细胞凋亡。此外,与凋亡有关的细胞因子还有IL-2、IFN-γ、TGFβ1,NK细胞、IL-3、IL-4、IL-6、LAF-1(白细胞黏附因子)、CAM-1(细胞内黏附分子)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、NGF(神经生长因子)、SCF(干细胞因子)、IGF-1(胰岛素样生长因子)、核转录因子xu等。黄芪对脂多糖(LPS)致大鼠急性肺损伤(AIJ)后大鼠肺组织细胞有保护作用,其机制是减少促炎因子TNF-α、IL-1β的释放,抑制肺泡上皮细胞凋亡。地黄饮子对阿尔茨海默病动物模型细胞凋亡抑制的机制,与上调核转录因子κB、hsp70mRNA的表达,抑制线粒体释放细胞色素C,控制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的激活有关。

细胞凋亡范文6

论文摘要:就近年来中药抑制细胞调亡的文献进行整理,从中药调控细胞凋亡途径、影响凋亡信号传导、调控凋亡相关基因表达、调控细胞因子4个方面进行系统综述。认为中药在抑制细胞凋亡方面有较好的作用。

细胞凋亡(apoptosis)是一种细胞生理性死亡的形式,是多细胞有机体为保持身体组织稳定、调控自身细胞增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞自动性死亡过程,在机体的生长发育、衰老、免疫调节、内环境稳定以及肿瘤、感染、自身免疫性疾病等生理病理过程中均有重要意义。机体通过凋亡过程来清除体内不需要或有害细胞,或通过抗凋亡过程维持细胞功能。抑制凋亡在维护生命个体的稳定、抗衰老等过程中有很重要的作用。近年来有关中药抑制细胞凋亡的研究日渐增多,研究涉及缺氧、缺血等因素导致的神经系统、心脑血管、胃肠功能损伤的保护、肿瘤治疗(放、化疗)后骨髓、免疫功能损伤的防治等方面。中医药可对细胞凋亡过程的不同环节进行调节,进而抑制细胞凋亡,维持机体内平衡,阻止组织病理过程的恶化。

1 通过调控细胞凋亡途径抑制凋亡

机体内存在多条细胞凋亡的信号转导途径,其中内源性的线粒体细胞色素C途径和外源性的死亡受体途径所介导细胞凋亡是目前研究较多的途径。

1.1 通过调控线粒体细胞色素C途径抑制凋亡 许多研究结果均表明,线粒体在细胞凋亡过程中起着“主开关”作用,是最重要的途径之一,其通过Cyt-C途径诱导细胞凋亡。在细胞凋亡信号的刺激下,会使caspases激活,胞质Ca2+水平升高,产生ceramide,诸如此类的改变会直接或间接地引发线粒体通透性转变孔道(PTP)开放,使能量产生中断,线粒体内膜跨膜电位(ψm)的下降,并导致外膜破裂,释放出Cyt-C等各种活性蛋白,Cyt-C从线粒体内释放是关键的一步。胞浆内的Cyt-C在dA7P存在下,与凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)结合,诱导caspase-9前体的寡聚化,并形成凋亡体。凋亡体的形成可激活caspase-9,继而活化Caspase-3,启动Caspase的级联反应,引起细胞凋亡。

有研究以缺氧/缺糖再给氧为模型,观察清开灵注射液对神经细胞线粒体膜电位的保护作用。结果发现清开灵注射液能显著降低细胞内Ca2+浓度,抑制细胞凋亡,提高线粒体膜电位和活性,认为清开灵注射液可抑制缺氧一缺糖再给氧损伤所致的线粒体膜电位的降低、抑制神经细胞内钙超载与抑制细胞凋亡有关。

1.2 通过调控死亡受体途径抑制凋亡 凋亡还可以通过死亡受体通路介导,现知死亡受体途径主要包括Fas/FasL途径和TNFa/TNFR途径。死亡受体家族成员包括7NFRl、TNFR2、Fas/CD95、TRAlL-Rs等,当死亡受体与其相应的配基(死亡配体)特异性结合后,将凋亡信号由胞外传人胞内,在连接分子的媒介下,激活Caspase,导致细胞凋亡。

1.2.1 通过调控Fas/FasL途径抑制凋亡 中药可以通过调控Fas/FasL的表达,抑制受损细胞的凋亡。参附注射液对培养的乳鼠心肌细胞缺氧及缺氧/复氧时凋亡相关基因Fas/FasL蛋白表达影响研究发现,结果缺氧4.5h及10.5h后,心肌细胞Fas/FasL蛋白的阳性表达指数(positive expressionindex,PEI)参附注射液组明显低于缺氧组;参附注射液可通过下调Fas/FasL蛋白表达,参附注射液组还见到caspase-3活性下降,提示参附注射液抑制乳鼠心肌细胞凋亡是通过Fas/FasL-caspase-3途径实现的。

1.2.2 通过调控TNFa/TNFR途径抑制凋亡 研究还发现中药通过调控7NFa/TNFR途径抑制细胞凋亡。枸杞多糖对老年大鼠T细胞过度凋亡及相关基因表达研究发现,枸杞多糖可以下调促凋亡的TNFRl基因mRNA表达并上调抗凋亡的Bcl-2基因mRNA表达,降低老年大鼠T细胞的过度凋亡,从而改善老年大鼠T细胞过度凋亡的状态。

2 通过影响凋亡信号传导抑制凋亡

细胞抗凋亡的信号转导是在内外生存因子的刺激下,激活多种信号偶联途径的信号转导过程。常见的凋亡信号传导途径有磷脂酰肌醇-3-激酶(P13K)/蛋白激酶B(PKB或称为AKT)途径,RAS-MAPK途径,NF-κB途径,N()途径等。

2.1 P13K/PKB途径 P13K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶,PKB是P13K的靶蛋白之一,P13K与PKB是促进凋亡作用的重要调节因子;其过量表达可抑制细胞的凋亡。黄芪多糖(APS)对2型糖尿病大鼠肾组织胰岛素信号分子表达的研究发现,认为黄芪多糖降低2型糖尿病大鼠血糖水平的机制可能与提高糖尿病大鼠肾组织中胰岛素受体(InsR)、胰岛素受体底物-1(IRS-1)、P13K水平,增加组织对胰岛素的敏感性,改善胰岛素信号转导有关。

2.2 RAS-MAPK途径 丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPKS)参与细胞凋亡的信号转导过程。MAPKS级联反应包括MAPKKK,MAPKK与MAPK等3个顺序的活化过程。每一种激酶又由不同成分组成。MAPK包括ERK,jNK/SAPK,P38。有研究探讨肝星状细胞丝裂原活化蛋白激酶(HSCs MAPK)通路中ERK、JNK的活化情况,以及丹参药物血清对磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(P-ERK)、磷酸化氨基末端蛋白激酶(P-JNK)表达,肝纤维化大鼠经丹参药物血清干预后较对照组均显著降低,正常大鼠经丹参药物血清干预后较正常大鼠对照组也均显著减少。表明活化的HSCs中ERK、JNK保持着较高的磷酸化水平,两者介导的信号转导通路是HSCs活化和增殖的重要途径之一;阻断MAPK信号通路可能是丹参治疗肝纤维化的重要作用途径之一。

2.3 NF-κB途径 在大多数细胞类型中,NF-κB在胞浆中与抑制亚单位lκB结合形成无活性的复合物。在TNF诱导的细胞凋亡过程中,可刺激lκB的磷酸化作用及降解作用。使NF-κB能从复合物中释放并活化,活化的NF-κB迅速转位进入胞核,继而作用于靶基因,诱导基因表达,编码前炎性蛋白,如IFN,细胞因子,生长因子,细胞黏附因子,红细胞生成素与MHC-I类分子等,抑制NOS的生成,并诱导编码凋亡抑制蛋白C-IAPl,C-IAP2基因表达,诱导抗凋亡基因Bcl-2,Bcl-x1的表达。探讨人参皂甙对心血管疾病的保健和防治机制的研究发现,结果显示内毒素脂多糖(LPS)促使HUVEC NF-κB向细胞核内转移,人参皂甙则能阻止LPS诱导的NF-κB核内转移;能完全阻止LPS致内皮细胞核提取物NF-κB DNA结合活性;IJs能使HUVl3C PAl-1蛋白及mRNA表达显著增强,人参皂甙则使LPS的这种作用明显减弱。认为人参皂甙对心血管疾病的防治机制之一可能是通过NF-κB途径拮抗LPS致HUVEC PAI-1的表达。

2.4 NO途径 NO对细胞的增殖与存活有双重效应。它可以通过多种机制诱导细胞的凋亡,但在一些特定环境中,NO又可在一些细胞类型中作为凋亡的潜在抑制剂。川芎嗪对多巴胺诱导PCI2细胞凋亡的保护作用的研究发现,认为川芎嗪可抑制DA引起的PCI2细胞凋亡,此作用可能与降低NO生成有关。NO的抗凋亡作用还与caspase水平有关。在死亡配体依赖与配体非依赖的凋亡中,NO均能抑制caspase的活性。黄芪、当归注射液可通过促进NO的生成、诱导caspase3表达促进体外培养的血管平滑肌细胞凋亡。同时还可通过上调bcl-2表达而抑制其阻止氧自由基破坏细胞结构,起抗细胞凋亡作用,通过抑制粘着斑激酶的表达,调节其对细胞增殖和凋亡的影响。已发现,NO在某些细胞类型的线粒体中起抗凋亡作用。如在鼠肝线粒体中,生理浓度的NO能可逆性的抑制PTP的开放,机制是通过膜的去极化与Ca2+的积聚作用。

2.5 其他 胞浆中游离的Ca2+作为第二信使在凋亡信号传递过程中起关键作用;细胞核内钙离子浓度的持续升高是导致细胞凋亡的主要原因。细胞凋亡时最显著的变化是DNA的断裂,钙离子可直接激活核酸内切酶促进DNA断裂,也可通过激活蛋白酶、磷酸酶和磷脂酶,导致染色质结构完整性的丧失。葛根素及由红参和麦冬有效成分制成的参麦注射液对脑缺血/再灌注中神经细胞均有一定的抑制作用。作用机制可能是阻断Ca2+内流和/或胞内钙库的释放。从抑制神经细胞内钙超载。

目前发现在某些细胞中,cAMP是引起细胞凋亡的信号。细胞内cAMP浓度的上升可激活cAMP依赖性蛋白激酶,使靶细胞上某些丝氨酸和苏氨酸磷酸化,从而影响这些蛋白的生物学功能,引起细胞凋亡。黄精多糖对正常小鼠血糖水平无明显影响;但可显著降低肾上腺素诱发的高血糖小鼠的血糖值;其机制可能是降低肾上腺素模型小鼠肝脏中cAMP的含量,通过抑制凋亡减轻高血糖肝脏的损害。

3 通过调控凋亡相关基因表达抑制凋亡

Bcl-2基因家族是最重要的细胞凋亡调控基因。抗凋亡基因bcl-2和bcl-xL是Bcl-2家族蛋白成员中主要的抗凋亡分子。bax基因是Bcl-2家族中重要的促凋亡基因。另外,p53、c-myc、Fas、c-fos等基因均是参与调控细胞凋亡的重要基因。有研究用黄芪注射液进行治疗贫血小鼠,提示黄芪注射液可通过上调抗凋亡蛋白Bcl-XL表达减轻骨髓有核细胞的凋亡,并促进红系、巨核系造血。丹参对持续性非卧床式腹膜透析(CAPD)相关性腹膜硬化模型大鼠腹膜间皮细胞凋亡有抑制作用,其机理是下调Fas基因的蛋白表达,上调Bcl-2基因的蛋白表达。c-los是一种转录调节因子,正常情况下在脑内水平极低。c-fos不适当的过度表达可干预细胞核的修复功能,导致细胞凋亡。有实验表明。c-fos可能诱导脑缺血一再灌流时海马CAl区细胞晚期促凋亡基因的表达,共同调控细胞凋亡,而中药有效成分葛根素可通过下调凋亡相关基因c-fos的表达,减少神经细胞的凋亡,从而具有保护神经的作用。

4 通过调控细胞因子抑制凋亡

细胞因子(cytokine,CK)是机体细胞分泌调节细胞增殖、分化与死亡的一大类因子。与凋亡有关的细胞因子有氧自由基、氧化低密度脂蛋白(OX2LDL)及某些细胞因子等。清热解毒方泻心汤可显著降低实验性AS大鼠血清MAD水平,增强SOD活性,降低OX2LDL及N()水平等,从而抑制血管细胞过度凋亡。细胞因子如TNF(Tumomecrotiefactor)具有多种生物学功能,TNF在体外可诱导肿瘤细胞、树突状细胞及大鼠肝细胞出现凋亡,其中TNF-α与凋亡的关系更为密切,能与TNF受体结合,引起细胞内贮存Ca释放,引起细胞内游离Ca2+浓度升高,从而激活Ca2+依赖性核酸内切酶,引起DNA片段断裂和细胞凋亡。此外,与凋亡有关的细胞因子还有IL-2、IFN-γ、TGFβ1,NK细胞、IL-3、IL-4、IL-6、LAF-1(白细胞黏附因子)、CAM-1(细胞内黏附分子)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、NGF(神经生长因子)、SCF(干细胞因子)、IGF-1(胰岛素样生长因子)、核转录因子xu等。黄芪对脂多糖(LPS)致大鼠急性肺损伤(AIJ)后大鼠肺组织细胞有保护作用,其机制是减少促炎因子TNF-α、IL-1β的释放,抑制肺泡上皮细胞凋亡。地黄饮子对阿尔茨海默病动物模型细胞凋亡抑制的机制,与上调核转录因子κB、hsp70mRNA的表达,抑制线粒体释放细胞色素C,控制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的激活有关。