细胞生物学实验总结范文1
【摘要】
目的通过体外细胞培养技术，探讨开口箭皂苷的细胞毒活性及其机制，为进行深层次研究提供依据。方法MTT比色法检测细胞活力，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。结果MTT结果显示，开口箭总皂苷、30%皂苷和70%皂苷对Hela和HepG2细胞的抑制作用显著，与阴性对照组相比有非常显著性差异（P
【关键词】 开口箭； 皂苷； MTT法； 流式细胞仪
开口箭Tupistra chinensis Bak.系百合科Liliaceae铃兰族开口箭属植物，为著名的传统中药。医学古籍记载，开口箭味甘微苦，性寒，主治劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛、月经不调、崩漏带下等症；其中中医认为月经不调、崩漏带下即是现代宫颈癌的常见症状。初步实验表明开口箭具有祛痰、抗炎、抑菌及醒酒作用［1，2］。
本实验室通过实验显示湖北省产开口箭含有甾体皂苷和甾体皂苷元，且含量较高［3］。有关研究结果表明，皂苷具有增强免疫功能、抗辐射、抑制肿瘤生长、抗炎、降血糖等广泛的生物学活性，近年越来越受人们的普遍关注。有研究证实开口箭同属植物皂苷成分有细胞毒活性［4，5］。本文旨在通过体外抗肿瘤实验，观察开口箭皂苷对宫颈癌细胞Hela细胞和肝癌细胞HepG2细胞的细胞毒活性，并通过流式细胞仪评价开口箭活性部位对Hela细胞细胞周期的影响和诱导该肿瘤细胞凋亡情况。现报道如下。
1 材料与仪器
1.1 细胞株人宫颈癌细胞（Hela）、人肝癌细胞(HepG2)均由三峡大学分子生物学研究所提供。
1.2 药品与仪器RPMI-1640为美国GIBCO公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生物材料有限公司产品；HEPES为美国Sigma公司产品；胰蛋白酶为美国GIBCO公司产品；四氮唑蓝(MTT)为美国AMRESCO公司产品；环磷酰胺 (CP，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：07020121)。酶联免疫检测仪(GENIOS TECAN)；CO2培养箱（日本三洋公司）；LD4-2A离心机(北京医用离心机厂)；96孔板(美国Cornning公司)。
开口箭根茎于2002-07采自湖北省神农架林区，经三峡大学化学与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为Tupistra chinensis Bak.，标本存放于湖北省天然产物研究与利用重点实验室（No.TC200207SNJ）。
2 方法
2.1 药物制备开口箭根茎粉碎后，用甲醇回流提取，合并提取液，浓缩后经氯仿脱脂后用水饱和的正丁醇萃取，旋转蒸发回收正丁醇，浓缩液抽干后即得到开口箭总皂苷，配成水液，过大孔树脂柱，水洗， 30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，得开口箭4部分皂苷。
分别取开口箭总皂苷、30%开口箭皂苷、70%开口箭皂苷两个样品，用PBS配制成所需浓度，依次为312.5，625，1 250，2 500，5 000，10 000 μg/ml， 70%开口箭皂苷用PBS配制成所需浓度，依次为156.25，312.5，625，1 250，2 500，5 000 μg/ml，所有受试样品均用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。环磷酰胺 (CP)用DMSO将其配置为500 mg/ml。
2.2 细胞培养 Hela和HepG2细胞用RPMI-1640培养液（另加10mmol/L HEPES、2.0 mg/mlNaHCO3、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10%新生小牛血清），于CO2孵箱中37℃，5%CO2饱和湿度下培养。贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化传代。
2.3 开口箭活性部位对Hela和HepG2细胞杀伤作用最佳实验条件的选择MTT法实验条件的初步优化，主要是对溶解药物的溶剂（水、PBS）、加药前的培养时间（6，12，24 h）、药物剂量和细胞密度进行了摸索。其中密度细胞分别取0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105个/ml，接种于96孔培养板，每孔接种100 μl，转板24 h后加不同浓度的开口箭活性部位，继续培养48 h，以MTT法测定吸光度，比较不同细胞密度的线性关系。
2.4 MTT比色法［6］MTT比色法按Mosmann氏法略加改进。将处于对数生长期的细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为0.5×105个/ml，接种于96孔培养板，每孔接种100 μl，转板24 h后加100 μl受试药，另设阴性对照组(不加药)、空白调零组（只有PBS）和阳性对照组（环磷酰胺组），每组均设3个复孔，培养48 h，吸弃上清后加MTT(5 mg/ml)100 μl，继续培养4 h后，弃去上清液，加DMSO 100 μl，用全自动酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定吸光度(OD)值［7］，求出IC50。
抑制率（%）=［阴性对照A570- 加药组A570］/ 阴性对照A570×100%
2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分1×106个细胞于培养瓶，阴性对照组0.5×106个细胞每瓶，培养24 h；吸弃部分上清后加药混匀（开口箭总皂苷、30%皂苷终浓度2 500μg/ml，70%皂苷和环磷酰胺终浓度1 250 μg/ml），继续培养48 h；于5%CO2培养箱中培养48 h后，收集上清于相应标签离心管中，各加1 ml胰酶消化，加4 ml培养液于该培养瓶中，并一起吸至各相应离心管中，各瓶加入5 ml PBS洗涤，洗涤液一起吸入相应离心管中，以2 000 r/min离心5 min；吸弃上清，加入1 ml 80%乙醇和0.5 mmol/LEDTA(Na)2的PBS混合液悬起细胞，轻轻混匀，于4℃固定30 min；弃上清，加PBS 10 ml混匀，以2 000 r/min离心5 min；用500 μl含0.1%TritonX-100 和50 μg/ml RNase的PBS悬起细胞，转置测定管中，加溴化丙锭PI 100 μl，避光染色17 min（一般15～20 min）；滤膜过滤后上机。
2.6 统计学处理 实验数据以 ±s表示，数据分析采用SPSS10.0统计软件进行。用Origin软件，通过半对数拟合直线求IC50值。
3 结果
3.1 开口箭活性部位对Hela和HepG2细胞杀伤作用最佳实验条件的选择为了得到相对稳定并且可靠的实验结果，通过前期预实验并结合大量资料，对该MTT法实验条件进行了初步优化，主要是对溶解药物的溶剂、加药前的培养时间、药物剂量和细胞密度进行了探索。对于溶剂，最初采用的溶剂是水，通过对照发现溶解药物的水对细胞的影响很小，但并非没有，所以正式实验采用PBS溶解药物；对于加药前的培养时间采用了6，12，24 h 3个时间，通过显微镜观察发现加药前培养24 h细胞状态良好，由此选用了加药前培养24 h；对于药物剂量，通过多次预实验，最终选择了最高浓度开口箭总皂苷、30%皂苷为10 000 μg/ml，70%皂苷为5 000 μg/ml，而环磷酰胺为20 000 μg/ml；对于细胞密度，通过多次预实验，采用5种细胞密度即0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105个/ml，同样的药物浓度情况下，开口箭活性部位对Hela细胞生长抑制呈最好线性关系的细胞密度是0.5×105 个/ ml，由此选择最佳细胞浓度是0.5×105个/ml。通过这些因素的优化，从而初步排除了其他非药物因素对细胞的影响；而且这两种肿瘤细胞的MTT实验在同一批进行实验，排除了不同环境的干扰，从而得出以下实验结果。
3.2 开口箭活性部位对Hela细胞的影响结果见表1。表1 开口箭皂苷对Hela细胞的抑制作用（略）
由表1可以看出，和阳性药环磷酰胺相比，开口箭总皂苷、30%皂苷、70%皂苷对Hela细胞的抑制作用显著，与阴性对照组相比有非常显著性差异（P
3.3 开口箭活性部位对Hela细胞流式细胞术分析结果见图1及表2。表2 开口箭皂苷对Hela细胞流式细胞仪分析数据（略）
从该原始图谱可以看出，阴性对照组Hela细胞细胞状态良好，由于药物浓度较高，尤其是开口箭总皂苷、70%皂苷中的凋亡峰急剧上升，这说明高浓度开口箭总皂苷、70%皂苷可以诱导肿瘤细胞坏死。
从表2可以看出， 2 500 μg/ml开口箭总皂苷、30%皂苷，1 250 μg/ml 70%皂苷和环磷酰胺作用于Hela细胞，通过和阴性对照组比较，开口箭总提取物、总皂苷、30%皂苷、70%皂苷、环磷酰胺主要使Hela细胞细胞周期阻滞于S期并能诱导肿瘤细胞凋亡。
3.4 开口箭活性部位对HepG2细胞的影响 结果见表3。表3 开口箭皂苷对HepG2细胞的抑制作用（略）
由表3可以看出，和阳性药环磷酰胺相比，开口箭总皂苷、30%皂苷、70%皂苷对HepG2细胞的抑制作用显著，与阴性对照组相比有非常显著性差异（P
4 讨论
MTT法是目前抗癌药物体外筛选较好的方法，方法简便、快速，所需细胞数较少，便于大规模进行药物敏感实验。本实验采用MTT法评价开口箭活性部位的细胞毒作用，四甲基偶氮唑盐（MTT）法与其它初筛方法如台盼蓝计数法相比具有主观性低，简便易行等优点，因此被广泛用于抗肿瘤药物的初筛。在优化的实验条件下，采用环磷酰胺做阳性对照，通过对人肝癌细胞HepG2和宫颈癌细胞Hela细胞的MTT实验，结果显示开口箭总皂苷、30%皂苷和70%皂苷能够使显著抑制体外培养的Hela和HepG2细胞株，与阴性对照组比两者各浓度组均有非常显著性差异（P
采用流式细胞术评价开口箭活性部位对Hela细胞细胞周期的影响和凋亡情况，最初采用的是70%乙醇固定过夜，但实验发现该方法容易使细胞成团，而且测出的凋亡峰比较高，由此改进为本实验中的实验方法，细胞成团的情况得到改善，但是凋亡峰明显降低。结果表明，开口箭总皂苷、30%皂苷、70%皂苷和环磷酰胺能够诱导体外培养的Hela细胞凋亡，且高剂量的开口箭总皂苷、70%皂苷能够引起细胞坏死；开口箭总皂苷、30%皂苷、70%皂苷和环磷酰胺都能使Hela细胞细胞周期阻滞于S期，提示开口箭总皂苷、30%皂苷、70%皂苷能诱导人宫颈癌细胞分化。
从植物中寻找抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物，在国内外均为抗肿瘤药物研究的重要组成部分。国际上普遍认为最理想的抗癌药物是那些通过刺激机体自身免疫系统而发挥正常防癌功能的药物。目前应用于临床的抗肿瘤化疗药物多数对机体免疫能力起抑制和破坏作用，在杀灭机体内癌细胞的同时也损伤机体正常组织，副作用大［8］。大量临床和实验资料显示，皂苷具有免疫调节作用。另据文献报道开口箭对S180和HepG2肿瘤细胞株有明显的抑制作用［9］；本实验发现开口箭皂苷对Hela和HepG2细胞有较强的细胞毒作用，而且开口箭皂苷能够诱导Hela细胞凋亡，且能够将Hela细胞细胞周期阻滞于S期从而诱导Hela细胞分化。因此对开口箭皂苷的抗肿瘤作用及机制值得进一步研究。
参考文献
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细胞生物学实验总结范文2
【摘要】 目的观察马齿苋活性成分对人肺腺癌细胞系(a-549 cell)、人喉表皮样癌细胞系(hep-2 cell)、人宫颈癌细胞系(hela cell)和人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系（rd cell）生长的影响。方法体外培养条件下用不同浓度的马齿苋活性成分处理4种癌细胞，通过溴化二甲噻唑二苯四氮唑（mtt）试验法测定癌细胞的增殖；同时处理s180荷瘤小鼠，观察荷瘤小鼠的体重、瘤重、死亡率和抑瘤率。结果马齿苋生物碱对离体培养的a-549肺癌细胞、hela细胞和hep-2细胞的增殖均具有明显抑制作用,马齿苋多糖对hela细胞有较强的抑制作用, 马齿苋脂肪酸对hep-2细胞有一定的抑制作用，马齿苋黄酮对rd细胞有很强的抑制作用，并存在浓度剂量效应，高浓度抑制作用强。结论马齿苋活性成分能选择性地杀伤癌细胞，有进一步研究的潜在价值。
【关键词】 马齿苋； 活性成分； 溴化二甲噻唑二苯四氮唑试验； 抗肿瘤活性
abstract：objectiveto observe the effects of the active constituents from portulaca oleracea l. on the proliferation of four human tumor cell lines. methodsthe anti-proliferation activities of active constituents from portulaca oleracea l. upon a549 cell, hela cells, hep-2 cell and rd cell were analyzed by mtt in vitro．body weigt, tumor weigt, inhibition rate and death rate of these active constituents from portulaca oleracea l. on the transplanted tumor cells of sarcinoma 180 were observed in mice.resultsraw screening of the four compounds by mtt indicated polysaccharides, flavonoids, alkaloids and polyunsaturated fatty acid exerted obvious suppression on the proliferation of tumor cell lines in a dose dependent manner, respectively. the experiments in vivo indicated that the four active constituents had certain inhibition against the cells of implanted tumor ascites sarcinoma 180. conclusionthe active constituents from portulaca oleracea l. have selective cytotoxicity to the tumor cells and is worthy of further investigation.
key words：portulaca oleracea l.; active constituent; mtt assay; antitumor effect
恶性肿瘤是目前危害人们生命和健康的严重疾病之一，而化学合成的抗癌药常常对人体正常细胞产生毒副作用，因此从天然动、植物中寻找毒性低、疗效高的抗癌活性成分仍是近年来国内外科学工作者研究的热点之一。药食两用植物马齿苋含有去甲基肾上腺素、生物碱、香豆精类、黄酮类、多糖、多不饱和脂肪酸等活性成分［1］，其中马齿苋多糖具有抗癌作用已被报道［2，3］。为了探讨马齿苋其它活性成分的抗癌作用，本实验对马齿苋总提取液、多糖、总黄酮、生物碱、不饱和脂肪酸等活性成分进行了体内和体外抗癌作用实验研究, 对马齿苋活性成分的抗癌活性进行初步筛选，为进一步系统研究马齿苋的药用价值提供理论依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器与试剂rpmi 1640培养液：美国gibco公司产品；胎牛血清（fbs）：杭州四季青生物工程有限公司产品； 溴化二甲噻唑二苯四氮唑 (mtt)、胰蛋白酶和二甲基亚砜(dmso)为amresco公司产品；其余试剂均为国产分析纯(国药集团)。倒置荧光显微镜(ix-71)：日本olympus产品；二氧化碳培养箱(thermo forma series-ii，美国 thermo scientific，forma公司)产品；全自动酶标仪(multiscan mk3, labsystems公司)产品。
1.2 材料新鲜马齿苋portulaca oleracea l.于2005-09购于江西省南昌市农贸市场，经本校药学院药理学教研室鉴定。用清水洗净，沥干水分，60℃鼓风干燥6 h，粉碎备用。称取上述备用马齿苋干粉50 g，加蒸馏水（按1∶30的比例分3次加蒸馏水），煮沸后煎20 min，取其上清液减压浓缩使其生药浓度为2 g/l，得粗提取液，置4℃冰箱保存备用。同时，称取相同重量的马齿苋干粉，分别采用周晶［4］、上官新晨［5］、黄阿根［6］等的方法提取马齿苋粗多糖、不饱和脂肪酸、生物碱、黄酮及定量，所得样品4℃干燥保存备用。临用时配制使用。
2 方法
2.1 细胞株及体外抑瘤作用观察
2.1.1 肿瘤株选用人肺腺癌细胞(a-549 cell)和人宫颈癌细胞(hela cell) 由南昌大学医学院第二附属医院细胞研究室友情提供，人喉表皮样癌细胞(hep-2 cell)和人恶性胚胎横纹肌瘤细胞（rd cell）由江西省疾控中心友情提供。
2.1.2 马齿苋活性成分对a-549 细胞生存能力的影响选对数生长期的a-549细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后，用含10％fbs的rpmi1640培养液制成5×104个细胞/ ml，接种于96孔板中培养24 h后， 吸去上清液。阴性对照组加入同体积的未添加马齿苋活性成分的培养液；实验组分别加入含有终浓度为10， 50， 100， 200 μg/m1的总提取液、多糖、不饱和脂肪酸、生物碱、黄酮的培养液处理4 h后，更换培养液继续培养24 h，采用mtt法间接测定癌细胞生存能力［7］，按公式计算其抑瘤率。抑瘤率(％)=［(对照组a值一实验组a值)／对照组a值］×100%。
2.1.3 马齿苋活性成分对hep-2细胞、hela细胞和rd细胞的作用实验方法与“2.1.2”项基本相同，不同之处是：取指数生长期的hep-2 cell、rdcell和hela cell，用含10% fbs的dmem培养液配制成1×105个细胞/ml悬液，接种于96孔板中，随后的处理同“2.1.2”项。
2.2 实验动物及体内抑瘤作用观察
2.2.1 实验动物及瘤株昆明种小鼠，雌雄各半，5周龄，体质量19～23 g，由江西省医学实验动物中心提供(合格证号：021-97-03)，一级动物。实验小鼠肉瘤s180腹水型瘤株由江西省医学实验动物中心提供。
2.2.2 小鼠s180实体瘤模型建立与分组s180肉瘤细胞接种选择接种s180细胞后1周的小鼠脱颈椎处死，无菌条件下抽取腹水，用生理盐水调节细胞浓度至1×107 个细胞/ml。以每只小鼠0.2 ml接种于小鼠右腋下皮下。将动物随机分为6组，每组6只，其中一组为阴性对照组，其余5组为实验组。
2.2.3 马齿苋活性成分对小鼠s180移植性实体瘤的影响阴性对照组每日腹腔给予等量的生理盐水（0.2 ml/d），实验组分别每日腹腔给予100 mg/kg·b.w.的马齿苋总提取液、多糖、总黄酮、生物碱和不饱和脂肪酸。接种肿瘤24 h 后给药，连续14 d，分别于实验开始和实验结束时称小鼠体重并记录。实验结束后，脱颈椎处死小鼠剥离肿块，称瘤重，并计算肿瘤生长抑制率。
2.3 统计学处理实验结果以±s表示，计量资料用方差分析法分析，用t检验统计处理。p<0.05被认为两变量之间有统计学显著性差异。
3 结果
3.1 马齿苋活性成分对a549细胞的抑制作用结果见表1。终浓度为100 μg/ml和200 μg/ml的马齿苋生物碱对a549肺癌细胞的增殖具有明显抑制作用，抑制率分别为15%和28%，与对照组相比均有显著性差异，呈现浓度依存性抑制关系。马齿苋总成分、多糖、脂肪酸和黄酮各剂量组对a549细胞无明显的抑制作用。表1 马齿苋活性成分对a549细胞体外增殖的影响（略）
3.2 马齿苋活性成分对hela细胞的抑制作用马齿苋多糖和生物碱对宫颈癌hela细胞均有较强的抑制作用，终浓度为100μg/ml和200μg/ml的马齿苋多糖对hela细胞增殖的抑制率约为18%～30%，而马齿苋生物碱对hela细胞增殖的抑制率约为35%，且与药物浓度呈正相关（见表2）。表2 马齿苋活性成分对hela细胞体外增殖的影响（略）
3.3 马齿苋活性成分对hep-2细胞的抑制作用马齿苋脂肪酸和生物碱对hep-2细胞体外增殖有一定的抑制作用，有随着浓度的增加抑制作用增强的趋势。但马齿苋黄酮对hep-2细胞没有抑制作用。相反，在10～100 μg/ml浓度范围内，有促进hep-2细胞增殖的作用见表3。表3 马齿苋活性成分对hep-2细胞体外增殖的影响（略）
3.4 马齿苋活性成分对rd细胞的抑制作用马齿苋黄酮对rd细胞体外增殖有很强的抑制作用，其抑癌效果与剂量呈正相关，在终浓度达200 μg/ml时，抑制率达50%。但马齿苋总成分、多糖、脂肪酸和生物碱对rd细胞没有显著抑制作用。见表4。表4 马齿苋活性成分对rd细胞体外增殖的影响（略）
3.5 马齿苋活性成分对小鼠肿瘤生长的抑制作用马齿苋活性成分对小鼠s180移植性实体瘤的影响由表5可以看出，各活性成分对肉瘤均有一定的抑制作用，各成分处理组小鼠平均瘤重均明显低于对照组(p<0.01，p<0.001)，其中黄酮抑制作用最强，达38%。同时，荷瘤小鼠的死亡率得到明显抑制，生理盐水处理组小鼠在实验结束时小鼠死亡率为50%，马齿苋生物碱、黄酮、多糖、脂肪酸和总成分提取液处理组小鼠15 d后的死亡率分别为0，16.7%，16.7%，33.3%和33.3%（见表5）。整个实验过程中不伴有体质量降低或其它副作用现象出现。表5 马齿苋活性成分对小鼠肿瘤生长的抑制作用（略）
4 讨论
近年来资源丰富，有效低毒的植物多糖作为抗肿瘤活性物质已成为人们研究的热点。马齿苋多糖体外实验对人肝癌细胞株smmc7721［2］和bel-740［3］的增殖具有一定的抑制作用，但对小鼠结肠癌细胞株cocon-26无明显的抑制作用［3］，提示马齿苋多糖的抗癌作用具有选择性。本次实验结果表明，马齿苋多糖可抑制hela肿瘤细胞增殖，但对a-549细胞、hep-2 细胞和rd细胞无明显的抑制作用，再次证明了马齿苋多糖对肿瘤细胞株的直接抑制作用具有选择性。其抑瘤作用的机制可能与增强免疫功能和提高抗氧化能力有关［2，3，8］。
对黄酮类化合物抗癌抗肿瘤作用的研究由来已久，本文首次报道了马齿苋黄酮类化合物对人恶性胚胎横纹肌瘤细胞rd体外增殖有很强的抑制作用，但对a-549、hela 和hep-2细胞没有明显的抑制效果，表明马齿苋黄酮类化合物对肿瘤细胞株的直接抑制作用具有选择性。其抗癌作用的机制可能与其具有自由基和抗氧化作用有关［9］。
近年来的研究发现多种植物生物碱具有抗肿瘤活性作用［10］。本实验首次发现马齿苋生物碱对人a-549、hela和hep-2细胞的增殖，以及荷瘤小鼠的肿瘤生长均具明显的抑制作用，但对rd细胞没有抑制效果，对瘤株的抑制作用具有广谱性和选择性。但其抗肿瘤作用的机理及抗瘤谱值得进一步深入研究。
早期研究发现多不饱和脂肪酸（pufa）具有抑制肿瘤细胞生长的作用，近期有学者认为不同种类pufa的作用也存在差异，n-3 pufa可抑制肿瘤生长，而n-6 pufa的作用则相反［11］。在本研究中，马齿苋脂肪酸（n-3 pufa）对hep-2细胞增殖有抑制作用，实验结果与有关n-3 pufa的报道一致［11］。
综上所述, 不同的活性成分对肿瘤细胞株的敏感性不同，具有明显的选择性。目前关于马齿苋活性成分为何对瘤株具有选择性和究竟是通过何种机制抑制肿瘤细胞的还不十分清楚，本课题组正进一步对其进行深入研究，期待为更好开发利用马齿苋活性成分提供更全面的理论依据。
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细胞生物学实验总结范文3
在生物教学中注重概念教学情景的创设，简捷地导入教学内容。教师在概念教学中，引导学生自己总结出概念，使生物概念、原理的学习水到渠成。教学实例：冀教版“细胞的分裂与生长”一节中的核心概念是生物体通过细胞的不断分裂，细胞的数目增多，通过细胞的生长，细胞的体积增大，经过一系列的变化，生物体由小长大。这个核心概念对于初一的学生来说过于抽象，如何把生物体是如何由小长大的这个抽象概念具体化、形象化，设计概念教学情境播放动、植物细胞分裂的动画，学生通过观看细胞分裂过程的动画，观察细胞分裂的特点，可以自己总结出细胞分裂的概念，并能总结出细胞分裂最终的结果是细胞数目的增多。实验教学情境引出核心概念，例如，学生分组制作不同部位的洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片，课件展示不同部位的细胞，学生观察找出这些细胞有什么不同。通过学生的观察可以总结出细胞生长的概念、细胞在生长的过程中体积由小长大。
二、画概念图分析概念之间的联系，有助于概念的迁移
在教学过程中，教师可以把讲授的概念内容在黑板上绘制成概念图。概念图的绘制，改变了学生的认知方式，学生对所学的知识体系一目了然，建构了知识的整体框架。概念图的绘制使学生更能清晰地分析出概念之间的联系，以及新旧知识间的联系和区别，这样有利于新旧知识的整合，促进有意义学习，最终达到知识的有效迁移。例如，冀教版七年级下册“神经调节的基本方式———反射”这节课反射的概念、反射弧的组成、反射和反射弧的关系是本节的重要概念。通过概念图的讲解，学生对本节的重要概念形成了系统的知识网络，不再是死记硬背，机械的记忆，概念图还总结了前面章节中学过的神经系统的组成，在复习旧知识的同时又学习了新的知识，达到知识的迁移，促进学生有意义的学习。
三、动手制作生物模型加强感性认识，使知识经验化、直观化，有助于概念的形成
新课程理念认为学习是一个主动建构知识的过程。实物能最直观、最有效地表述生物的特征，能够让学生充分地理解事物；一种好的记忆方法、好的讲解方法都能够让学生根深蒂固地记住事物。教学实例：冀教版七年级上册“细胞的结构”一节，在讲细胞的结构时，我课前先准备好琼脂、培养皿、花生、绿豆、芸豆、小麦、塑料膜等实验材料，让学生自己动手制作细胞模型，制作完成后，再由代表讲解所制作的细胞模型是哪种生物的细胞，其中所选的实验材料代表细胞的哪些结构。学生在亲自动手制作细胞模型的过程中，建构了细胞结构的组成这个核心概念，加深了对动物细胞和植物细胞的区别这个知识的理解。
四、在生物概念教学中利用“归纳”教学模式，注重重要概念的建构
细胞生物学实验总结范文4
[关键词]细胞生物学；医学检验；实验教学；教学改革
[作者简介]黄蕾（1983—），女，江苏赣榆人，本科，实验师，研究方向为实验教学；王芳（1974—），女，江苏扬州人，博士，教授（通信作者），研究方向为免疫学。
[中图分类号]G640[文献标识码]A[文章编号]1674-9324（2020）37-0383-02[收稿日期]2019-12-17
细胞生物学作为当前生命科学领域中最活跃、最富有发展前景的学科之一，细胞生物学的研究方法、技术在医学基础科学研究中处于重要的地位[1]。南京医科大学医学检验技术专业在基础医学阶段开设了细胞生物学这门课程，侧重讲授了细胞生物学理论知识，然而在专业课学习阶段，很多学校并没有开设细胞生物学实验技术这门课程，大多数高校认为细胞生物学实验技术对于临床常规检验工作无直接关联，且开设这门课的硬件和软件要求都较高，对于本科阶段的学生没有开设的必要性。
南京医科大学医学检验学系自2001年招收本科生以来，一直关注学生动手实践能力的训练，拓展学生的知识面和毕业后的就业广度。在此过程中，我们发现越来越多的学生对科学研究充满兴趣，本科毕业后进入科研机构、研究室以及升入硕士研究生阶段的学生比例逐年递增。细胞生物学实验技术是一门与生命科学密切相关的基础研究手段，因此，我们认为开设细胞生物学实验技术这门课很有必要，并且在专业发展的十几年里不断学习，总结经验得失，改革教学的内容与形式，使得课程设置更具有科学性，让学生在最精简的课时里获得最优化的教学效果。
一、改革经验
本学系自设置细胞生物学实验技术课程后，经过十几年的教学实践和探索，总结出以下几方面的教学经验：
（一）教学模式的改革，培养学生的科研思维
运用科研思维可以让学生更深入地了解科学，增加学习热情，明确发展方向，提高教学效率，让实验内容由验证型向研究创新型转变[2]。本学系实验室是“江苏省医学检验学实验教学示范中心”“中央与地方共建高校特色优势学科实验室”及“江苏省高等学校特色专业建设点”，不仅承担本科生的实验教学，还承担了硕士、博士研究生的科研培养。同时，本学系采用的是“系科合一”的模式，即医学检验系设在南京医科大学第一附属医院医学检验学部，检验专业主干课程的老师多来自临床检验一线医生和技术人员，师资力量雄厚。但是考虑到每年的本科生人数较多，而传统意义上的大课教学特别是实验教学无法兼顾到每个学生，不利于引导和挖掘在本学科上有特长的学生。因此，我们在教学模式上进行改革，将本科生教学和研究生教育结合起来，相互促进。具体做法：将本科生划分为每四人为一小组，让硕士研究生以教学助教的身份参与到实验课带教中，形成一个学习小组，指导本科生查阅细胞生物学技术方面的文献，指导学生实验操作，引导学生的科研思维。研究生在助教的过程中也得到了锻炼和成长，促进教学相长。
（二）以细胞培养技术为主体的实验课内容改革
细胞培养技术是细胞生物学研究的基础，因此我们将细胞培养技术作为细胞生物学实验技术实验课程的主要内容。我们在多年的教学过程中，根据学生的反馈以及相关学科的融合，不断改革与调整课程内容，形成了现在的实验教学课程体系。在此体系中，包含了细胞提取、培养、换液传代、冻存复苏、细胞融合和单抗制备技术，由浅入深展开，有助于学生以后在科学研究方向的发展。
（三）建立细胞生物学实验技术特色的考核评定模式
实验考试是考核学生掌握实验知识与技能的一种手段，是检查教师教学工作、了解教学成果、总结教学经验、改进教学方法的一个重要途径[3]。以往的实验教学考核主要根据最后一次的实验考试成绩及每次实验报告分数来评定，导致难以调动学生的学习积极性与主动性，并且一次考试的成绩存在偶然性，不利于考查学生对知识、动手操作技能的掌握程度。因此，我们采用“全程考核”的模式动态考核学生的学习成绩，这样的考核模式更全面客观，更具公平性。具体做法：将实验考核成绩分为三个部分，第一部分，以学习小组为单位，由研究生助教根据每位小组成员在每次课程学习过程中的表现打分，再结合每位成员的细胞生物学方面的文献汇报评分，最终评定一个分数；第二部分，分为实验理论知识答题和实验技能考核两个部分。以随机抽题的方式回答两个问题，老师根据学生的回答情况评分。同样以随机抽取的方式让学生抽取一个实验操作试题，老师根据学生实验操作的流程是否规范以及操作的手法是否流畅来评分，最终将这两个分数汇总评定为实验考试分；第三部分，学生平时表现分，包含考勤、课堂回答问题、动手操作情况及实验报告评分等。汇总这三部分的考核分即为学生的实验课成绩。通过多样式的考试模式，能较客观地反映学生的学习成效，调动了学生的自主学习兴趣，同时也丰富了教学形式，课程中充满了挑战和趣味性，学生对我们的课程反馈良好。
二、改革成效
我们在数年的教学过程中不断总结，在教学改革中取得了一定的成果。我们以细胞培养技术为切入点，让参加的学生参与导师的课题研究，这样的形式非常有助于我们发掘科研的好苗子，近年来我们有多名学生在本科阶段申请到学校《大学生创新实验》课题项目，发表SCI论文以及获得发明专利，取得了许多教学成果[4]。我们的本科学生经过训练，在研究生招生面试中更具竞争力，近年来保研、考研的人数逐年递增，导师们对学生评分很高。
三、改革方向
通过多年的努力，我们在课程教学改革中取得了一定的成果，未来我们将在以下几个方面推进教学改革。
1.针对课程内容较单一现状，将进一步提高实验课时比例，而理论课课时的不足将通过引导学生上网课、微课以及开选修课的形式来补充。
2.与学校医学模拟中心合作，尝试开展新型的虚拟实验的教学形式，便于我们开设那些现有实验室条件下无法开展的实验课程，丰富我们的教学形式和教学内容。
3.通过调查发现，本专业细胞生物学实验技术这门课各高校开展情况不同，并且缺少统一的教材，我们希望推广这门课，并联合其他院校一起制定适合本专业的统一教材。
细胞生物学实验总结范文5
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细胞是构成生物体结构和功能的基本单位，细胞的结构和功能是教学的重点。学生在初步学会显微镜使用技能后，迫切想要观察细胞的结构，而观察细胞的前提是做好临时装片，所以制作临时装片是这节课的重点和难点。学生在掌握了制作洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片的方法步骤后，对其他材料的临时装片的制作就有的放矢，有利于教师进行“观察植物细胞结构”的探究式教学。
2 教学目标
2.1 知识目标
学会制作临时装片的基本方法，使用显微镜观察自己制作的临时装片，认识并阐明植物细胞的基本结构；初步学会绘制植物细胞结构简图。
2.2 能力目标
通过观察、讨论、猜测、类比等方法，培养勇于探索、积极思维的好习惯和自主学习、合作探究的能力。
2.3 情感、态度与价值观目标
激发自主学习的兴趣，培养实事求是的科学态度；体验相互合作的重要性。
3 教学重点和难点
探究正确制作临时装片、观察植物细胞结构的方法步骤；比较和归纳植物细胞的结构；绘制植物细胞结构简图。
4 教学过程
本节的实验教学采用探究性学习的模式，突显实验的“探究”功能，旨在改变学生的学习方式，变学生的被动接受式学习为自主探究式学习，变学生的个人独立学习为多方合作学习，由此培养学生的合作能力、探究能力、实践能力和创新精神。教学流程如下。
4.1 复习巩固显微镜的使用
学生思考显微镜的组成及正确使用显微镜的方法步骤，为观察细胞结构作准备。教学中，教师鼓励学生大胆到前面来展示显微镜的操作步骤，并对学生容易出错的地方加以纠正。
4.2 创设情境，引入实验教学
教师提问：同学们，当你们学会使用显微镜后，一定很想看一下构成植物体的基本结构单位――细胞的真面目吧？大家想想怎么看呢？教师以问题引入新课。
4.3 探究观察植物细胞结构的方法和步骤
4.3.1 探究活动一：观察洋葱鳞片叶内表皮细胞结构
教师：试想一下，把一片洋葱或一片叶子直接放到显微镜下，能看清内部结构吗？
学生：随手把一小块洋葱或把一片叶子放在显微镜下观察，发现看不到。
教师：为什么看不到呢？
学生：太厚，挡住光线。
教师：是的。显微镜下观察的材料应该是薄而透明的，我们应该把观察的材料制成玻片，放在载物台的通光孔中央，通过反射光直接传递到目镜，这样才有可能看到物像。
学生：讨论撕下表皮来看，也有的想切成薄片来看。
教师：让学生先撕下洋葱鳞片叶内表皮制成装片，然后自学和讨论“观察细胞结构的方法步骤”。
学生开始自学课文，尝试制作洋葱鳞片叶表皮细胞的装片，教师巡回指导。有的学生撕下洋葱表皮后直接放到载玻片下，发现表皮卷起来了。教师问：卷起来能看清表皮细胞结构吗？学生说：不行。于是，学生就先在载玻片中央滴一滴清水，让材料平展开来。有的学生不染色就看了，发现效果不好，于是理解应该正确染色后观察效果好。在学生自学课文后，有的学生还是在染色、吸染液、盖盖玻片中出现一些错误的操作，此时，教师就及时而有耐心地提醒、启发和引导学生逐步到位。教师把做得比较好的或存在问题的装片通过显微投影展示出来，总结学生实验中的成功和不足之处。在这一实验中，教师改掉先向学生示范制作过程，再让学生动手操作的一贯做法，引导学生通过自学和探究、讨论和交流、自我发现问题和解决问题。事实证明，学生通过多次尝试，达到了比较好的实验效果。最后，教师播放视频，让学生回顾总结制作洋葱鳞片叶内表皮装片的整个过程。
4.3.2 探究活动二：观察青菜叶片表皮细胞结构
在完成了制作和观察洋葱鳞片叶表皮装片的实验后，教师在课堂中增设了观察青菜叶片表皮细胞结构的实验，进一步培养学生勤于动手、乐于探究、创新思维的能力。学生手拿叶片，思考：如何观察叶片的细胞？叶片的表皮细胞结构是否和洋葱磷片叶表皮细胞结构一样呢？教师让学生先相互讨论、设计方案，然后来交流各组的设计方案。在如何取材方面，学生们讨论出三种做法：切薄叶片、撕表皮、刮取部分叶肉后观察细胞结构。学生讨论，得出取材后的操作步骤如同观察洋葱鳞片叶内表皮结构的步骤。在讨论青菜叶表皮细胞与洋葱鳞片叶内表皮细胞结构是否一样的过程中，学生们作出了2种假设：可能一样，也可能不一样。最后教师让学生尝试斜向撕下叶片的上表皮或下表皮后进行观察，有的学生还尝试用刀片刮掉叶肉后观察。实验中，有学生提出是否要染色。教师让学生通过自行探究来得出结论。学生通过实验探究发现不染色的比染色的观察效果好，教师指出：如果本来就有颜色的，就不必染色。整个实验过程完全是让学生进行探究、操作，教师利用显微投影展示学生的实验结果，进一步提高了学生动手实验的积极性。
4.3.3 探究活动三：观察黄瓜表层果肉细胞的结构
这又是一个补充性的探究性实验，学生通过以上2个实验的操作后，经过反复讨论、多次尝试，最后通过教师补充，得出如下的实验步骤：用洁净的纱布擦净载玻片和盖玻片用滴管在载玻片的中央滴一滴清水用刀片将洗净的黄瓜表皮刮掉洗净刀片后，用刀片轻轻刮取少许黄瓜表层果肉将刮取的少许黄瓜果肉碎屑均匀地涂抹在载玻片的水滴中正确盖上盖玻片放到显微镜下观察。
在每一次观察完一种细胞结构后，教师都要求学生实事求是地把自己在显微镜下看到的细胞图片画出来，指出名称，然后比较所画的图片。通过比较图片，学生们总结出植物细胞都有相同的基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核和液泡。
5 教后反思
5.1 转变教师教学观念
长期以来，由于受应试教育的影响，教师只重视“教会学生”，忽视了学生的“探究学习”、“做中学”和“合作学习”，这不利于培养学生的探究能力和创新精神。生物探究性实验教学是学生主动获取生物科学知识，领悟科学研究方法而进行的各种活动。教师在教学中，要渗透探究的要素，深刻认识到学生的能动性，充分发挥学生的主体性，激发学习兴趣，形成在“研究中学习”和“探究中学习”的教育观。
5.2 课前师生准备充分
开放实验材料是观察植物细胞一节探究式教学的基础。学生在初步掌握了使用显微镜技能后，非常迫切要观察多种植物的微细结构，所以教师课前让学生自愿准备感兴趣、可观察的多种植物材料。如：洋葱、青菜叶、新鲜的黄瓜、成熟的番茄等。实验中还要准备好3H铅笔、绘图纸、尺等完成绘图。教师除了准备好学生准备的材料外，还要准备好清水、碘酒溶液、镊子、刀片、解剖针、滴管、纱布、吸水纸、载玻片、盖玻片、显微镜、实物投影仪等，为学生的探究式学习做好准备。
5.3 制作多媒体课件
教师精心制作多媒体课件，通过制作动画、剪辑视频、图片展示等，增加学生的感性认识，从而突出重点、突破难点，帮助学生规范操作。
细胞生物学实验总结范文6
【关键词】 蛇毒抗高凝状态酶；细胞凋亡；肝细胞癌；肝细胞
【Abstract】 Objective To investigate the efficacy of antihypercoagulability state enzyme (AHCSE) and 5-FU on human hepatocellular carcinoma BEL-7404 cells， normal hepatocellular LO2 cells and probe into its function.Methods MTT.Phase-contrast-microscope， electron-microscopy， terminal deoxynucleotidy transferase dUTP nick and labeling (TUNEL)， flow cytometer (FCM) were conducted to observe the alteration of cell form， biochemistry variety of the AHCSEed cells (or the 5-Fued cells) of BEL-7404 cells， LO2 cells.Results The AHCSEed cells of BEL-7404， altered in their cells forms.The low dosage AHCSE had a very strong inhibition to BEL-7404 cells， nearly no efficacy on LO2 cells.With the dosage increase the rate of inhibition to BEL-7404 cells did not rise markedly， but an inhibition to LO2 cells appeared. After the action of AHCSE apoptosis took place in BEL-7404 cells， the apoptosis index increased with the increase of the dosage. It is very like 5-FU?s， but 5-FU?s function is very stronger than AHCSE’s.Conclusion The AHCSE /5-FU have very strong inhibition to the BEL-7404 cells. Inducing apoptosis is one of its functions. The AHCSE may possibly become a new kind of drugs that induce apoptosis.
【Key words】 antihypercoagulability state enzyme；apoptosis；hepatocellular carcinoma；hepatocellular
蛇毒作为一种天然的药用资源，含有许多活性成分。大量资料显示，蛇毒很多组分对肿瘤有很好的抑制作用。我们从皖南山区蝮蛇粗毒中提取一种抗高凝状态酶（antihypercoagulability state enzyme，AHCSE），发现其对实验性肝癌有很强的抑制作用［1，2］，本实验进一步以BEL-7404细胞（7404细胞）、正常肝LO2细胞（LO2细胞）为对象，利用细胞体外培养技术，比较AHCSE、5-FU的抗肿瘤作用及可能作用机制。现将研究结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 药物：AHCSE用柱层析法从皖南山区的蝮蛇粗毒中提取，由皖南医学院蛇毒研究所文尚武教授提供。细胞株：人肝癌细胞BEL-7404，正常肝细胞LO2源于上海细胞生物学研究所。试剂：RPMI1640培养液（GIBCO公司），小牛血清（FCS）（杭州四季清公司），HEPES（sigma公司），胰蛋白酶（GIBCO公司），噻唑蓝（MTT）（sigma公司），二甲基亚砜（DMSO）(sigma公司)，其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 测定不同浓度AHCSE、5-FU分别作用于7404细胞、LO2细胞后不同时间内的光密度值（OD）、抑制率（IR） 基本按文献［3，4］方法进行。AHCSE、5-FU经RPMI-1640培养液稀释，分别配成1mg/ml的母液。将于培养瓶中培养了48h的传代7404细胞株用0.25%胰蛋白酶、0.2% EDTA消化后，加入含10% FCS的RPMI-1640培养液(含青霉素、链霉素各100u/ml)，将细胞配制成5×104/ml的细胞悬液，加入96孔培养板中，每孔100μl，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。待细胞贴壁生长后(约15h)，每孔分别加入不同浓度的AHCSE或5-FU 100μl，AHCSE终浓度分别为0.1、0.5、1、5、10、50、100μg/ml，5-FU终浓度分别为0.1、0.5、1、10、50、100、500μg/ml，对照组加入RPMI 1640培养液100μl；每组设3复孔。采用MTT法测定经AHCSE或5-FU作用24h、48h后各浓度组的OD、IR值：培养结束前4h加5mg/ml MTT溶液20μl，终止培养时小心吸出孔内培养液，每孔加DMSO 150μl，振荡10min，用酶联免疫检测仪（BIO-RAD）测定其在550nm处的OD值。并计算IR值：IR=(1-用药组OD/对照组OD)×100%。用同样方法测不同浓度AHCSE或5-FU作用LO2细胞的光吸收值、抑制率。
1.2.2 光学显微镜观察 在相差显微镜下观察经不同浓度AHCSE、5-FU处理前、后细胞形态变化。
1.2.3 透射电镜观察 细胞经不同浓度AHCSE、5-FU处理48h，通过消化、打匀、离心等一系列处理后，用4℃ 2%戊二醛固定，各组收集约1×107细胞样品的细胞团块，小心移入青霉素小瓶中，送总医院电镜室检测观察。
1.2.4 细胞凋亡检测 采用原位末端标记法(TUNEL)定量检测凋亡细胞：将处理过的盖玻片放入6孔板中，接种同浓度、同体积的7404细胞后，再分别加入不同浓度的AHCSE或5-FU，于药物作用24h、48h，收集细胞，PBS洗2次，细胞爬片用多聚甲醛固定后，送南京建成生物工程研究所作TUNEL检测。在光学显微镜下计算凋亡率(AI)。计算方法：随机选取10个高倍视野，分别计算阳性细胞数和细胞总数：AI=阳性细胞数/总细胞数×100%。
1.2.5 流式细胞术 对经不同浓度AHCSE处理过的7404细胞，培养48h后，消化、分离细胞并移至15ml的锥形管中，检查有单个细胞悬浮，1000rpm离心5min后，弃上清。再用不含Ca2+、Mg2+的PBS（磷酸缓冲液）将细胞洗2次，计细胞数后用约500μl的PBS重悬细胞，加5ml 70%冷乙醇，4℃固定过夜。送上海细胞所行流式细胞术检测细胞凋亡情况。
1.3 统计学方法 统计描述计量资料以均数±标准差（x±s）表示，用SPSS11.5软件包进行方差齐性检验，one_way ANOVA和多个处理组与一个对照组比较的Dunnett法，均为双侧检验，α取0.05。
2 结果
2.1 细胞形态 相差显微镜观察经AHCSE、5-FU作用后的7404细胞：培养瓶中细胞经低浓度AHCSE、5-FU处理后，镜下可见悬浮细胞较多，细胞分裂相减少；AHCSE、5-FU浓度较大时，培养液内细胞碎片明显增多；而LO2细胞仅在高浓度AHCSE、5-FU作用下出现悬浮细胞并有细胞碎片。透射电镜下7404细胞组基本形态与对照组相同，但见胞浆内部分线粒体空泡化，成簇，胞膜下多见。另见胞浆中髓鞘样结构形成。但未找到典型的凋亡细胞和凋亡小体。
2.2 AHCSE、5-FU对7404细胞、LO2细胞的光吸收值及抑制率的影响 AHCSE对7404细胞具有明显的抑制作用，AHCSE浓度在0.5μg/ml以上组与同时间对照组OD值比较差异有显著性，见表1。由于AHCSE作用于培养细胞，不同的药物浓度作用时，因培养细胞总体增殖与总体死亡不同，会出现OD值的不同。小剂量时各组细胞因总体增殖大于总体死亡，所以在相同药物浓度作用下48h的OD值较24h大；大剂量时各组细胞因总体死亡大于总体增殖，所以在相同药物浓度下作用48h的OD值较24h小。但是AHCSE对BEL-7404细胞的抑制率随AHCSE浓度的增大和作用时间延长的而增大。同样方法可了解5-FU对7404细胞的光吸收值及抑制率，见表2。AHCSE、5-FU对LO2细胞的作用，见表3、4。AHCSE、5-FU对BEL-7404细胞具有明显的抑制作用，AHCSE为0.5μg/ml，5-FU为1μg/ml时与同时间对照组OD值比较有统计学意义，AHCSE浓度在不小于0.5μg/ml，5-FU不小于1μg/ml时各组与同时间对照组OD值比较差异有非常显著性（P<0.01），当AHCSE浓度≥75μg/ml时抑制作用存在明显的剂量时间依赖关系（P<0.01）。AHCSE对LO2细胞影响很小（P＝1.000），浓度为75μg/mL时才有统计学意义（P=0.049），而5-FU在浓度1μg/ml时，作用48h时对LO2细胞存在抑制作用（P<0.05）。 表1 不同浓度AHCSE作用BEL-7404细胞后不同时间的光吸收值、抑制率 （x±s）
注：与同一时间对照组比较，**P<0.01
表2 不同浓度5-FU作用BEL-7404细胞后不同时间的光吸收值、抑制率 （x±s）
注：与同一时间对照组比较，*P<0.05；与同一时间对照组比较，**P<0.01
2.3 细胞凋亡检测 采用TUNEL法定量检测凋亡细胞，AHCSE、5-FU各剂量组的凋亡情况见表5。
当AHCSE、5-FU剂量为10μg/ml时与对照组比较差异均有统计学意义（P=0.000），剂量为100μg/ml时细胞凋亡率更高；AHCSE、5-FU两剂量组48h细胞凋亡率均较24h明显（P＝0.000）。通过FCM检测，得到AHCSE作用7404细胞48h细胞凋亡率（％，x±s）：对照组为4.15±0.42，AHCSE浓度为5μg/ml时为10.25±0.57，AHCSE浓度为10μg/ml时为16.22±2.77，AHCSE浓度为100μg/ml时为23.21±3.01。浓度为10μg/ml和100μg/ml时与对照组比较P=0.000，浓度为100μg/ml时凋亡率更高。这与TUNEL法检测结果相一致。
表3 不同浓度AHCSE作用LO2细胞后不同时间的光吸收值、抑制率 （x±s）
注：与同一时间对照组比较，**P<0.01
表4 不同浓度5-FU作用LO2细胞后不同时间的光吸收值、抑制率
注：与同一时间对照组比较，*P<0.05；与同一时间对照组比较，**P<0.01
表5 不同浓度AHCSE、5-FU作用7404细胞后不同时间的细胞凋亡率 （x±s，%）
注：与同一时间对照组比较，**P<0.01
3 讨论
蛇毒作为一种天然药用资源，很多组分已被证实对不同肿瘤有一定程度的杀伤作用，但作用成分和作用机制不尽相同［5～7］。我们对AHCSE的体内试验证实其对肿瘤有一定的杀伤作用，作用效果与5-FU相似［1，2］，本实验通过比较AHCSE和5-FU的作用，进一步了解AHCSE的作用效果及其可能作用机制。
本实验选择了BEL-7404细胞、LO2细胞作为实验对象，利用细胞体外培养技术，进行了进一步研究。结果表明：低浓度AHCSE对7404细胞有明显的抑制作用，而对LO2细胞几乎无作用；随AHCSE剂量加大，其对7404细胞的抑制作用虽有所增大，但增加却不甚明显，而逐渐对LO2细胞出现显著的抑制作用。AHCSE对7404细胞的作用与5-FU效果相近，但5-FU在较低剂量就对LO2细胞有较强的抑制作用。AHCSE、5-FU对7404细胞、LO2细胞抑制率与作用时间不相一致可能与药物的半衰期、细胞的生长周期、细胞生长速度有关。大剂量5-FU并不能杀死所有癌细胞，这与5-FU特异性作用于S期细胞有关。这也是临床上控制5-FU剂量、作用时间、为减少毒副作用的原因。中小剂量的AHCSE对7404细胞作用敏感，但对LO2肝细胞影响不大，表明AHCSE的作用安全有效，其浓度约为0.5～50μg/ml，也提示其对正常肝细胞和肝癌可能呈不同生物学行为。有资料显示，蛇毒可能作用于癌细胞表面的特异性受体，这也是蛇毒组分对癌细胞有选择性、副作用小的原因之一［8～9］。
从光镜、电镜结果示悬浮细胞和细胞碎片增多，胞浆内部分线粒体空泡化，成簇，胞膜下多见，胞浆中髓鞘样结构形成等进一步证实AHCSE对肝癌细胞有直接杀伤作用。从TUNEL、FCM检测结果可知：AHCSE能够诱导体外培养的7404细胞凋亡，电镜下未找到典型的凋亡细胞和凋亡小体，可能与送检的细胞数量极大，凋亡细胞相对较少等有关，有文献报道培养细胞在电镜下不易观察到典型的凋亡小体。
肿瘤细胞是一种应凋亡而未正常凋亡的细胞。细胞凋亡是由细胞内基因编程所控制。外界刺激经过复杂的信号传导系统进入细胞核，作用于细胞凋亡相关基因，如P53、Fas、Bcl-2等基因启动了细胞凋亡相关程序，诱导细胞凋亡。诱导细胞凋亡研究手段已经作为筛选抗肿瘤药物的一种有效方法。我研究小组对AHCSE的体内外抗肿瘤实验研究已初步证实了其可诱导肝癌细胞凋亡，对肝癌细胞有明显的抑制作用。因而为AHCSE最终应用于临床提供一定的理论依据。
肝癌是一种严重危及人类健康的恶性程度较高的肿瘤，且对放化疗不甚敏感，有必要寻找另类新的作用靶点的治疗方法。本实验结果初步显示，AHCSE可能成为一种新的肝癌细胞凋亡的诱导剂。
【参考文献】
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