作者：吴晓燕 张光一 单位：河北省产品质量监督检验院 河北经贸大学生物科学与工程学院
各种质粒为本研究室保存，质粒在大肠杆菌中选择标记为氨苄青霉素抗性（Amp）r。酵母自主表达质粒pUT332携带腐草霉素抗性基因[4]。所用酵母在30℃培养，在4℃麦汁斜面保存。培养基LA培养基：大肠杆菌生长培养基LB（0．5％酵母粉、1%蛋白胨、1%氯化钠），根据需要添加氨苄青霉素（浓度为50μg/mL），用于质粒扩增。酵母生长复合培养基（YEPD）：1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖，琼脂2%。YNB培养基:YNB6.7g/L，葡萄糖2%。含腐草霉素250μg/mL，用于酵母菌转化子筛选。酶和试剂限制性内切酶、PfuDNA聚合酶、T4DNA连接酶为宝生物工程（大连）有限公司产品。小牛胸腺DNA及其它分子生物学试剂为Sigma公司产品。引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。
仪器RS-1型涡旋振荡器：北京鼎昊源科技有限公司；GenePulserTM电转仪：美国Bio-rad公司；Mini-BeadBeater-1小型珠磨式组织研磨器：美国BioSpec公司；BLBIO-5GJ发酵罐：德国B.Braun生物技术公司；惠普-1100型高效液相色谱仪、HP5890气相色谱仪：美国Agilent公司。细胞破碎液制备[5]3000r/min离心5min收集1×109细胞，首先用pH7的100mmol/L的KH2PO4洗，然后用pH7的10mmol/L的KH2PO4洗。取100mg（湿重）酵母细胞加1g直径0.5mm玻璃珠、0.5mLpH7的50mmol/L的KH2PO4（含1mmol/LMDDT和2mmol/LMgCl2）的混合液洗。试管在涡旋振荡器中振荡1min，冰浴1min，重复5次。然后13000r/min离心1min，收集上清液。
目的基因PCR根据GenBank（accessionnumberZ81318）报导的瑞士乳杆菌（Lactobacillushelveticus）的乳酸脱氢酶基因L-LDH基因序列设计引物。引物1：5'-gcggatccaggagatttattgtt-3'，引物2：5'-ctggtaccgaaaagagatgctc-3'。其5'端有BamHI酶切位点，3'端有KpnI酶切位点。按下面条件PCR，获得L-乳酸脱氢酶基因，大小1kb。根据GenBank（accessionnumberX04675）报导的酿酒酵母基因组丙酮酸脱羧酶基因为模板设计引物。编码序列上游序列3：5'-atatatgaattcgcgtttatttacctatctt-3',4：5'-atatatggatcctttgattgatttgactgtg-3',其5'端有EcoRI酶切位点，3'端有BamHI酶切位点。编码序列的下游序列5：5'-atataggtcgacttgaacgtcccagctaagttg-3',6：5'-atatattctagactcgtcagcaatagtggtcaac-3'，其5'端有SalI酶切位点，3'端有XbaI酶切位点。按下列条件进行PCR，获得丙酮酸脱羧酶1的部分启动子序列和编码序列的下游序列。PCR体系组成（50μL）：模板1μL；E.Master酶混合物25μL；引物2μL×2；重蒸水加至50μL。
酵母转化酵母细胞经10mLYEPD培养基30℃过夜培养，然后转接500mLYEPD培养液（2L三角瓶）摇床培养至OD600=1.3~1.5。4℃，4000r/min收集细胞重悬于80mL重蒸无菌水，添加10mLpH7.5的10×TE缓冲液、10mL1mol/LLiAc，30℃低速振荡45min；再加2.5mL新配制的1mol/L的DTT，温浴15min。酵母悬液用重蒸水稀释至500mL，洗3次。细胞重悬于250mL冰冷的重蒸水，再悬于30mL冰冷的1mol/L山梨醇。收集细胞并重悬于0.5mL冰冷的1mol/L山梨醇中，调节细胞悬液OD600=200。向1.5mL离心管添加40μL细胞，5μLDNA（线性DNA：质粒DNA=10∶1，最好是50ngpUT332）。细胞-DNA混合物转入带帽的0.2cm冰浴电转移管进行电脉冲处理（1.5kV，25mFand200ohms），然后立即加入1mL冰冷的YEPD培养基，30℃轻微振动2h~4h。取250μL涂含腐草霉素的转化平板，30℃培养3d~4d。
适应进化实验保藏菌株涂基本培养基平板，选单菌落接种5mL液体试管，30℃摇床（40r/min）培养过夜，然后转接250mL三角瓶，其工作量50mL，30℃40r/min摇床培养3d。转接培养7d。培养细胞重复上面步骤，碳源或盐浓度增加。培养介质定期更新（3.5d更新一次），共12次。培养液葡萄糖浓度为20%~30%。碳酸钠浓度为3%~5%。培养40多天后，取5mL转接50mL培养液培养，再转接1.0LYNB介质，（含葡萄糖300g/L或碳酸钠5g/L，发酵1d。培养物涂平板，挑单菌落依次转接如上5mL、50mL、1.0LYNB介质（含葡萄糖300g/L或碳酸钠50g/L），发酵16h。第3次重复上述步骤发酵13h。最后收集细胞涂平板。用乳酸调节发酵液的pH<4.6。筛选生长旺盛的适应菌株。
乳酸脱氢酶测定YEPD培养基培养，将对数生长期的细胞（OD600=0.8）转至含0.9mol/LNaCl的YEPD培养基，30℃培养2h。离心收集细胞，用等渗盐溶液洗2次，置于沸腾的乳酸脱氢酶LDH提取缓冲液（0.1mol/LMops，pH7.2，10%甘油,1mmol/L二硫苏糖醇），然后酵母用小型珠磨式组织研磨器破碎细胞，添加0.5-mmzirconia-silica珠，然后4℃13000r/min离心15min除去细胞碎片，上清液用于乳酸脱氢酶活性测定。在磷酸缓冲液（73mmol/LKH2PO4，3.5mmol/LNa2HPO4，pH5.6）添加1mmol/L丙酮酸和0.2mmol/LNADH，25℃分光光度法测定乳酸脱氢酶活性。酶活性定义为在反应条件下，1min将1mmol/L底物还原为乳酸所需的酶量。蛋白质含量用考马斯亮蓝染色法测定，以牛血清蛋白作为测定参照标准。
发酵实验储存菌株培养物2mL接种250mL三角瓶（100mLYEPD培养介质），30℃150r/min摇瓶培养至平衡期作为种子培养物。发酵采用合成培养基，发酵罐装有3L培养介质，121℃灭菌40min。发酵罐接种量为1.0×107个/mL~1.5×107个/mL，转速650r/min。控制通气量1.5L/min，发酵温度控制在30℃。如果需要可用10%无菌氨水控制。发酵6d，每天取样测定发酵液的pH、细胞生物量、糖消耗量、乙醇含量和乳酸含量。
分析方法乳酸、残糖用高效液相色谱HPX-87H（300mm×7.8mm）Aminex色谱柱（Bio-Rad）或DNS法测定。用NucLeosiL5C-18100A柱。流动相为重蒸水，流速1mL/min。5mmol/LH2SO4作为洗脱液，流速0.5mL/min。乳酸的光学纯度用惠普-1100型高效液相色谱仪测定。HypersilODS（C18）色谱柱（150mm×2.1mmi.d，5μm）；流动相：0.65mmol/L2，3，6三甲基β环糊精（TM－β－CD，含5mmol/LH2SO4），pH2．5；流速：0．5mL/min；紫外检测波长：210nm；进样量：5μL；柱温：室温。乙醇用气相色谱测定，采用火焰离子化检测器。取1μL注入HP5890气相色谱仪，配备DBWAX大孔柱。载气为氮气，流速为10mL/min。加样和检测温度分别为240、250℃。炉温：80℃保持2min，然后升至200℃，升温速度10℃/min。#p#分页标题#e#
乳酸脱氢酶基因LDH获得将乳酸脱氢酶基因LDH基因引入酿酒酵母，使其可以用另一代谢途径再生NAD+，糖酵解转向乳酸生成途径，使胞内丙酮酸直接还原为乳酸，导致乙醇和乳酸同时积累。已经证明[6]：瑞士乳杆菌（L.helveticus）乳酸脱氢酶基因LDH可以与酵母的丙酮酸脱羧酶竞争使乙醇生产方向转至乳酸生产方向。故本研究以瑞士乳杆菌基因组为模板，进行PCR获得乳酸脱氢酶基因。乳酸脱氢酶基因嵌合片段构建将PCR获得的丙酮酸脱羧酶基因的5'插入pBluescriptM13-的EcoRI/BamHI位点,然后再将3'片段插入SalI/XbaI位点。重组载体1经BamHI+SalI酶切，与将L.helveticus的L-LDH/BamHI+KpnI基因和乙醇脱氢酶下游3'基因片段/KpnI+SalI一同连接，获得携带5'PDC1+LDH+ADH1T+3'PDC1基因片段的重组载体2。用AatII+XbaI酶切获得该嵌合片段如图1，大小约为2.9kb。
电转化及整合验证通过电转化法将整合片段与酵母自主表达质粒pUT332转化工业酿酒酵母菌,在含150μg/mL腐草霉素的YEPD培养基上筛选阳性转化子。提取转化子基因组进行PCR验证，如图2，以乳酸脱氢酶基因LDH上游引物和PDC1终止序列的下游引物为引物，获得基因片段为2.1kb。表明乳酸脱氢酶基因整合在酵母的基因组上，并破坏丙酮酸脱羧酶1基因。转化子的筛选标记丢失培养对目标转化子进行YEPD非选择性培养数代，选择腐草霉素抗性丢失的菌株进一步研究。转化子初步生长研究对转化子进行细胞生长及初步发酵性能测试，转化子30℃培养72h，接种量为10%。测定L-乳酸产生量最高为48.9g/L，见图3。
转化子适应进化研究发现，在高渗透胁迫条件下，酵母细胞通过激活不同的机理合成一些代谢产物并在胞内积累滞留，达到适应存活[5]。酵母细胞中pH越高，生存能力越强，乳酸产量越高。本研究采用高渗胁迫适应和低pH适应相结合的筛选策略。首先采用高糖/高盐作为选择条件诱导菌株发生遗传改变获得突变子库。用30%葡萄糖及5%的碳酸钠的合成基本培养基进行适应筛选（40r/min摇瓶培养），使获得的重组菌株产生抗胁迫能力，并经连续传代培养28d（约200代）的系列转移-稀释策略，筛选生长旺盛的适应菌株60个；然后用低pH4.5的合成培养介质（用乳酸调节发酵液的pH<4.5）进一步适应培养，筛选生长旺盛的适应菌株30个。最后，筛选生长旺盛、胞内pH高、乳酸产量高的菌株3个。
发酵介质组成优化对糖蜜、玉米黄浆水、尿素比例进行研究，采用三因素四水平，按正交表L（934）设计正交试验，30℃250mL三角瓶（装瓶量100mL）摇床培养48h，确定培养基最佳组成。优化培养基组成（g/L）：糖蜜总糖120；玉米黄浆水1000；K2HPO46。发酵条件研究1）以菌体接种量、培养基初始pH、培养时间，按正交表L（934）设计正交试验，250mL三角瓶装有100mL培养介质30℃200r/min摇瓶培养，测定乳酸生成量，确定最适初始发酵介质pH5.0，接种量1.3cells/mL×107cells/mL，培养5d。2）采用5-L发酵罐（BIOSTAT-B,B.Braun,Germany），介质填充量3L，发酵介质初始pH5.0，接种量1.3×107cells/mL。控制溶氧30%~50%，搅拌速度300r/min~1000r/min，发酵温度30℃，发酵6d。每天取样测定发酵液的pH、细胞生物量、糖消耗量、乙醇含量和乳酸含量。确定最佳发酵条件：发酵介质初始pH5.0，接种量1.3×107个/mL，发酵温度30℃，溶氧30%，搅拌速度650r/min，发酵时间4d。最终得率：乳酸52.2g/L，乙醇45.8g/L；49.2%的糖转化为乳酸，乙醇产生量降低到原来的46.8%。
聚L-乳酸作为一种非常有吸引力的热塑性无毒高分子材料，生物相容性好，易与市政环卫管理处理体系结合，没有白色污染，满足社会可持续发展要求。本课题获得高效表达L-乳酸的酵母适应工程菌，可利用价格低廉的糖蜜、玉米黄浆水发酵生产乳酸。发酵介质组成（g/L）：糖蜜120，玉米黄浆水1000，K2HPO46，pH5.0。最适发酵条件为：发酵温度30℃，装液量60%，接种量1.3×107个/mL，溶氧30%，搅拌速度650r/min，发酵时间4d。构建的酵母适应工程菌可以用廉价培养介质发酵生产，生产成本低；引入的乳酸脱氢酶基因整合在酵母染色体上，遗传稳定；没有引入细菌来源的抗药性基因，利于食品应用；可以进行高密度培养；酵母酸耐受性强，减少发酵过程中中和剂使用。该酵母适应工程菌的乳酸产量比一般乳酸菌低，仍有部分乙醇产生，今后应进一步进行遗传修饰，提高L-乳酸产量。由于廉价发酵介质杂质多，发酵后的低成本纯化方法选择具有挑战性，应继续进行纯化研究，降低纯化成本。
