单细胞生物定义范例6篇

单细胞生物定义范文1

【摘要】目的：采用Survivin反义寡核苷酸(ASODN)复合物抑制survivin的表达，研究其对槲皮素诱导肝癌SSMC7721细胞凋亡的影响.方法：体外培养人肝癌SSMC7721细胞，取对数生长期细胞进行实验.实验分Ⅰ,Ⅱ两部分：Ⅰ分为空白对照组(设平行组)、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组、400μmol/LSODN复合物组、400μmol/LASODN复合物组(设平行组)，转染48h;Ⅱ弃掉Ⅰ部分各组培养液，换新指定培养液，分为空白对照组、40μmol/L槲皮素组、脂质体LipofectamineTM2000组、SODN复合物组、ASODN复合物组、ASODN复合物+40μmol/L槲皮素组(联合组)，孵育细胞24h后检测.Ⅰ结束时采用RTPCR、细胞免疫组化染色检测各组SSMC7721细胞survivin表达变化；Ⅱ结束时用吖啶橙染色法观察细胞凋亡时形态变化，MTT法检测SSMC7721细胞生长抑制率，AnnexiV/PI双染流式细胞仪检测SSMC7721细胞凋亡率.结果：ASODN复合物作用肝癌SSMC7721细胞48h后能下调survivinmRNA及Survivin蛋白的表达(P<0.01)；与其他组比较，联合组AO染色图片可观察到凋亡小体等典型的细胞凋亡形态特征变化且凋亡细胞数量明显增多，并用MTT法、AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测显示联合组细胞的生长抑制率增高(P<0.01)、细胞凋亡率提高(P<0.01).结论:ASODN复合物可有效抑制肝癌SSMC7721细胞survivin基因的表达；ASODN复合物能增强槲皮素对SSMC7721细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用即二者具有协同作用，该作用可能与抑制survivin基因的表达有关.

【关键词】反义寡核苷酸；槲皮素；肝肿瘤；细胞凋亡；细胞周期；Survivin

0引言

肝癌(hepaticcarcinoma,HCC)是世界范围内发病率较高的恶性肿瘤之一，对于大多数肝癌患者，经肝动脉化学药物栓塞治疗和全身化疗仍是最常用的治疗方法.近年来抗凋亡机制在肿瘤细胞耐药性发生中的作用倍受关注［1］.survivin是1997年由Ambrosini等［2］发现，Ito等［3］报道Survivin蛋白对破坏肝癌细胞增生凋亡平衡、促进肝癌细胞快速增生具有重要作用.槲皮素(quercetin,Quc)是广泛分布于蔬菜、水果、中草药等的一种天然的黄酮类化合物，化学名为3,3′,4′,5,7五羟基黄酮.LopezLazaro等［4］研究表明，Quc没有毒副作用.近年来的研究表明Quc在体外、动物实验模型中均显示出抗癌活性［4-6］.本实验旨在研究反义抑制survivin的表达，检测其对Quc抑制肝癌SSMC7721生长和诱导细胞凋亡的影响，探讨反义抑制survivin的表达是否在体外可增强Quc抗癌作用及可能的机制，为其进一步动物实验和临床应用提供新的实验依据.

1材料和方法

1.1材料人肝癌细胞株SSMC7721兰州大学医学实验中心提供.RPMI1640(Sigma公司)，小牛血清(杭州四季清公司)，槲皮素(Sigma公司,用前以少量DMSO溶解，用时加RPMI1640稀释至使用浓度)，MTT(Sigma公司),Trizol(BBI公司)，Survivin蛋白一抗兔抗人抗体、二抗羊抗兔抗体(北京中山公司)，TaKaRa试剂盒(宝生物工程公司)，AnnexiV/PI试剂盒(宝灵试剂公司),阳离子脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen公司).寡核苷酸(ODNs)脂质体(Lip)转染复合物survivin正、反义寡核苷酸的设计、合成：根据survivin的基因序列(GenBankAccessionNumberU75285),应用Primer5.0软件设计互补于survivinmRNA的232-251序列的20个碱基组成的ASODN链：5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG3′,同时合成正义链：5′CGCAGTAGCTGCGCTGATTG3′,两条链均采用硫代磷酸化修饰.在GenBank中证实反义寡核苷酸(ASODN)及正义寡核苷酸(SODN)与任何已知哺乳动物基因无匹配，上海生工公司合成.用LipofectamineTM2000输送ODNs，依文献［7］ODNs/LipoTM2000=4g/L配置ODNsLipoTM2000转染复合物，按质脂体转染试剂盒说明书进行操作.

1.2方法取对数生长期的SSMC7721细胞，消化、收集、计数并接种于96孔或6孔培养板或100mL细胞培养瓶.

1.2.1分组实验分Ⅰ,Ⅱ两部分：Ⅰ分为空白对照组(设平行组)、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组、400μmol/LSODN复合物组、400μmol/LASODN复合物组(设平行组)，转染48h;Ⅱ弃掉Ⅰ部分培养液，换新指定培养液，分为空白对照组、40μmol/L槲皮素组、脂质体LipofectamineTM2000组、SODN复合物组、ASODN复合物组、ASODN复合物+40μmol/L槲皮素组，孵育细胞24h后检测.

1.2.2RTPCR检测SSMC7721细胞survivinmRNA表达变化在实验Ⅰ部分结束时，按Takara试剂盒操作说明书进行，收集各组细胞，Trizol提取总RNA,用紫外分光光度计检验纯度并定量.设βactin为内参照，对样品模板用量标准化,survivin和βactin分管扩增,引物由上海生工公司合成.其序列如下：survivin引物序列5′AAAGAGCCAAGAACAAAATTGC3′(F)和5′GAGAGAGAAGCAGCCACTGTTAC3′(R),338bp;βactin引物序列5′CTTCTACAATGAGCTGCGTG

3′(F)和5′TCATGAGGTAGTCAGTCAGG3′(R),243bp.10μL逆转录体系用于逆转录合成cDNA,30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min完成逆转录.10μLcDNA用于PCR反应,分别单独加入相应上下游引物等在50μLPCR反应体系进行PCR反应.94℃预变性2min后进入PCR循环，条件：survivin和βactin，94℃变性30s,54℃复性30s,72℃延伸30s,共35个循环；RTPCR产物8μL在18g/L琼脂糖凝胶上电泳，经凝胶图像分析仪分析结果，以survivin与βactin的比值作为survivinmRNA表达的相对含量.

1.2.3细胞免疫组化染色检测SSMC7721细胞Survivin蛋白表达变化取对数生长期细胞于预先置入盖玻片6孔板进行细胞爬片，在实验Ⅰ部分处理结束时，取出各组爬片细胞，PBS液轻轻漂洗，750mL/L乙醇固定，按试剂盒操作步骤进行细胞免疫染色.以正常鼠血清和磷酸盐缓冲液分别代替一抗行替代对照和空白对照.于普通光学显微镜下观察，以细胞核或细胞质出现棕褐色或棕黄色颗粒为阳性，随机选取5个高倍视野进行计数，每个高倍视野计数100个细胞，共500个细胞，计算细胞Survivin蛋白阳性表达率.

1.2.4吖啶橙(AO)染色法观察细胞凋亡时形态变化消化、收集实验Ⅰ,Ⅱ两部分处理的各组细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，制成单细胞悬液，浓度1010个/L,750mL/L乙醇固定4h,离心弃乙醇，加入8.5mg/L的AO2mL工作液，室温染10min后，滴几滴在载玻片，加缓冲甘油封片.在荧光显微镜下用吸收波长405nm,发射波长550~630nm观察，并随机拍照.

1.2.5MTT法检测细胞增殖变化取对数生长期的SSMC7721细胞，消化、收集、计数并接种于96孔板，每孔2×103个，并设3个复孔.实验设数个平行板，分Ⅰ,Ⅱ两部分；到实验预定点前4h加5g/L的MTT10μL，37℃反应4h，弃掉MTT，加200μLDMSO,轻轻振荡10min,使结晶溶解，酶标仪检测570nm波长A值.计算细胞生长抑制率(inhibitoryrate，IR).重复2次，取平均值.IR(%)=(A对照组-A实验组)/A对照组×100%.

1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡率消化、收集经实验Ⅰ,Ⅱ两部分各处理组细胞，按AnnexinV细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，加入Bindingbuffer缓冲液200μL、AnnexinV/FITC(20mg/L)10μL和PI液(50mg/L)5μL，室温避光孵育30min后加入Bindingbuffer缓冲液300μL，立即用流式细胞仪FACScan(BeclonDickison公司)测定，经计算机软件处理，计算凋亡细胞百分率,实验重复2遍.

统计学处理:实验数据以x±s表示；应用SPSS13.0统计软件进行分析，采用单因素方差分析，并进行两两比较(q检验).以P<0.05认为差异有统计学意义.

2结果

2.1ASODN反义复合物对肝癌SSMC772细胞survivinmRNA表达的影响RTPCR检测survivinmRNA水平显示400nmol/LASODN反义复合物组(0.21±0.03)较空白对照组(0.99±0.02)、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组(0.94±0.03),400nmol/LSODN复合物组(0.94±0.03)RTPCR扩增的条带减弱(P<0.01).通过计算机图像分析结果表明，400nmol/LASODN反义复合物组与空白对照组、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组、400nmol/LSODN复合物组相比较差异有统计学意义(P<0.01)，其他各组间相比较差异无统计学意义.

2.2ASODN反义复合物对肝癌SSMC772细胞Survivin蛋白表达的影响细胞免疫组化染色结果显示，400nmol/LASODN反义复合物组(19.7±3.7)%较空白对照组(76.5±8.7)%、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组(74.5±8.2)%,400nmol/LSODN复合物组(73.9±7.9)%Survivin蛋白表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.01).

2.3细胞凋亡形态学变化ASODN反义复合物联合槲皮素组凋亡细胞数量明显较空白对照组、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组、SODN复合物组、ASODN复合物组及槲皮素组增加，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质成红色荧光.凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体等典型改变(图1).

2.4MTT法检测SSMC7721细胞增殖变化ASODN复合物组（28.4%）或槲皮素组（43.1%）可抑SSMC7721细胞增殖(P<0.01)，而脂质体组（1.7%）则无此效，ASODN反义复合物联合槲皮素时表现出协同抑制细胞增殖作用（69.8%），两药联合对细胞的增殖抑制效果高于单用ASODN复合物组（28.4%，P<0.01)和槲皮素组(43.1%，P<0.01).

2.5细胞凋亡率的变化与空白对照组、脂质体对照组相比，ASODN复合物组、槲皮素组、ASODN复合物+槲皮素组均能诱导细胞凋亡，且其诱导细胞凋亡率(Annevix(+)PI(-))分别是脂质体组的3.1倍、4.3倍、18.2倍，差异有统计学意义(P<0.01)，ASODN复合物联合槲皮素组与ASODN复合物组、槲皮素组比较，其诱导细胞凋亡率分别是他们的5.9倍、4.2倍，差异有统计学意义(P<0.01)，并且各组间流式细胞仪检测时损伤率(Annexin(+)PI(+))无统计学意义（表1）.表1各组细胞凋亡率变化

3讨论

Survivin的组织分布特征具有明显的选择性，其表达于胚胎和发育

的胎儿组织，但不见于终末分化的成人组织(胸腺、生殖腺除外)，而表达于大多数肿瘤组织中［8-9］，使它成为一个癌的分子标志和治疗靶点.研究发现，Survivin能够通过杆状病毒IAP重复序列(BIR)作用于Caspase3,Caspase7来抑制凋亡蛋白酶活性，阻止多种凋亡信号诱导的细胞凋亡，而且能在细胞有丝分裂前期通过与纺锤体微管发生特异性结合反应，使肿瘤细胞逃避细胞周期G2/M期检测点的监控，抵抗因DNA损伤或突变自身诱导的细胞凋亡，从而导致肿瘤细胞异常分裂增殖［10］，另外Survivin蛋白亦可通过p21蛋白间接抑制caspase酶而起作用,阻断细胞的凋亡过程,其抑制细胞凋亡的作用远远大于bcl2家族成员,是迄今发现的最强的凋亡抑制因子.Survivin的高表达可以使肿瘤细胞免受各种凋亡信号的刺激而帮助细胞存活［11-12］.槲皮素(Quercetin)是具有多种生物活性的黄酮类化合物，其维生素P样的作用已应用于临床.国内外已有研究显示，槲皮素是目前已知的最强的抗癌剂之一，能够诱导多种肿瘤细胞凋亡［13］，同时槲皮素还有抗炎、抗过敏、抗氧化、降血脂、降压等生理活性.本实验应用反义核酸技术，用脂质体LipofectamineTM2000介导人工合成的特定DN段ASODN分子转染SSMC7721细胞，人工合成的特定DN段ASODN分子与进入细胞质的survivinmRNA上的特定位点相结合，形成DNARNA复合物，抑制survivinmRNA与核糖体结合，同时激活RNA降解酶H，降解survivinmRNA，从而抑制或封闭基因的表达，干扰survivin致病蛋白的产生［14］.实验结果显示，ASODN复合物作用于肝癌SSMC7721细胞48h后，采用RTPCR和细胞免疫组化检测示与空白对照组比较，ASODN复合物组survivinmRNA、Survivin蛋白表达明显下调，而等量脂质体组、SODN复合物组survivinmRNA、Survivin蛋白表达变化差异则无统计学意义，实验证明了ASODN复合物可有效抑制survivin基因的表达.实验进一步用等剂量的槲皮素(亚致死浓度)处理实验Ⅰ部分各实验组肝癌SSMC7721细胞24h后，实验结果显示，与其它组比较，ASODN复合物+40μmol/L槲皮素组(联合组)AO染色法观察在相同条件联合组满视野见典型细胞凋亡形态学变化且凋亡细胞数量明显增加，MTT法、AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测示在同等条件联合组细胞生长抑制率和细胞凋亡率明显高于其它组，差异有统计学意义.也就是有效封闭肝癌SSMC7721细胞survivin基因的表达能增强槲皮素对该细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用即ASODN反义复合物联合槲皮素对肝癌SSMC7721细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用具有协同效应.实验结果还表明，SSMC7721细胞survivin基因表达降低后，其抗凋亡能力被有效抑制了，推测联合组对肝癌细胞的协同细胞毒性导致的凋亡可能是通过两个凋亡途径的共同通路［15］即激活Caspase效应子而实现的.至于是通过死亡受体途径还是通过线立体途径介导的凋亡有待进一步研究.

【参考文献】

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单细胞生物定义范文2

【摘要】 目的 应用单核细胞向巨噬细胞分化的体外模型，研究单核细胞向巨噬细胞细胞分化过程中基质金属蛋白酶-9表达及其活性的变化.方法用乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA) 孵育THP-1细胞不同时间，采用倒置显微镜观察细胞的形态学变化，RT-PCR观察MMP-9 mRNA表达的变化，Western blot观察MMP-9蛋白表达的变化，明胶酶谱(gelatin-zymogram)分析法测定MMP-9活性的变化。结果THP-1细胞经PMA孵育后, 细胞由分散、悬浮转变为黏附、贴壁, 且MMP-9的表达明显上调，活性增加.结论 单核细胞向巨噬细胞分化的过程中，MMP-9的表达量及其活性明显增加。

关键词：PMA 单核细胞 巨噬细胞 基质金属蛋白酶9

1 前言

MMP－9 是明胶酶的一种,单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、血管平滑肌细胞、以及内皮细胞等均有表达[1]，参与降解细胞外基质（ECM）,在多种生理和病理过程中起着重要作用。为此，我们采用单核细胞向巨噬细胞分化的体外模型，探讨单核细胞在分化为巨噬细胞的过程中MMP-9表达的变化，进一步探讨动脉粥样硬化发生发展的机制。

2 材料和方法

2.1 THP-1细胞培养

THP-1细胞购自中科院上海细胞生物所细胞中心。含10%小牛血清RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2条件下培养至106/ml时换无血清培养基，加PMA（至终浓度为100nM）[2]，分别孵育6、12和24小时。

2.2 RT-PCR检测MMP-9 mRNA的表达[3]

用TRIZOL RNA抽提液提取细胞总RNA,RNA浓度以紫外分光光度计(美国PE公司Lambda25型)重复测量3次,A260nm/A280nm比值在1.8以上方可用。取1.0μg总RNA为模板，以Oligo（dT）16为引物进行逆转录。反应条件为65℃变性5min，42℃反应50min,70℃终止反应15min。扩增MMP-9的引物为：有意义序列引物5’-CGGGACGGCAATGCTGATG-3’,反义序列引物5’-CGCCACGAGGAACAAACTGT-3’, 预计扩增引物全长为362bp。以3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）为内对照，扩增GAPDH引物为：有意义引物序列5’TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3’， 5’TCACCATCTTCCAGGAGCGAG 3’,下反义序列引物:5’TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG 3’,预计扩增引物全长为697bp,均由上海生工合成。取逆转录产物2μL分别进行聚合酶链反应。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火45s，72℃延伸1min。退火温度SDF-1为58℃，GAPDH为58℃。经28个循环后，72℃延伸10min。取5μL聚合酶链反应产物作琼脂糖凝胶电泳。并利用凝胶成像系统作结果分析。

2.3 Western blot 检测MMP-9蛋白表达

经8%SDS-PAGE分离样品蛋白质，转移缓冲液在200mA、100V条件下电泳6h后转膜，洗膜，封闭液封闭。分别加入一抗，4℃轻轻振荡约2h，漂洗，加过HRP标记的二抗杂交，再漂洗，显色液显色，暗室中感光，拍照并进行灰度扫描测定。

2.4 明胶酶谱法测定MMP-9活性[4]

酶原电泳在含0.1%明胶、10%SDS的8%聚丙烯酰胺凝胶中进行。电泳完毕后，将凝胶浸入2.5%Triton-100中复性30min，共2次，洗去SDS，恢复MMP-2、MMP-9活性。再将凝胶浸入酶解缓冲液（50mmol/L Tris-HCl，pH 7.6、0.2mol/L NaCl、5mmol/LCaCl2、0.02%Brij35），温育37℃ 18小时。用0.5%考马斯亮兰（10%冰醋酸、40%甲醇配制）染色90min后，10%冰醋酸、40%甲醇脱色至透明条带与兰色背景对比清晰即可。凝胶扫描，半定量测定MMP-9活性。

2.5 统计学处理

实验数据用平均数±标准差( ±S)表示。采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析，两两均数间的多重比较，采用Student t检验，P

3 结果

3.1 PMA处理对THP-1细胞形态的影响

THP-1细胞和PMA孵育6h后，细胞形态开始发生改变，由悬浮型转变为贴壁型，到24h时，基本贴璧，但细胞外型依然为圆形，细胞表面伸出伪足，细胞体积增大，胞浆内出现空泡。

3.2 PMA对THP-1细胞 MMP-9 mRNA表达的影响

RT-PCR结果表明，在单核细胞中有MMP-9 mRNA基础表达，在经PMA孵育后，随着孵育时间的延长，MMP-9 mRNA表达量明显增加。

3.3 PMA对THP-1细胞 MMP-9 蛋白表达的影响

Western blot检测结果表明，与RT-PCR检测结果基本一致，在单核细胞中即有MMP-9蛋白表达，在经PMA孵育后，随着PMA孵育时间的延长，MMP-9蛋白表达量明显增加，到6h时，与对照组相比，差异具有显著性（P

3.4 PMA对THP-1细胞 MMP-9活性的影响

用含明胶的SDS-PAGE 对培养液上清中的MMP-9活性检测结果表明，在经PMA孵育后，在单核细胞分化为巨噬细胞的过程中，MMP－9的活性明显增加。

4 讨论

循环血液中的单核细胞在黏附分子和单核细胞趋化蛋白的作用下，黏附于血管内皮，再穿过内皮细胞间连接迁入内皮下间隙。进入内皮下间隙的单核细胞被激活，分化为巨噬细胞。Shigeru等证实在将单核细胞与PMA孵育24小时后转化为成熟的巨噬细胞，为良好的体外单核细胞分化为巨噬细胞细胞模型。在我们的实验中，我们也观察到单核细胞与PMA孵育后，到6h时，细胞表型即发生了明显变化，细胞开始贴璧，到24h时，细胞几乎完全贴璧，并且细胞体积增大，细胞边缘伸出伪足，胞浆内出现空泡，形成巨噬细胞的形态结构。

在AS 损伤中,富含脂质的巨噬源性泡沫细胞聚集是易破斑块的重要特征,其中病灶区MMP－9表达的增加可能在斑块破裂中起重要作用 [5]。对AS 高胆固醇血症的家兔模型的动脉损伤处分离的细胞进行培养,发现这种明胶水解活性酶主要来源自巨噬源性泡沫细胞。我们的研究进一步发现，在单核细胞分化为巨噬细胞过程中，尚未形成泡沫细胞，MMP-9的表达量与活性即有明显上调。因此我们推测在单核细胞分化为巨噬细胞的过程中，MMP－9的表达及活性增加,一方面增加ECM的降解,从而有利于平滑肌细胞的迁移，促进动脉粥样硬化病变的发生和发展，另一方面加速斑块中胶原的降解，从而降低斑块的强度，促使斑块破裂。

综上所述，在单核细胞分化为巨噬细胞过程中，MMP-9表达量及活性的改变，可能对动脉粥样硬化的发生发展以及斑块的稳定性起着重要的调节作用。

参考文献

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单细胞生物定义范文3

1 材料与方法

1.1 细胞系

人膀胱癌株t24常规培养。

1.2 寡核苷酸（odns）?脂质体（lip）转染复合物

硫代磷酸修饰的寡核苷酸序列如下：反义序列：5′?cccagccttccagctccttg?3′；正义序列：5′?caaggagctggaaggctggg?3′，均引自gene bank。脂质体lipofectamine2000，按转染试剂盒说明配置不同浓度的odns?lip复合物。

1.3 western blot印迹试验

转染48 h收集细胞，triton试剂提取细胞总蛋白，紫外分光光度仪测定蛋白含量。调整至蛋白浓度2 g/l，取10 μl样品加20 μl样品处理液，95 ℃水浴加热4 min，冷却至室温。于sds?聚丙烯酰胺凝胶中加样品15 μl，指示剂至电泳槽下缘边缘时取出胶版，以电转印仪将蛋白样品转移至硝酸纤维素膜上。以封闭蛋白干粉1 g加0.02 mol/l pbst 100 ml，37 ℃封闭1.5 h。用0.02 mol/l pbst洗涤硝酸纤维素膜。dab染色，照相。重复8次。

1.4 mtt试验

t24细胞起始浓度为1×104/孔。反义odns?lip复合物100、200、400 nmol/l为转染组；正义odns?lip复合物400 nmol/l和空白作为对照组。作用24h、48h及72h后经酶标分析仪于570 nm波长检测吸光度。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡变化

取对数生长期的t24细胞，浓度为2×105个/ml。400 nmol/l 反义odns?lip复合物进行转染，对照组应用rpmi?1640培养液。流式细胞仪分别于24 h、48 h及72 h进行细胞凋亡检测。

1.6 统计学方法

采用image tool软件分析western blot图像灰度值，应用单因素方差分析和q检验，p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 western blot印迹试验

反义复合物处理t24细胞48 h，随着浓度增加，survivin蛋白表达水平下降，与正义组和对照组比较差异有统计学意义（p<0.01）。见表1。表1 western blot印迹试验结果(±s)

2.2 mtt法检测细胞抑制率

反义复合物处理t24细胞后，随着浓度与作用时间的增加，细胞生长抑制率逐渐增高，与正义组和对照组比较差异有统计学意义（p<0.01）。见表2。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

t24细胞经作用后，流式细胞仪检测出现典型的亚二倍体峰，且亚二倍体峰的峰值随处理时间的延长而增加，与正义组和对照组比较差异有统计学意义（p<0.01）。见表3。表3 400 nmol/l反义寡核苷酸作用不同时间后细胞凋亡率

3 讨论

survivin是一些恶性肿瘤有潜在价值的诊断标志和预后因子，其存在预示着肿瘤组织分化不良，临床分期高，5年生存率及总生存率下降，无瘤生存时间缩短，复发率增加[3，4]。survivin是肿瘤特异性的凋亡抑制蛋白，在成人大多数肿瘤组织中表达水平异常升高[5]。可采取抑制其表达或干扰其作用的策略来治疗肿瘤，其分子靶向治疗单独或与其他抗癌治疗联合应用，可抑制体外肿瘤的形成及已形成肿瘤的生长[6]。

本研究中western blot印迹试验表明survivin反义复合物可以下调t24细胞survivin蛋白表达，其表达水平随着反义复合物浓度的增加而进行性下降。提示脂质体的反义转染是成功的，反义survivin复合物可以明显下调t24细胞survivin蛋白的表达，并呈现一定的浓度依赖性。mtt结果显示t24细胞凋亡率随处理时间的延长而呈现增加趋势。流式细胞仪检测出t24细胞经反义surivin复合物处理后出现典型的细胞凋亡亚二倍体峰，且亚二倍体峰的峰值随处理时间的延长而增加。亚二倍体峰的出现与增加是量化膀胱癌细胞凋亡的客观指标，说明经脂质体转染的survivin反义寡核苷酸可诱导膀胱癌细胞发生凋亡，且凋亡细胞率有一定时间依赖性。

研究表明，survivin分子靶向治疗可通过诱发肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤新生血管形成的双重机制来发挥抗肿瘤作用[7]。高凋亡指数组患者的5年生存率明显高于低凋亡指数组，说明诱导肿瘤细胞凋亡是一种有效的抗肿瘤治疗手段[8]。本组资料表明经脂质体转染的survivin反义寡核苷酸可诱导体外培养人t24膀胱癌细胞发生凋亡，可能为膀胱癌的综合治疗提供新的方法。

【参考文献】

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单细胞生物定义范文4

5?fu、as2o3、hcpt与pei?asodn物联合使用后，其ic50分别降低到3.9μg/ml、2.67μmol/l、1.46μg/ml,化疗药物的敏感性分别提高到单用化疗药物的2.86、1.84和4.01倍。结论 pei介导的pkc?α asodn与化疗药物5?fu、 as2o3、hcpt联合使用,可提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性,通过与化疗药物的相加或协同作用,减少化疗药物的用量。

【关键词】 蛋白激酶c我反义核酸们肝肿瘤 化学治疗 聚乙烯亚胺

原发性肝癌是一种对化疗药物不敏感的恶性肿瘤[1] 。有报道在肝细胞癌变过程中,细胞信号转导异常起到了关键的作用,其中pkc?α表达异常与肝癌的发生发展密切相关[2, 3]。反义寡脱氧核苷酸可以通过转录后抑制来抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡，但是细胞摄取率低、易被核酸酶水解，且使用剂量过大，费用昂贵。阳离子聚合体pei作为asodn载体可以显著提高其转染效率[4]。临床常规抗肿瘤药物虽然抗肿瘤效果肯定，但是其毒副作用大，易产生耐药性，病人耐受差，同样难以起到令人满意的效果[5?7]。因此，本实验研究旨在探讨用聚乙烯亚胺作为载体，pkc?α asodn联合5?fu、hcpt、as2o3等常规抗肿瘤药物作用于肝癌细胞，增强常规化疗药物的抗肿瘤作用，降低用药剂量，从而提高病人的生存时间和生活质量，减轻病人的经济负担。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人肝癌smmc?7721细胞由中山大学生物化学教研室惠赠；用含10%新生牛血清，rpmi1640培养。

1.2 试剂 cck?8（cell count kit?8）试剂（日本同

仁化学研究所）；新生牛血清（天津tbd?广州展晨）；pkc?α asodn（北京塞百盛基因技术有限公司）,全硫代修饰,page纯化, -20℃冻存,使用前用无酚红rpmi 1640培养液溶解。pkc?a antisense：5′?gttctcgctggtgagtttca?3′。

1.3 wst?8法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期、苔盼兰拒染率> 95%的细胞, 调整浓度为5 ×104/ml, 每孔100μl, 接种于96孔板,设3 复孔, 培养4h, 待贴壁达40%～50%后,加入药物。设空白对照组、单纯asodn组、单纯化疗药物组、asodn 联合化疗药物组和pei?asodn联合化疗药物组,各组pkc?α asodn浓度均为0.25μg/ml; pei与pkc质量比为3∶4，见表1～3；培养48h后, 每孔加入cck?8试剂10μl, 继续培养1h, 多功能酶标仪(bio?rad)测定吸光度a450nm (激发波长450nm, 参比波长655nm), 计算增殖抑制率及各组ic50；增殖抑制率＝[a（对照组）－a（实验组）]/a（对照组）×100%；各化疗药增敏倍数＝单纯用药组的ic50/ 联合用药组的ic50。

1.4 统计学方法 所有数据均用±s表示，使用统计软件spss 13.0。

1.5 金正均q值法[8]判断化疗药物与反义核酸联合使用的效果 q = ea + b/(ea + eb ? ea ×eb), ea和eb 分别为单用反义核酸和单用化疗药物的抑制率,ea + b为合并用药的抑制率。式中分子代表“实测合并效应”,分母是“期望合并效应”,q 值是两者之比,q< 0.85为拮抗,0.85≤q< 1.15为相加,q ≥1.15为协同。2 结果

2.1 5?fu与pei?asodn联合使用效果 单用5?fu的ic50为15.64μg/ml;5?fu与asodn联合使用,表现为拮抗作用(q<0.85), ic50为26.74μg/ml;5?fu与pei?asodn联合使用,表现为协同作用(q≥1.15), ic50为3.9μg/ml, 增敏倍数为4.01,见表1、 4。

2.2 as2o3与pei?asodn 联合使用效果 单用as2o3的ic50为4.93μmol/l; as2o3与asodn 联合使用,表现为拮抗作用(q<0.85), ic50为5.33μmol/l; as2o3与pei?asodn联合使用,表现为相加作用(0.85≤q<1.15), ic50为2.67μmol/l, 增敏倍数为1.84，见表2、 4。

2.3 hcpt与pei?asodn 联合使用效果 单用hcpt的ic50为4.18μg/ml; hcpt与asodn 联合使用,表现为相加作用(0.85≤q <1.15), ic50为3.1μg/ml，增敏倍数为1.34; hcpt与pei?asodn联合使用,表现为协同作用(q≥1.15), ic50为1.46μg/ml, 增敏倍数为2.86,见表3、 4。

3 讨论

蛋白激酶c已经成为肿瘤研究领域的热点之一。研究发现,pkc?α 磷酸化后活化多种蛋白分子，引起分化、增殖、胞膜转运、基因表达等一系列细胞反应。 药物或反义技术封闭pkc?α 表达和活性, 可以抑制肿瘤细胞的生长、 促进凋亡、 抑制侵袭转移,以及增强对化疗药物的敏感性[9]。研究表明pkc?α反义核酸可以抑制胰腺癌、宫颈癌等肿瘤的表1 不同浓度的5?fu及其联合asodn 或pei?asodn对smmc?7721细胞增殖抑制作用的比较表2 不同浓度的as2o3 及其联合asodn或pei?asodn对smmc?7721细胞增殖抑制作用的比较(μmol/l)表3 不同浓度的 hcpt及其联合asodn或pei?asodn 对smmc?7721 细胞增殖抑制作用的比较 as为asodn；p?a为pei?asodn增殖[10?12]。因此，我们针对蛋白激酶c mrna的sd序列上游非编码区设计合成反义核酸，阻断与pkc?α相关的信号通路来抑制肿瘤生长、促进其凋亡。

本实验选用肝癌常用药物5?fu、 as2o3及hcpt分别与pei?asodn联合使用。结果表明：化疗药物与pei?asodn联合使用组的ic50最低, 分别将smmc?7721细胞对5?fu、 as2o3、 hcpt的敏感性分别提高到单用化疗药物4.01、1.84、2.86倍，这是由于asodn和化疗药物通过不同的机制共同作用于肝癌细胞,提高了肝癌细胞对化疗药物的敏感性所致。金正均q值法[8]分析化疗药物与反义核酸的相互作用表明: pei? asodn与5?fu、hcpt联合使用,均表现为协同作用;与as2o3联合使用,仅表现为相加作用，联合作用效果不如5?fu、hcpt明显，原因可能是带负电荷的asodn增加了细胞膜外的电负性，影响了细胞对as2o3的摄入。而线性pei作为一种高效、低毒的阳离子聚合物,能和dna形成中性或者带正电的复合物,即pei?asodn，不仅介导asodn的摄入，而且通过中和部分细胞膜外的负电荷来促进化疗药的摄入，通过不同的机制共同作用肝癌细胞，抑制生长、促进凋亡。

肝癌属于对化疗敏感性差、耐药性强的恶性肿瘤,而肝癌患者常患肝硬化和慢性肝炎,肝功能差,不易耐受长期、大剂量的化疗。本实验通过联合使用化疗药物和pei?asodn，既能减少反义核酸的使用量,又可减少化疗药物的剂量,对于肝癌治疗中减少药物的毒副作用,增强化疗药物的疗效有很好的效果。

【参考文献】

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单细胞生物定义范文5

舌癌以其浸润性强，转移速度快，治疗效果差等生物学特点颇受学术界关注。近年的研究［1－3］表明，在众多的组织学特征中，癌灶的浸润方式更能反映肿瘤的生物学行为。众所周知，肿瘤是细胞变异的结果，恶性肿瘤细胞无限制地生长、细胞核增大、核内染色质增多，其实质是细胞核内DNA不断复制的结果。国内外大量病理和临床资料已经证明，检测恶性肿瘤细胞DNA含量与倍体已成为目前研究肿瘤生物学特性及估计患者预后的热点问题。本课题拟从肿瘤－宿主边缘瘤细胞浸润分型出发，研究不同浸润方式舌癌细胞DNA倍体及细胞周期中S期细胞比例，从分子水平揭示舌癌生物学行为。

1材料与方法

1．1临床资料及标本处理收集兰州大学第二医院和西北民族大学口腔医院病历资料完整的病理确诊为舌癌的43例存档蜡块，所有患者术前均未行放化疗。其中男28例，女15例，年龄34～72岁。所有蜡块作5μm厚组织切片，行常规HE染色，阅片采用双盲法，由2位有经验的病理科医师按Anneroth等［4］介绍的方法浸润分型和肿瘤组织病理分级分类(WHO1997标准):Ⅰ型14例，Ⅱ型13例，Ⅲ型10例，Ⅳ型6例;病理分化程度:高分化23例，中、低分化20例。其中淋巴结转移17例，未转移26例。浸润分型后，所有蜡块重作50μm厚组织切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，胃蛋白酶消化，过滤，离心，漂洗，75%酒精固定，备检。

1．2单细胞悬液DNA荧光染色及上机检测备检样品离心、去上清、漂洗后用碘化丙啶(PI)一步插入性DNA定量荧光染色，4℃避光反应30min，用美国BECKMANCOULTE公司的EpicsXL型流式细胞仪上机检测，上机前需校正仪器，使其峰值的分辨率(CV值)在5%以内。以正常舌体组织作对照。

1．3分析指标用ModFitLT分析软件分析DNA倍体、细胞周期，依据DI值判定DNA倍体，0．9≤DI≤1．1为DNA二倍体;DI＜0．9或＞1．1为异倍体。DI=肿瘤细胞G0/G1峰道数/正常舌体二倍体细胞G0/G1峰道数，DNA异倍体的判定:在DNA直方图上出现明显的2个峰且异倍体细胞群至少应含20%的细胞或核同时DI＜0．9或DI＞1．1，同时测定SPF，SPF(%)=［S÷(G0/G1+S+G2/M)］×100%。

1．4统计分析采用统计学软件SPSS10．0对计量资料进行t检验，计数资料进行χ2检验。检验水准取α=0．05。

2结果

2．1浸润方式与淋巴结转移的关系根据临床病理资料统计，43例舌癌病例中有淋巴结转移者17例，其中Ⅰ、Ⅱ型浸润方式淋巴结转移者7例，阳性率为25．93%(7/27);Ⅲ、Ⅳ浸润方式型淋巴结转移者10例，阳性率为62．50%(10/16)。经统计学处理，Ⅰ、Ⅱ型与Ⅲ、Ⅳ型之间淋巴结转移率差异有统计学意义(P＜0．05)。

2．2浸润方式与肿瘤组织病理分化程度关系27例Ⅰ、Ⅱ型浸润方式者中，高分化20例，中、低分化7例;16例Ⅲ、Ⅳ型浸润方式者中，高分化3例，中、低分化13例。经统计学处理，Ⅰ、Ⅱ型和Ⅲ、Ⅳ型之间病理分化程度差异有统计学意义(P＜0．05)。

2．3浸润方式与DNA倍体、SPF之间的关系43例舌癌中，二倍体肿瘤18例，占41．9%，异倍体肿瘤25例，占58．1%，各浸润分型异倍体所占比例及SPF均值见表1。研究结果显示:随着浸润分型的发展，异倍体肿瘤检出率及SPF逐渐上升，经统计学分析，差异有统计学意义(P＜0．05)。

单细胞生物定义范文6

关键字：shRNA表达载体RNA干涉HIF1基因

RNA干涉（RNA interference， RNAi）是将双链RNA（dsRNA）导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程。它是转录后基因沉寂（PTGS）的一种。1998年， Fire等[1]在利用反义核酸技术来抑制线虫基因表达时意外地发现， 由正义和反义RNA退火形成的dsRNA引起的基因表达抑制要比单独应用正义或反义RNA强10倍以上。dsRNA引起的基因表达抑制不是正义或反义RNA引起的基因表达抑制在数学上的叠加， 这就说明dsRNA触发了细胞内的一些反应机制， 从而引起了高效和特异的基因表达抑制效果。当时， 他们就把这种现象命名为RNAi。RNAi的应用谱非常广泛， 从单细胞生物一直到人。其中研究最多的就是线虫， 其次就是果蝇。哺乳动物细胞的RNAi应用研究并不象无脊椎动物那样进展得那么顺利。Wianny等[2]将dsRNA用显微注射的方法在小鼠胚胎成功进行了RNAi。Sayda等[3]用人工合成的21ntRNA二合体在培养的哺乳动物细胞成功进行了RNAi。Brummelkamp等[4]利用载体表达的shRNA在许多培养的人源， 猴源和鼠源的哺乳动物细胞的RNAi实验中取得了成功。

在真核细胞内， RNA聚合酶III能指导短RNA的表达和RNA聚合酶III结合的启动子有H1， U6等。目前， 这两种启动子都被尝试作为表达短RNA的工具。本实验旨在克隆得到的H1启动子的基础上构建一个能稳定表达shRNA的真核载体。然后针对HIF1基因mRNA设计靶标， 在培养的SGC7901细胞（胃癌细胞系）内进行RNAi实验， 以观察新建的pWH1载体在基因沉默中的使用效率。这将为以后新基因的功能研究和基因治疗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 pEGFPC1质粒为CLONTECH公司产品； 各种限制性内切酶为NEB公司产品。T4连接酶、 Pfu DNA聚合酶和DL 2000 DNA marker为TaKaRa公司产品。各种引物均由北京赛百盛公司合成。SGC7901细胞由全军消化病研究所保存。Superscript II反转录试剂盒购自Invitrogen公司； 兔抗人HIF1多抗、 兔抗人βactin多抗和Western blot Luminol Reagent为Santa Cruz公司产品。Top10菌种由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 以pEGFPC1为框架构建shRNA表达载体pWH1 （1）用Ase I和Mlu I双酶切， 去掉pEGFPC1质粒上PCMV， EGFP， MCS 和SV40polyA等片段， 剩余的部分作为构建pWH1的框架。在Ase I和Mlu I之间加上一个接头DNA序列， 该段接头DNA由下面2条引物退火形成（退火温度： 39.5℃）： 序列1： 5′TAATGGAATTCGAAGCTTA3′； 序列2： 5′CGCGTAAGCTTCGAATTCCAT3′。（2）通过PCR从人血细胞基因组DNA获得H1 RNA基因Promoter[5]。取新鲜血液20 mL， 以1300 r/min离心15 min， 取淡黄层细胞（白细胞）重悬于15 mL抽提缓冲液（10 mmol/L TrisCl pH8.0， 0.1 mmol/L EDTA pH8.0， 20 mg/L胰RNA酶， 5 g/L SDS）， 37℃温育1 h。加蛋白酶K至终浓度为100 mg/L， 温和混匀。50℃水浴中放置3 h。冷却至室温后， 用等体积酚和氯仿抽提后， 加入0.2体积10 mol/L乙酸铵和2体积的乙醇， 放置30 min， 12000 r/min离心10 min。700 mL/L乙醇洗涤2次， 空气中晾干。加入1 mL TE（pH8.0）溶解DNA， 此即人血细胞基因组DNA。以此DNA为模板， PCR引物为： P1： 5′CCATGGAATTCGAACGCTGACGTC3′（含EcoR I位点）； P2： 5′GCAAGCTTAGATCTGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC3′ （含Hind III， Bgl II位点）。 PCR产物通过EcoR I和Hind III两个酶切位点克隆入pUC19质粒， 进行序列验证。（3）pWH1载体的构建： PCR产物用EcoR I和Hind III双酶切， 克隆入同样用这两种酶双酶切的上述框架载体。新载体命名为pWH1。

1.2.2 用pWH1进行沉默HIF1基因的表达 （1）以人HIF1 cDNA基因为靶标的引物设计： 选取人HIF1 cDNA基因（GenBank登录号： AF304431）中的512～530核苷酸为靶标， 设计两条引物。序列如下： 引物1： 5′GATCCCCTGAAGTGTACCCTAACTAGTTCAAGAGACTAGTTAGGGTACACTTCATTTTTGGAAA3′； 引物2： 5′AGCTTTTCCAAAAATGAAGTGTACCCTAACTAGTCTCTTGAACTAGTTAGGGTACACTTCAGGG3′。（2）构建针对HIF1基因的shRNA表达载体pWH1HIF1。将上面合成的两条引物用TE（pH8.0）稀释成0.5 nmol/μL。各取5 μL混匀， 沸水中放置10 min， 缓慢冷却至室温4℃-20℃保存备用。用限制性内切酶Bgl II和Hind III对质粒pWH1做双酶切。用T4连接酶对pWH1质粒和退火产物进行连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。铺于含卡那霉素的LB平板上， 37℃培养24 h。挑取单克隆并提取质粒。用限制性内切酶EcoR I和Hind III对候选阳性克隆质粒做双酶切鉴定。阳性克隆质粒命名为pWH1HIF1。（3）转染胃癌细胞系SGC7901： SGC7901细胞用RPMI1640培养液（含100 mL/L小牛血清）在37℃、 50 mL/L CO2条件下培养。转染前24 h将处于对数生长期的细胞重新接种于6孔板（瞬时）和24（稳定）孔板中， 贴壁细胞在长满底面积80%时进行转染。转染按照LipofectamineTM2000试剂说明书操作。于转染后48 h收集6孔板内细胞，做为瞬时转染细胞表型鉴定用。于转染后72 h按1∶10比例传代于60 mm直径培养皿中， 然后加入适量（400～1000 mg/L）G418进行筛选， 2周后挑取单个细胞集落， 扩大培养， 然后做为稳定转染细胞表型鉴定用。（4）RTPCR检测HIF1基因的mRNA水平： 待6孔板内细胞生长至底面积90%～95%时， 收集细胞。参照Gibco公司TRIzol试剂使用方法提取细胞RNA， 溶于20 μL DEPC水内。用SuperScriptTM II RT kit参照其使用说明进行cDNA第1条链的合成。人βactin内对照引物： P1： 5′GGCCGGGACCTGACTGACTAC； P2： 5′TCTTTGCGGATGTCCACGTC（长度331 bp）。人HIF1 RTPCR引物： P3： GATCTCGGCGAAGTAAAGAATCTG； P4： AGAAAATTTCATATCCAGGCTGT（长度680 bp）。PCR反应条件： 95℃ 1 min（94℃ 40 s； 56℃ 40 s； 72℃ 40 s）×26 cycle； 72℃ 10 min； 4℃保存。（5）Western blot检测HIF1的蛋白水平： 已处理的转染细胞样品经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后， 100 伏转移3 h至NC膜上， 50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h， 依次加入1∶2500稀释的兔抗人一抗4℃孵育过夜， 1∶5000稀释的HRP标记的鼠抗兔二抗作用2 h， 加入Luminol试剂， 并以X光片捕捉HRP催化Luminol试剂所产生的激发光。

2 结果

2.1 shRNA表达载体pWH1构建的实验结果

2.1.1 从人血细胞基因组DNA中扩增得到H1 RNA基因Promoter PCR反应体系： DNA模板2 μL， P11 μL， P21 μL， Taq 0.5 μL， dNTP 2 μL， 10×buffer 5 μL， H2O 38.5 μL， 总体积50 μL。PCR反应条件为： 94℃ 5 min（94℃ 30 s； 45℃ 45 s； 72℃ 30 s）×5 cycle； （94℃ 30 s； 56℃ 45 s； 72℃ 30 s）×25 cycle； 72℃ 2 min； 4℃保存。10 g/L琼脂糖凝胶电泳后， 在250 bp左右可以见到一扩增条带（图1）， 大小与理论预计一致。

图1 H1基因启动子的PCR扩增电泳结果（略）

Fig 1 AGE analysis of PCR products encoding H1 gene promoter

M： DNA marker DL 2000； 1： PCR of H1 gene promoter.

2.1.2 重组质粒pUC19H1的酶切鉴定 上述PCR产物经EcoR I和Hind III双酶切后， 克隆入pUC19载体。阳性克隆命名为pUC19H1（图2）。pUC19H1质粒递交上海生工公司测序， 结果显示， 与GenBank的H1基因启动子序列（登录号： X16612）完全一致。

图2 重组质粒pUC19H1的酶切鉴定结果（略）

Fig 2 AGE analysis of recombinant plasmid pUC19H1 digested with EcoR I and Hind III

M： DNA marker DL 2000； 1， 2： pUC19 H1.

2.1.3 pWH1双酶切鉴定 pEGFPC1质粒经Ase I和Mlu I双酶切后， 加上一段由2条引物退火形成的接头DNA， 此框架质粒命名为pWK。再利用接头上带有的EcoR I和Hind III酶切位点将pUC19H1质粒上的目的片段亚克隆到这个框架质粒上。新的质粒命名为pWH1（图3）。

图3 pWH1质粒的酶切鉴定结果（略）

Fig 3 AGE analysis of plasmid pWH1 digested with EcoR I and Hind III

M： DNA marker DL 2000； 1： pWK； 2： pWH1.

2.2 pWH1HIF1的酶切鉴定结果 将合成的2条引物退火后， 从Bgl II和Hind III两个酶切位点克隆到质粒pWH1。新的质粒命名为pWH1HIF1。用EcoR I和Hind III对pWH1HIF1进行双酶切鉴定（图4）， 阳性克隆切下约310 bp片段， 阴性克隆切下约250 bp片段。

图4 pWH1HIF1质粒的酶切鉴定（略）

Fig 4 AGE analysis of recombinant plasmid pWH1HIF1 digested with EcoR I and Hind III

M：DNA marker DL 2000； 1： pWH1HIF1； 2： pWH1.

2.3 pWH1HIF1瞬时转染SGC7901细胞 将准备好的pWH1HIF1质粒5 μg用脂质体方法转染入SGC7901细胞， 48 h后收集细胞。用TRIzol试剂抽提细胞RNA， 进行RTPCR。12 g/L琼脂糖凝胶电泳结果（图5）可以看出， RNAi后和对照组相比mRNA被明显降解。

图5 pWH1HIF1瞬时转染SGC7901细胞后的RTPCR结果（略）

Fig 5 RTPCR result of SGC7901 cells transient transfected with pWH1HIF1

M： DNA marker； 1： SGC7901； 2： SGC7901transfected with pWH1； 3： SGC7901 transfected with pWH1HIF1.

2.4 pWH1HIF1稳定转染SGC7901细胞 将准备好的pWH1HIF1质粒2 μg用脂质体方法转染入SGC7901细胞， 按有限稀释法挑取单克隆细胞。用TRIzol试剂抽提细胞RNA， 进行RTPCR。12 g/L琼脂糖凝胶电泳结果（图6）可以看出， RNAi后和对照组相比mRNA被明显降解。

图6 pWH1HIF1稳定转染SGC7901细胞后的RTPCR结果（略）

Fig 6 RTPCR result of SGC7901 cells stable transfected with pWH1HIF1

M： DNA marker； 1： SGC7901 transfected with pWH1HIF1； 2： SGC7901 transfected with pWH1； 3： SGC7901.

2.5 Western blot检测HIF1基因的RNA干涉效果 挑取3个稳定转染pWH1HIF1质粒的SGC7901单克隆细胞。用抗HIF1抗体进行Western blot和化学发光显色（图7）可见， RNAi后和对照组相比HIF1的蛋白表达水平明显下降。

图7 pWH1HIF1稳定转染SGC7901细胞后的Western blot结果（略）

Fig 7 Western blot result of SGC7901 cells stable transfected with pWH1HIF1

1-3： 3 SGC7901 cell clones transfected stably with pWH1HIF1； pWH1： SGC7901 cell clone transfected stably with pWH1.

3 讨论

RNAi一经发现， 立即成为科学研究的一大热点。这是因为RNAi这个生物领域的新兴事物， 本身具有它的神秘性， 同时又具有广阔的应用前景[6]。RNAi已经被应用到线虫的系统基因组研究上， RNAi作为一个工具， 它的应用范围可以从单细胞的原生动物一直扩展到人。使哺乳动物细胞产生特定基因的功能丧失表型， 对于新基因功能研究、 新蛋白质药物的开发和基因治疗等方面都具有重要的意义。本实验构建的pWH1载体， 能在真核细胞内表达shRNA， shRNA可以有效模仿siRNA， 使目标蛋白的mRNA发生特异性的降解。pWH1可被广泛用于真核细胞的RNAi实验模型。

缺氧诱导因子1（HIF1）是机体细胞在低氧环境中产生的一种结合DNA蛋白质因子， 在低氧信号中起到一个重要的中介作用， 通过转录水平参与对低氧反应基因的调控， 从而使机体对低氧刺激作出复杂的病理生理反应[7]。HIF1在多种肿瘤中广泛存在， 它与一系列缺氧反应靶基因上的特定结合位点缺氧反应元件（hypoxia response element， HRE）结合， 从而启动靶基因的转录表达， 同肿瘤的增殖、 转移密切相关[8]。Talks等[9]发现大多数恶性肿瘤细胞中有HIF1表达， 且HIF1在肿瘤坏死明显的区域和肿瘤浸润的边缘表达明显增多。本实验在胃癌细胞系SGC7901中利用所构建的pWH1载体成功降低了HIF1基因的表达， 这对研究胃癌的发生、 增殖、 多药耐药和治疗等均有重要的意义。

【参考文献】

[1] Fire A， Xu S， Montgomery MK， et al. Potent and specific genetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegans[J]. Nature， 1998， 391（6669）： 806-811.

[2] Wianny F， ZernickaGoetz M. Specific interference with gene function by doublestranded RNA in early mouse development[J]. Nat Cell Biol， 2000， 2（2）： 70-75.

[3] Sayda ME， Jens H， Winfried L， et al. Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J]. Nature， 2001， 411： 494-498.

[4] Brummelkamp TR， Bernards R， Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells[J]. Science， 2002， 296（5567）： 550-553.

[5] 萨姆布鲁克J， 弗里奇EF， 曼尼阿蒂斯T（金冬雁， 等译）. 分子克隆实验手册[M]. 北京： 科学出版社， 1996： 465-467.

[6] 吴元明， 陈苏民. RNA干涉最新研究进展[J]. 中国生物化学与分子生物学报， 2003， 19（4）： 411-417.

[7] Arjamaa O， Nikinmaa M. Oxygendependent diseases in the retina： Role of hypoxiainducible factors[J]. Exp Eye Res， 2006， 83（3）： 473-483.