单细胞动物的特征范文1
[关键词] 涎腺导管癌； 巨细胞瘤； 病理学； 免疫组织化学； 组织起源
[中图分类号] R 739.87 [文献标志码] B [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.024
以巨细胞瘤（giant cell tumor，GCT）为主要特征的原发性涎腺导管癌（salivary duct carcinoma，SDC）是极为罕见的相对新认识的尚未完全定义组织发生学的一种肿瘤。GCT通常与另一个唾液腺原发肿瘤（如SDC、癌肉瘤等）存在关联。无痛的、不断进展的肿块是最常见的症状。本文报道1例发生于腮腺的伴有GCT的SDC，并结合文献，探讨该肿瘤的临床特点、病理学改变及组织学起源等。
1 病例报告
患者男性，68岁，2011年5月以“发现左耳下肿物20多天”入院。大约20多天前，患者突然感觉左耳下不适，自己检查发现局部有一包块。无发热，否认牙痛，无外伤、手术史。专科检查：颜面部基本对称，左侧腮腺下极略膨隆，可扪及腮腺部一肿物，约2.0 cm×2.0 cm大小，肿块表面皮肤颜色正常，质地中等，无压痛，表面无明显分叶状，与周围组织无粘连，活动度良好；无面瘫症状；双侧髁突活动良好，张口度约二指。咬合关系良好，上颌及腭部未见异常，舌运动良好，伸舌居中；口内牙龈和黏膜颜色正常，右腮腺、双颌下腺未扪及异常，导管开口无红肿，分泌液清亮；咽部未见异常；双侧颌下及颈部淋巴结无肿大。
超声检查（图1）：左侧腮腺形态、大小如常，下极可见一个低回声肿块，大小约1.6 cm×1.0 cm，形状呈类圆形，实质回声不均匀，边界不规整，向周边组织呈浸润状，彩色多普勒血流显像（color Dop-pler flow imaging，CDFI）未见明显血流信号。诊断：
左侧腮腺实质性占位，恶性可能。其余影像学资料未见软组织及骨组织占位。
门诊以“左腮腺腺淋巴瘤”收入院。全身麻醉下行“左腮腺切除术”，术中见肿物位于腮腺下部，
结节状，大小1.8 cm×1.5 cm×1.2 cm，无包膜，界尚清，切面淡黄，实性，质中，未见明显出血、坏死（图2）。手术切除面神经总干下方腮腺组织和肿瘤，结扎腮腺残端。切除标本4%多聚甲醛固定，常规石蜡切片，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，
HE）染色，光镜下观察。免疫组织化学采用EnVision
两步法，所用一抗Pan-CK、HMWCK、CK8/18、CK5/6、CK19、CK7、EMA、AR、Her-2、GCDFP-15、P53、CD68、Vimentin、Lysozyme、PSA、ER、TTF-1、CEA、CDX2均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
术后病理组织观察：在残存、萎缩的涎腺组织中，肿瘤呈现两种不同的组织结构浸润生长，以位于中心的GCT结构为主，约占肿块的80%，表现为成片单核细胞背景中均匀地散见的多核、破骨细胞样巨细胞。巨细胞特征性地有多个位于细胞中央的圆形-卵圆形泡状核（总数2～50个，平均15个），单一小核仁清晰，胞质嗜伊红。单核细胞有类似巨细胞的圆形-卵圆形泡状核，细胞大小相近，胞质弱嗜伊红（图3左）。在肿瘤周边，表现典型SDC的侵袭性、
恶性特征。GCT和SDC之间无界限，可看到移行过渡区（图3右）。无类骨质形成。
免疫组织化学：SDC细胞弥漫而强烈地表达Pan-CK（图4）、HMWCK、CK7、CK5/6、CK8/18、CK19、
EMA、AR、Her-2、GCDFP-15、P53，单核细胞以及破骨样巨细胞均表达CD68（图5）和波形蛋白，部分单核细胞还表达Pan-CK、CK5/6、EMA、P53及局灶表达溶菌酶；破骨样巨细胞不表达上皮标志物及AR、Her-2和GCDFP-15。散在的高度异型的与巨细胞相混合或被其吞噬的单核细胞也表达上皮标志物。所有的PSA、ER、TTF-1、CEA、CDX2均为阴性。
2 讨论
2.1 临床表现和诊断
涎腺原发性GCT是极为罕见的病理类型，组织形态类似骨巨细胞瘤。1984年Eusebi等[1]报道3例腮
腺GCT，其中1例伴腮腺癌在多形性腺瘤癌（carcinoma ex pleomorphic adenoma，CXPA）中。截止目前，仅有17例涎腺GCT的报道。结合本例报道并总结文献，涎腺GCT通常与另一个唾液腺原发肿瘤存在关联，半数病例伴有癌，通常是SDC、CXPA、癌肉瘤等[2-3]。
这些病例中，15例（83%）发生在腮腺，2例（11%）发生在颌下腺，1例（6%）发生在小唾液腺[4]。患者年龄28～92岁（平均61岁），多数为男性（男女比例4∶1）。
无痛的快速进展的肿块是最常见的症状，少数病例也会缓慢生长。切除术后9个月，8例患者没有任何症状，1例颈部淋巴结转移[5]，1例死于癌播散（肺转
移）[6]。一般来说，由于SDC成分，伴有SDC的GCT相对于骨巨细胞瘤更具侵袭性。
切除标本多为涎腺内的结节状肿物，无包膜或菲薄不完整薄膜，界清，切面淡黄或灰白，质中偏软。出血、坏死多见。组织学特征：在残存、萎缩的涎腺组织中似乎有两个毗邻彼此不同的肿瘤浸润生长，两种肿瘤之间可以看到移行过渡区。一个肿瘤表现典型涎腺导管癌的侵袭性、恶性特征；另一个表现为破骨细胞样巨细胞瘤。前者主要位于肿瘤周围，有典型的腺样、筛孔状、“Roman桥”样、粉刺样坏死及实片状特征。间质见纤维化和炎症细胞浸润，可见血管和神经浸润。导管癌细胞由高核浆比的非典型上皮细胞构成，细胞异型性大，泡状核，核仁显著，含丰富粉红色颗粒状细胞质，嗜酸细胞化生常见。后者GCT成分占肿块的60%～80%，表现为成片单核细胞背景中均匀地散见的多核、破骨细胞样巨细胞。巨细胞特征性的有多个位于细胞中央的圆形-卵圆形泡状核，核染色质均匀、细腻，单一小核仁清晰，胞质嗜伊红。单核细胞有类似巨细胞的圆形-卵圆形泡状核，细胞大小相近，胞质弱嗜伊红。在邻近涎腺导管癌的移行过渡区，高度异型的单核和多核瘤细胞与巨细胞瘤相混合，部分细胞甚至被破骨细胞样巨细胞所吞噬。在部分区域，涎腺导管癌和巨细胞瘤由纤维组织分隔，另外的区域可看到似乎已融合，二者间无清晰的边界。间质血管丰富、出血、多灶性坏死。无类骨质形成。免疫组织
化学染色：SDC细胞一般强表达上皮标志物（EMA，CK系列）和AR、Her-2、GCDFP-15、P53；单核间
质细胞及破骨样巨细胞表达CD68、波形蛋白、P53、溶菌酶，部分尤其邻近SDC的单核间质细胞还表达Pan-CK、EMA等上皮标志物；破骨样巨细胞不表达GCDFP-15、AR和Her-2。散在的、高度异型的与巨细胞相混合或被其吞噬的单核细胞也表达上皮标志物。所有成分的ER、TTF-1、CEA、CDX2均为阴性，PSA一般为阴性，少数SDC阳性，这有助于排除转移性癌。涎腺GCT中的一些单核细胞对组织细胞和上皮标志物均有反应[1-8]。由于涎腺GCT多伴有各种癌性成分，诊断涎腺GCT时，所有的标本必须仔细检查，多处取材非常必要，并辅以免疫组织化学验查。
2.2 起源
过去一度认为，涎腺原发性GCT与骨巨细胞瘤同源，但最近的一项研究[7]认为，其更像是癌。近来，基于具有和骨巨细胞瘤不同的p53基因位点的杂合性
缺失和微卫星不稳定性，Tse等[7]认为涎腺GCT是与
骨巨细胞瘤无关的肿瘤实体而不是反应性病变。然而，尚不清楚这种肿瘤是否是一个不寻常的化生癌或者起源于间质或干细胞。虽然涎腺原发性GCT与骨巨细胞瘤形态上相似，但还是有一些特征可以使之区别于骨巨细胞瘤和其他骨外的巨细胞瘤。例如，涎腺肿瘤更具生物学侵袭性，多有癌性成分，在近移行过渡区可见散在的、明显的恶性上皮细胞与单核细胞成分混合，外周不见与之相关的反应性骨形成，临床及影像学检查也容易将侵入腮腺的颌骨骨巨细胞瘤排除。一些对涎腺GCT的超微结构的研究也观察到：虽然巨细胞有类似于骨破骨细胞的特征，但单核细胞有很多微绒毛和一些细胞-细胞间接合部；单核细胞细胞质局灶性表达溶菌酶，而骨或癌组织的巨细胞不表达[6]。Nagao等[8]报道1例SDC伴肉瘤样区域及GCT样组织结构，认为涎腺GCT可能是癌肉瘤。原因如下：涎腺GCT共存癌性区域非常多见；涎腺GCT的单核细胞没有明显的恶性特点，但有一定程度的核异型性；如同SDC成分一样，涎腺GCT的单核细胞表达p53，都有肿瘤特征；单核细胞除表达组织细胞外，还表达上皮标志物如Pan-CK和EMA；许多所谓的组织细胞标志物没有特异性，在非组织细胞中也表达。Tse等[7]报道SDC成分和GCT成
分具有类似的基因表型。本文病例也显示了癌和单核细胞的混合和移行过渡，涎腺GCT可能从SDC转分化而来，因此涎腺GCT可能是SDC的肉瘤样变异。
2.3 鉴别诊断
对癌肉瘤或肉瘤化癌来说，上皮和间叶细胞均异型性明显，核分裂像多见，间叶成分多表现为梭形细胞，其组织结构及形态多样，免疫组织化学分别表达上皮及间叶标志物。病史、有无外伤、手术史、无局部炎性肿痛有助于除外涎腺巨细胞肉芽肿及反应性的异物巨细胞，虽然涎腺巨细胞肉芽肿也常与肿瘤相关，但其不表达上皮标志物和p53。本文病例表达p53、Pan-CK、EMA，是肿瘤而不是巨细胞肉芽肿[2]。原发于涎腺软组织的巨细胞瘤极为罕见，通常
不伴有癌性成分（如典型SDC），而且一般不表达上皮标志物（如Pan-CK、EMA等）。涎腺未分化癌巨细胞一般为瘤巨细胞，异型性明显，核仁显著，核分裂像多，可有明显的梭形细胞成分，免疫组织化学上巨细胞和梭形细胞都表达上皮标志物。病史、组织形态及辅助免疫组织化学检查一般可有效鉴别转移性癌。
2.4 治疗和预后
手术切除是涎腺GCT主要的治疗手段，广泛彻底地切除肿瘤是提高生存率的关键，但对放、化疗方案及疗效尚无统一意见。研究[4-5，8]表明：以巨细
胞瘤为特征的涎腺癌仅有13%的病例直接死于肿瘤，死亡原因主要为远处转移。
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单细胞动物的特征范文2
[关键词]柿属； 鉴定； 叶表皮； 叶脉； 解剖特征
[Abstract]To establish a method for the identification of five species and one variety of medicinal plants fromDiospyros， their leaf veins， epidermis， anatomic and powder characters were observed and compared with macro-morphological and microscopic methods. The results indicated the differences of secondary and tertiary veins among thoseDiospyros species. The single cell non-glandular hair and glandular hair exist in most species′ epidermis while stone cells were only found in the leaf powders of two species. Through the study， the main differences of leaf macro- and micro-morphology of these species were obtained and practical keys were also established， which can provide scientific base not only for identification of these species during their vegetative stages， but also for accuracy authentication of the source of Kaki Folium.
[Key words]Diospyros； identification； leaf epidermis； leaf vein； anatomic character
doi：10.4268/cjcmm20162110
柿属Diospyros L.植物为落叶或常绿乔木或灌木，全世界约500种，主产于热带地区； 我国有57种，其中江苏省有6种，1变种[1]。柿属植物的经济价值较大，柿D. kaki Thunb.的果实可食用，亦可入药，柿蒂为常用中药材；柿叶被收载于《中国药典》附录[2]，具有清热解毒、润肺等作用；老鸦柿D. rhombifolia Hermsl.的根和枝入药可活血利胆等[3]。目前对柿属植物的研究主要有化学成分、药理作用、食品饮料的开发等[4-6]。
当前全国正在开展中药资源普查试点工作[7]。柿属植物的营养期较长，其叶片大多椭圆状卵形或倒卵形，极易混淆。在野生药用植物外业调查过程中碰到的多是其营养生长时期，这给野外药用植物基原鉴定工作带来了一定困难。
20世纪70年代初期，Hickey等[8-9]阐释了叶片宏观形态系统研究的内容及意义，已广泛应用于现代植物学研究，并提供了重要的分类和鉴定依据[10-12]。植物叶片的微观形态特征是物种本身遗传特征的反应，具有一定的稳定性，在一定程度上可用于探讨属下种间关系[13]。因此，结合以上2种技术手段，可对易混淆植物物种做出比较可信的鉴别。
本文对江苏省6种（5种1变种）柿属植物从传统的叶表皮微形态、叶解剖和叶粉末特征等进行实验观察，同时引进了植物叶片脉序的比较研究，并制定了鉴别检索表，为柿属植物生药基原的准确性鉴定提供了科学依据。
1 材料
1.1 植物
6种柿属药用植物的叶片采集自中国药科大学药用植物园、方山国家地质公园、南京市中山植物园，每种植物均采集不同成熟度的叶片，采集不少于3棵植株，经中国药科大学中药资源学教研室秦民坚教授鉴定为柿D. kaki、老鸦柿D. rhombifolia、美洲柿D. virginiana L.、油柿D. oleifera Cheng、野柿D. kaki var.silvestris Makino、山柿D. japonica Siebold et Zucc.，凭证标本保存于中药药科大学中药资源学教研室（表1）。通过同种叶片叶表观结构特征比较，对比特征出现的几率来选取最有代表性的材料。
1.2 仪器
NIKON ECLIPSE E200显微镜、HISTOSTAT 820石蜡切片机、脱影板、NIKON D7000相机。
2 方法
采集的实验材料经净制后，每种取4～5枚具有代表性的叶片制作腊叶标本作为凭证，其余叶片按如下方法处理。
2.1 透明叶的制作
为了使叶脉清晰可见，一般采取如下操作步骤（根据叶片的质地不同，具体可进行调整）：取代表性的完整新鲜叶片置于合适大小培养皿中，加适量5% NaOH溶液透化至淡茶色或颜色不再变淡。倾去培养皿中的NaOH溶液，并小心冲去叶表面残留的NaOH溶液，然后向培养皿中加入4.5%～5.5%的次氯酸c溶液至浸没叶片，1 min后，倾出次氯酸钠溶液（回收），加入RO（reverses osmosis， 超纯水）水浸没叶片，直至叶片颜色变白。倾去RO水，用0.5%的番红水溶液（或酸性品红溶液）均匀染于叶片上30 min左右，用流动的RO水洗去叶片表面的浮色，继续以25%，50%梯度的乙醇溶液进行脱水、分色，可使用摇床使其分色更加均匀，直至主脉与各级脉清晰可见，最后转移至脱影板上拍摄。
整体叶脉图像在背光微距拍摄后，需要在显微镜下对叶脉细微的结构进行进一步拍摄，以展示一些次级脉结构和脉附属结构。
2.2 叶表皮片的制作
取新鲜叶片，洗净，撕取上下表皮，刮去残留在上面的叶肉，以水装片，置显微镜下观察。对于亲水性差的叶片可采用水合氯醛试液装片；对于表皮难撕取的叶片，若叶片较为革质，可用薄刀片将上表皮削下，装片观察上表皮。再将中间叶肉刮去至下表皮露出，将下表皮分离下来，装片观察；若叶片较为草质，可切取不含主脉的0.5 cm×0.5 cm小块，置于5%的次氯酸钠溶液中浸泡至白色再观察；此外，还可用宽胶带撕取结合次氯酸钠离析的方法[14]。
2.3 叶结构解剖方法
每种取10余枚新鲜叶片，每枚叶片切取含有主脉的1 cm×1 cm小块，装入FAA固定液中（福尔马林-乙酸-70%乙醇 1∶1∶18）固定24 h以上。取固定好的材料，以常规石蜡切片法切片，番红-固绿染色，得到含有主脉的叶横切面切片。
2.4 叶粉末制片的方法
每种取数十枚叶片阴干至水分小于14%，粉碎，过4号筛[2]。取筛后的粉末适量，加水合氯醛加热透化，甘油酒精装片。
2.5 图像处理
使用显微镜系统图像处理软件，Photoshop，LEAFGUI[15]等专业软件对获得的脉序特征、叶表皮特征、叶主脉横切面特征、叶粉末特征等图像进行分析处理，并加以描述。叶脉术语参照B Ellis等编著的《叶结构手册》[16]。
3 结果
3.1 脉序特征
3.1.1 柿 主脉羽状，少见梳状脉。粗二级脉简单弓形，间距不规则。二级脉间三级脉为对生、V形的贯穿脉，其向轴端与中脉夹角近似直角。中脉上三级脉为对生贯穿脉，其基部与中脉夹角为锐角，顶端向基部弯曲（图1A）。四级脉呈不规则网状，五级脉呈自由分支状。游离段小脉多数不分支，少数具一个分支，具有简单的末端。边缘末级脉环状（图2A，3A）。
3.1.2 老鸦柿 主脉羽状，无梳状脉。粗二级脉花环状弓形，间距基部渐减。二级脉间三级脉呈不规则网状。中脉上三级脉网状，边缘三级脉环状（图1B）。四级脉呈不规则网状，五级脉呈自由分支状。游离段小脉多数具有1个分支，少数均等分支，具有简单的末端。边缘末级脉环状（图2B，3B）。
3.1.3 美洲柿 主脉羽状，无梳状脉。粗二级脉简单弓形，间距不规则。二级脉间三级脉呈不规则网状。中脉上三级脉网状，边缘三级脉环状（图1C）。四级脉呈不规则网状，五级脉呈自由分支状。游离段小脉多数不分支并具有简单的末端。边缘末级脉环状（图2C，3C）。
3.1.4 油柿 主脉羽状，具复合梳状脉。粗二级脉简单弓形，细二级脉简单弓形，粗二级脉间距不规则。二级脉间三级脉为对生、外凸形的贯穿脉，其向轴端与中脉夹角约为直角，角度稳定。中脉上三级脉为对生的贯穿脉，其基部与中脉夹角为锐角，顶部平行于二级脉间的三级脉。边缘三级脉环状（图1D）。四级脉呈不规则网状，五级脉呈自由分支状。游离段小脉多数具分支，并具有简单的末端。边缘末级脉环状（图2D，3D）。
3.1.5 野柿 主脉羽状，无梳状脉。粗二级脉简单弓形，间距不规则。二级脉间三级脉为对生、波状的贯穿脉，其向轴端与中脉夹角为钝角，角度不稳定。中脉上三级脉网状。边缘三级脉环状（图1E）。四级脉呈不规则网状，五级脉呈自由分支状。游离段小脉多数具1个分支，并具有简单的末端。边缘末级脉不完整（图2E，3E）。
3.1.6 山柿 主脉羽状，无梳状脉。粗二级脉简单弓形，间距不规则。二级脉间三级脉为对生、外凸的贯穿脉，其向轴端与中脉夹角为钝角，角度不稳定。中脉上三级脉网状，边缘三级脉环状（图1F）。四级脉呈不规则网状，五级脉呈自由分支状。游离段小脉多数具一个分支并具有简单的末端。边缘末级脉不完整（图2F，3F）。
3.1.7 脉序特征差异及检索表 通过观察以上特征，总结了6种植物其脉序特征的主要区别点（表2）， 并结合叶表观性状建立了鉴定检索表（表3）。其中，由于山柿和野柿的叶脉特征极其相似，但是叶形区别较大，因此在甄别两者时，引入了叶形加以辅助鉴别。
3.2 叶表皮特征
3.2.1 柿 上表皮细胞多角形，垂周壁平直，无气孔和毛茸。下表皮细胞多角形，垂周壁微弯曲；腺毛、非腺毛常见，腺毛头部1～2细胞，柄4～5细胞；非腺毛单细胞，长圆锥形，有的曲；气孔不定式，副卫细胞4～5个（图4A，5A）。
3.2.2 老鸦柿 上表皮细胞不规则形，垂周壁浅波状，无气孔与毛茸。下表皮细胞不规则形，垂周壁浅波状；腺毛和非腺毛多见，腺毛头部1～2细胞，柄4～6细胞；非腺毛单细胞，长圆锥形，有的弯曲；气孔不定式，副卫细胞4～6个（图4B，5B）。
3.2.3 美洲柿 上表皮细胞多角形，垂周壁平直，无气孔与毛茸。下表皮细胞形状不规则，垂周壁浅波状；非腺毛少见，单细胞，长圆锥形；气孔不定式，副卫细胞4～6个（图4C，5C）。
3.2.4 油柿 上表皮细胞多角形，垂周壁较平直。下表皮细胞形状不规则，垂周壁浅波状。腺毛和非腺毛常见与上下表皮，腺毛头部1～2细胞，柄3～4细胞；非腺毛单细胞，长圆锥形，有的弯曲。气孔只存在于下表皮，不定式，副卫细胞4～5个（图4D，5D）。
3.2.5 野柿 上表皮细胞多角形，垂周壁较平直，无气孔，但可见长条形非腺毛，单细胞。下表皮细胞类圆形，垂周壁微弯曲；腺毛、非腺毛常见，腺毛头部细胞1个，柄部细胞2～4个；非腺毛单细胞，长圆锥形，有的弯曲；气孔不定式，副卫细胞4～6个（图4E，5E）。
3.2.6 山柿 上表皮细胞多角形，垂周壁平直，无气孔和毛茸。下表皮细胞形状不规则，垂周壁微弯曲；非腺毛多见，单细胞，长圆锥形；气孔不定式，副卫细胞4～6个（图4F，5F）。
3.3 叶主脉横切面特征
3.3.1 柿 上下表皮均由1列细胞组成；下表皮常见腺毛和非腺毛。栅栏组织细胞1列，长约70～80 μm；海绵组织较厚，由6～8列细胞组成，细胞类圆形，有的细胞含草酸钙方晶。主脉维管束外韧型，呈月牙状，纤维多于韧皮部外侧聚集成束，周围薄壁细胞常含草酸钙方晶，主脉上下表皮内侧有2～3列厚角细胞（图6A）。
3.3.2 老鸦柿 叶肉栅栏组织细胞长约60～80 μm；海绵组织由4～5列细胞组成。其余特征同柿（图6B）。
3.3.3 美洲柿 下表皮偶见非腺毛，近无腺毛。叶肉栅栏组织细胞长约40～60 μm；海绵组织由4～5列细胞组成。纤维单个散在或聚集成束。其余特征同柿（图6C）。
3.3.4 油柿 上下表皮均可见腺毛和非腺毛。叶肉栅栏组织细胞长约40～45 μm；海绵组织由4～5列细胞组成。维管束与叶肉之间有石细胞，单个或成群；纤维单个散在或聚集成束。主脉上下表皮内侧有4～5列厚角细胞。其余特征同柿（图6D）。
3.3.5 野柿 上表皮少见非腺毛；下表皮可见腺毛和非腺毛。叶肉栅栏组织细胞长约40～50 μm；海绵组织由4～5列细胞组成。主脉维管束呈“U”字形，纤维单个散在或聚集成束。其余特征同柿（图6E）。
3.3.6 山柿 下表皮非腺毛，腺毛近无。栅栏组织细胞长约75～85 μm；海绵组织由5～7列细胞组成。维管束与叶肉之间有石细胞，单个或成群；纤维单个散在或聚集成束。其余特征同柿（图6F）。
3.4 叶粉末特征
3.4.1 柿 粉末深绿色。纤维常聚集成束，周围薄壁细胞中常含草酸钙方晶，形成晶鞘纤维。草酸钙方晶随处可见。导管多为梯纹。腺毛头部1～2细胞，柄4～5细胞；非腺毛单细胞，长圆锥形，弯曲（图7A）。
3.4.2 老鸦柿 粉末棕绿色。其余特征同柿（图7B）。
3.4.3 美洲柿 粉末棕绿色。纤维单个散在或聚集成束。非腺毛少见，微弯曲，腺毛近无。其余特征同柿（图7C）。
3.4.4 油柿 粉末灰绿色。纤维单个散在或聚集成束。石细胞长圆形，有的呈分枝状，壁厚。腺毛头部1～2细胞，柄3～4细胞。其余特征同柿（图7D）。
3.4.5 野柿 粉末灰绿色。纤维单个散在或聚集成束。腺毛头部细胞1个，柄部细胞2～4个。其余特征同柿（图7E）。
3.4.6 山柿 粉末污绿色。纤维单个散在或聚集成束。非腺毛微弯曲，近无腺毛。石细胞不规则形，多呈分枝状，壁厚。其余特征同柿（图7F）。
3.5 粉末特征差异及检索表
观察以上特征（3.2～3.4）总结了6种柿属植物的叶表皮特征、叶主脉横切面特征和叶粉末特征的主要区别点（表4），并以此依据建立了显微特征鉴定检索表（表5）。
4 讨论
柿叶作为传统的中草药，在民间有着长久的应用历史。柿叶不仅作为茶饮，还作为原料应用于一些常用中成药制剂当中。被2015年版《中国药典》收载的就有心舒宁片、妇炎净胶囊、脑心清片，其中脑心清片用到了柿叶提取物，并制定了相关的标准。
《中国药典》附录收载的柿叶来源为柿树D. kaki的干燥叶，但在实际药材流通过程中同属的其他植物，由于其形态的相似性，存在混同使用的可能性，这会在一定程度上造成用药基原的混乱。柿属植物的分类鉴定，主要是依据其果实的形态。如果能从植物营养器官如叶片形态上加以区分，对药材的实际采收过程，以及柿叶药材真伪鉴别等方面，都具有重要的实际应用价值。
甄汉深等[17]研究并描述了柿叶的药材性状与粉末显微特征；严铸云[18]从生药学的角度比较了川产柿叶与近缘种的特征区别。不同于上述的研究，本文引入了叶脉特征、表皮特征及叶解剖特征进行比较分析，并制定了基于营养器官特征的检索表。这样在药材采集中遇到柿属植物营养器官就可以通过较为简便的撕取表皮片和叶脉特征观察做出判断，对于准确用药起到辅助作用。
柿叶虽然被应用于多个中成药制剂中，但是目前只有提取物的标准。在2015年版《中国药典》中并没有“柿叶”药材的标准，这是亟待去完善的。本研究一方面对常见柿属基原植物进行营养期鉴别的研究，为其准确用药提供支持；同时也完善了柿叶药材的部分标准，为今后药典标准的制定提供了一定的依据。
叶片是植物营养器官中相对特征显著和易于观察的部位，通过研究找到一定的叶表观特征参数可区分不同的物种。由于实用性强，基于植物营养期辅助鉴别的工作近年来越来越受到重视，有学者提出了诸如“比较解剖学”、“植纹”、“脉序图谱”、“叶表皮微形态”等概念[10，19-21]。本研究囊堵龅男翁入手探讨柿属易混淆药用植物的区别，并辅助以其他的营养器官特征进行鉴别，是中药材采集、用药过程中基原快速准确判定的一种有益的尝试。
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单细胞动物的特征范文3
关键词:猪繁殖与呼吸综合征;研究进展
中图分类号:S828.3文献标识码:B文章编号:1007-273X(2010)07-0010-04
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是1987年首先在美国发现的一种引起成年母猪繁殖障碍(如流产、早产、死胎等)和仔猪呼吸道疾病为主要特征的猪传染病。该病由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起,属于接触性传染病。目前该病在世界多数地域均有报道。我国在1996年证实了该病的存在[1]。由于PRRS给全球的养猪业造成了巨大的经济损失,是危害养猪业发展的主要的传染病之一,该病被国际兽疫局(OIE)列为B类传染病。2008年12月11日公布的《中华人民共和国农业部公告第1125号》将高致病性猪蓝耳病列为一类动物疫病,将猪繁殖与呼吸综合征(经典蓝耳病)列为二类动物疫病。
目前世界各国投入大量人力物力致力于该病的研究,并取得了较大进展。笔者现从PRRS的病原学特性、致病机理、动物机体免疫以及该病的检测与防制等几方面对该病的研究进展作一简要综述。
1PRRSV的病原学特征
PRRSV由荷兰学者Wensvoort等首次分离并鉴定[2],国际病毒分类委员会第六分类报告将其列为动脉炎病毒科,动脉炎病毒属,是一种有囊膜的不分节段的单股正链RNA病毒[3]。该病毒基因组RNA的转录机制类似于冠状病毒[4]。
PRRSV在带毒仔猪的脾脏中含量最高,依次是肾脏、肺脏、淋巴结、肝脏、心脏等。PRRSV抗原在死胎体内主要集中于淋巴结和脾脏的巨噬细胞中,在新生仔猪中仅能在肺中检出。对于成年猪该病毒主要位于肺脏等内脏器官以及淋巴结等免疫器官,在生殖道上皮细胞、血管内皮细胞以及、脑等组织的巨噬细胞中也有病毒存在[4]。可以用猪原代肺巨噬细胞、外周血单核细胞、肺血管内巨噬细胞等少数几种来培养PRRSV。不同的病毒株,其最适培养细胞有较大差别且其生长繁殖状况也显著不同。有些病毒株在每代细胞上培养3～4d即可出现细胞病变,有些则需要培养2～3代。其细胞病变的特征是:开始细胞的折光性增强,接着呈灶状变圆、突起,72h后细胞开始皱缩并逐渐脱落,细胞病变发展到80%左右时,大部分细胞会脱落,出现空洞[5]。
PRRSV分为以ATCC VR-2332株为代表的美洲株和以LV株为代表的欧洲株两个基因型[6]。纯化的病毒粒子呈球形,直径45～100nm,平均约62nm。核衣壳的直径25～30nm,核衣壳上有约5nm的突起,有脂质双层膜外绕突起,因此该病毒对氯仿、乙醚等脂溶剂和除垢剂较为敏感。在氯化铯和蔗糖密度梯度中浮密度分别为1.13～1.19g/cm3和1.18～1.23g/cm3。PRRSV对高温比较敏感,在56℃下45min即可完全失活。37℃处理10～24h、20℃放置6d或4℃放置1个月,病毒的滴度将下降90%以上。低温、潮湿的环境有利于PRRSV的存活,-20℃和-70℃可保存病毒,在-70℃下,病毒可以保存4个月以上而不影响其感染性。在绝大多数污染物中PRRSV极不稳定,在井水、自来水、PBS水中的存活期为3～11d。在pH7的环境中,PRRSV的感染力可以下降90%以上。PRRSV无凝血活性,不凝集鸡、鸭、山羊、小白鼠及人的红细胞,但用非离子除垢剂处理后,再用脂溶剂处理,可凝集小鼠红细胞[5]。
PRRSV在感染猪体内能诱发中和抗体(neutralizing antibodies,NAs)的产生,但是较低滴度的中和抗体(亚中和水平抗体)不但不能有效清除血液中的病毒,反而与病毒形成病毒-抗体复合物,病毒借助抗体的Fc片段与Fc受体阳性细胞结合,促进病毒进入细胞而建立感染[7],产生所谓的抗体依赖性增强作用(antibody dependent enhancement,ADE)。该作用是PRRSV的一个重要的生物学特征。PRRSV对肺巨噬细胞(PAM)、单核细胞和小胶质细胞的某些亚群有严格的限制性亲嗜性,PAM是其首选的靶细胞,这些细胞的分化和活化状态会影响其易感性。
2PRRSV的致病机理
PRRSV通过呼吸道或生殖道侵入猪体后,主要侵害肺泡及血液等组织的巨噬细胞。首先通过呼吸道与PAM上的受体结合,再经胞吞作用进入PAM,并在PAM内迅速增殖(特别是尚未成熟的PAM最适合PRRSV繁殖),使PAM受损死亡,导致数量减少,存活的PAM表现功能低下,使肺泡功能发生障碍,进而仔猪表现典型的呼吸道症状[6]。
PRRSV感染宿主细胞以及在宿主细胞内进行复制的过程受到宿主细胞的细胞受体、胞内大分子及细胞因子影响。
在PAM中发现了多个PRRSV受体,这与PRRSV感染受体细胞所具有的严格的细胞噬性有关。段小波等使用单克隆抗体Mb41D3与PAM作用,在PAM中找到了PRRSV的受体Sn(唾液酸黏附素)。Delputte等研究发现,PAM表面的硫酸乙酰肝素(Heparan Sulfate,HS)也是PRRSV的受体,同时还发现PRRSV中以M-GP5复合物形式存在的病毒基质蛋白是HS受体的主要结合位点,并证明肝素和mAb41D3在共同作用下可完全阻断PRRSV感染PAM[8,9]。
Kim等发现波形蛋白是Marc-145细胞受体。Cafruny的研究表明除了受体外,完整的细胞骨架对于PRRSV在Marc-145细胞间的传播也十分重要。
胞内大分子物质可导致PRRSV在宿主细胞内产生增殖性感染,胞内大分子可以协助病毒脱壳和病毒基因组的释放(CD163和CD151)。包括干扰素在内的细胞因子具有抑制PRRSV在宿主细胞内增殖的作用。
有试验表明感染PRRSV后3～14d内血液中的淋巴细胞及单核细胞也显著降低,说明PRRSV有可能转移到局部淋巴组织的巨噬细胞和单核细胞内进行进一步的增殖[10]。由于巨噬细胞的大量破坏,使其对异物的非特异性吞噬清除功能大为降低,机体的非特异性免疫功能下降。又因PRRSV的增殖可导致PAM减少,使机体的杀菌作用的功能降低,易继发其他细菌或病毒感染,而使疾病的症状加重,这有可能是PRRS常和其他疾病同时存在的根本原因。由于PAM的大量崩解使PRRSV释放进入血液或淋巴,在血液巨噬细胞和单核细胞内增殖,并分布到全身各组织器官的巨噬细胞内,引起病毒血症及全身淋巴结的肿大等病理变化。猪在接种病毒后24h可出现病毒血症,平均持续约28d,最长可达56d。随着病毒的增殖,机体会出现肺、淋巴结的损伤和以及微循环障碍等,主要表现为特征性间质性肺炎和淋巴结的肿大,支气管坏死和肺的广泛性出血,下领淋巴结、肠淋巴结及扁桃体弥散出血及水肿等。
PRRSV也可感染公猪生殖系统,导致数量减少,使公猪繁殖性能降低,并可通过将PRRSV传染给母猪,引起母猪的繁殖障碍。感染PRRSV的孕猪可引起子宫内胎儿感染,但机制不明。Lager等对繁殖母猪进行攻毒试验,发现怀孕母猪感染PRRSV后可导致胎儿脐带扩张、出血,呈现坏死性脐动脉炎的变化,使得脐血管的正常血液循环受损,造成胎儿缺氧死亡。病理组织学检查发现在流产胎儿的血管周围出现以巨噬细胞和淋巴细胞浸润为特征的动脉炎、心肌炎和脑炎。
3动物免疫机制对PRRSV的反应
PRRSV感染细胞后可引起机体产生体液免疫和细胞免疫。
PRRSV感染后约1～2周内,猪体免疫系统被激活,产生一系列免疫应答,并可通过几种不同血清学方法检测[11]。感染PRRSV后5～7d,就可在一些猪体内检测到PRRSV抗体(机体首先产生IgG抗体,但亦有报道称是IgM)[12],感染14d后所有猪都会产生抗体。感染14d后IgM达到最高值,在感染42d后迅速下降,直至检测不出。感染后21～49d机体的IgG达到最大值。但IgM和IgG的迅速响应与中和抗体(NAs)的反应并不对应。
Nelson等研究了猪对北美型PRRSV毒株产生体液免疫的过程。最早产生的抗体是针对15kU的核衣壳蛋白(N),随后产生的抗体主要针对19kU的膜蛋白(M),然后产生的是26kU糖蛋白GP5的抗体。另有研究表明非结构蛋白Nsp2中包含一群非中和性抗原决定簇并且有可能是PRRSV的免疫蛋白。很多诊断性检验表明主要免疫原是核衣壳蛋白(N)。这些抗体在感染后一周左右出现并持续存在数月。
在病毒最初感染的4周内,无法用常规的病毒中和试验(virus neutralization tests,VNTs)检测中和抗体[11]。体外试验表明,中和抗体可抑制PRRSV对巨噬细胞的感染性。研究表明中和抗体效价可以作为评价PRRSV疫苗效力的一个重要参数。
猪感染PRRSV后产生体液免疫的同时,也会产生细胞免疫。单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞是主要的免疫反应。利用北美型PRRSV毒株所制的灭活疫苗接种后,PRRSV特异性的IFN-γ分泌细胞最早在接种3周后出现,以后10周在50万～100万U/百万外周血单核细胞(PBMCs)范围内波动,随后在接种后48周增长到400万～500万U/百万外周血单核细胞。在机体的免疫过程中,干扰素和细胞因子的作用也相当明显。早期研究显示,PRRSV非常容易受I型IFN的影响,并且可以抑制IFN-α的响应,因为在PRRSV复制活跃的猪肺中IFN-α的水平较感染猪圆环病毒等的要低。不同的PRRSV分离株诱导或抑制IFN-α的能力是不同的。感染美洲株或欧洲株的PRRSV后,PBMCs中的IL-10的mRNA水平均有所上升,并且支气管肺泡洗液中白细胞介素10浓度会升高,表明IL-10可能在PRRSV的免疫应答调节机制中起重要作用。
PRRSV可能会阻碍T淋巴细胞的正确抗原递呈和活化作用。尽管PRRSV并不削弱混杂在白细胞反应中的增殖反应,但它抑制主要组织相容性复合体-I(main histocompatibility complex,MHC-I)在树突细胞(dendritic cells,DCs)中的表达。与CD14相同,MHC-I和MHC-II在源于单核细胞的DCs中的表达也被抑制,它们可被感染反应激活但不能被PRRSV激活。当被感染的DCs被用作同源或非同源的淋巴细胞时,增生反应明显下降,表明被感染的DCs表现出较低的抗原活性。PRRSV可通过改变巨噬细胞和树突细胞的细胞形态来减轻先天免疫反应,并通过修改(MHC)-I分子的表达来参与抗原递呈。
4PRRSV的检测技术
目前运用于PRRSV检测的方法可分为免疫学检测法以及核酸检测法。免疫学检测包括免疫荧光染色法、免疫过氧化物酶染色法以及免疫胶体金法等。核酸检测法主要是指反转录-聚合酶链式反应检测法(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)。通过检测抗体或抗原水平可以评价猪个体或群体的病毒感染情况以及疫苗免疫效果,目前用于PRRSV抗体或抗原检测的方法主要有免疫荧光抗体(IFA)试验、免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA)、血清中和(SVN)试验及酶联免疫吸附试验(ELISA)等。
这些方法中ELISA(包括间接ELISA和阻断ELISA)较适于大规模检测,该法方便、易行、操作过程及结果判定能够标准化且具有高度特异性和敏感性。ELISA诊断抗原有2种:从细胞培养物中纯化的全病毒抗原和重组PRRSV核衣壳蛋白。这两种诊断抗原都有较强的背景反应。目前市面上已有PRRSV抗体ELISA检测试剂盒出现,但尚存在假阳性结果。
由Wensvoort等建立的IPMA是目前欧洲和美洲国家广泛使用的血清学诊断方法[2]。该法敏感性和特异性也都很好。有研究表明IPMA可比ELISA试剂盒提前2～3d检测出抗体,尤其是对母源抗体。IPMA的不足主要在于其结果判定不能自动显示、有一定的主观性,检测时间长,花费大,不适合大规模检测。而ELISA方法可以在不损失特异性的基础上提高敏感性,相比而言,ELISA方法更适合诊断PRRSV。
IFA同IPMA一样,结果判定也有较大的主观性,用IFA法检测抗体滴度较低的血清可能会出现假阴性结果。血清中和试验同其他几种方法相比敏感性较低,可能是由于PRRSV特异性中和抗体出现较晚。
RT-PCR方法扩增的目的片段主要针对PRRSV的核衣壳蛋白的编码基因。该方法省时、省力且敏感性、特异性等明显高于病毒分离和ELISA。目前该方法广泛应用于PRRSV的鉴定和临床诊断。血清、、肺脏等都可以作为该法的检验样品。近年来荧光定量RT-PCR[13]、逆转录恒温扩增技术(RT-LAMP)[14]的发展,为PRRSV的早期快速诊断提供了有力工具。
5PRRS的控制方法及疫苗研究进展
对于控制PRRS来说,保证饲料原料的质量、加强通风、保证饮水、减少应激以及做好隔离淘汰等工作是整个控制工作中最重要的一步。
及时接种疫苗也是预防PRRS的重要方法。目前PRRS的疫苗主要有灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗等。灭活疫苗具有安全、不存在散布病毒和造成PRRS新疫源的危险、便于贮存和运输、对母源抗体的干扰作用不敏感等优点,因此人们首选灭活疫苗来预防和控制PRRS。有报道称PRRS的某些灭活疫苗接种猪后可以减少病毒血症的发生、有效阻止肺部病变,可提高母猪的繁殖力、改善死胎状况。接种灭活疫苗20d左右,体内抗体可达到高峰,并可持续6个月左右。弱毒疫苗有免疫力强、免疫期长等优点,适用于3～18周龄的猪。Mengeling等发现母猪怀孕后期接种某种弱毒疫苗后可产生病毒血症。弱毒疫苗在接种后,可能会持续散播疫苗病毒,使得病毒在猪场中传播,甚至可能引发PRRS的暴发。因此,目前世界上并不提倡使用弱毒疫苗,例如在欧洲(如德国等)禁止用活疫苗来预防PRRS,美洲和亚洲的某些国家提倡在未发生PRRS的猪场中避免使用弱毒疫苗。基因工程疫苗主要包括核酸疫苗、重组疫苗和活载体疫苗等。核酸疫苗可同时诱导细胞免疫和体液免疫,且对不同血清型的毒株具有交叉保护性,另两种基因工程疫苗尚还处于研究探索阶段[15,16]。
6展望
目前,国内外学者对PRRS的研究虽然已取得重要进展,但在某些方面仍有待深入研究,包括PRRS的发病的详细机制,PRRSV的免疫学机理,PRRSV的快速、特异、敏感性更好的检测方法以及接种效果更好的疫苗等。近年来,PRRS的频繁暴发,给世界养猪业以及人类的经济发展都带来重大损失,该病的研究还需广大科研工作者付出更大的努力。相信在国内外学者的关注下,这些问题终将被一一解答。
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单细胞动物的特征范文4
【摘要】 目的：探讨成人外周血来源的内皮祖细胞（epc）与成熟血管内皮细胞在抗原表达、细胞形态、增殖潜能和体内外血管生成方面的异同点. 方法 ：密度梯度离心法获得单个核细胞，用含生长因子的内皮培养基接种于纤连蛋白包被的培养板中. 细胞在接种后每2 h去除1次未黏附细胞共2次，然后隔日换液1次，直到晚期克隆出现. 同期培养人脐静脉内皮细胞（huvec）进行比较. 流式细胞技术检测细胞表面抗原表达，直接荧光染色法测定细胞结合荆豆凝集素及摄取乙酰化低密度脂蛋白. 体外培养细胞的群体倍增次数确定细胞增殖潜能，胶原凝胶细胞体外种植及裸鼠体内移植实验分别测定体外及体内血管生成功能. 结果： epc在培养21~28 d出现，表现出典型的内皮细胞“铺路石”外貌. 与huvec相比，epc表达高水平的cd36和kdr（epc vs huvec, p<0.01），但表达cd146，结合植物凝集素和摄取乙酰化低密度脂蛋白在两种细胞间未存在统计学差异. 体外培养100 d，epc和huvec分别传代46次和25次，只有epc能在体外和裸鼠体内胶原凝胶中形成管腔样结构. 结论：人外周血来源的epc虽然具备成熟内皮细胞的表型和形态特点，但仍保留干/祖细胞的完整生物学特征.
【关键词】 血管生成；内皮细胞；祖细胞；生物学性状
0引言
内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, epcs）原始储存部位在骨髓，受缺血信号刺激后向外周血释放，募集到缺血部位参与血管新生. 但另有 研究 却发现， epcs在肿瘤血管新生、受损血管内皮修复、或成年动物体内血管再生方面，所起作用很小或几乎不起作用［1-3］. 我们研究首先确认外周血循环中是否存在有真正的epcs，然后将其与成熟内皮细胞进行完整生物学性状对比 分析 .
1材料和方法
1.1材料histopaque，1.077,fitc标记的植物凝集素（ulex europaeus agglutinin?1, uea?1）、纤连蛋白（fibronectin）、fitc标记的抗?vegf?2受体（kdr）、i型胶原均为sigma公司产品；添加各种生长因子和胎牛血清的内皮细胞完全培养基（egm?2 mv single quots）和i型胶原酶为becton dickinson公司产品；dii标记的乙酰化低密度脂蛋白（dii?ac?ldl）购自abd serotec公司；vwf一抗和fitc标记二抗均购自dako公司；pe?cd34， fitc?cd14，fitc?cd146，均为bd公司产品. 健康志愿者11（男9，女2）例，年龄46.5±13.1岁，肘静脉取血每例50 ml，肝素（20 ku/l）抗凝. hanks 1∶1稀释血液，加入histo?paque经密度梯度离心法获得单个核细胞（mononuclear cells, mnc）. 用hanks洗涤mncs 3次，重悬于egm?2，调整细胞计数2×109/l，接种于100 mg/l纤连蛋白包被的24孔培养板中. 另在无菌条件下取正常剖腹产健康新生儿脐带20~30 cm，pbs冲洗脐静脉腔， i型胶原酶灌注，37℃水浴消化15min. 收集消化液、离心、洗涤，egm?2调整细胞计数2×109/l，接种于纤连蛋白包被的培养瓶中，取2~3代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, huvec）用于实验.
1.2方法根据单核细胞在体外培养时具有短期松散附壁的特点， 应用 序列黏附法去除淋巴细胞的混杂. 每例血样在分离出mnc并接种后每隔2 h去除1次未黏附细胞，共2次，然后加入egm?2静止培养，4 d后换液. 此后隔天换液1次，直至典型的内皮细胞克隆出现，然后消化传代，取2~3代细胞进行实验.
1.2.1表面抗原表达的测定贴壁细胞用pbs洗涤2次，2.5 g/l胰酶/edta消化后制成细胞悬液，密度为1×109/l. 每份细胞悬液取150 μl×2分装2个试管，分别加入fiti?cd14，fitc?cd146，fitc?kdr，pe?cd34及同型对照mab各20 μl，避光反应30 min，pbs洗涤2次测定，每例均以流式细胞术复测3次. 上机后收集20 000个细胞，荧光强度以对数放大，结果以各种抗原表达阳性百分率表示.
1.2.2内皮细胞vwf的表达贴壁细胞生长至80%汇合时用1∶1甲醇/丙酮固定，vwf一抗及fitc标记的二抗均作1∶50稀释，严格按说明步骤进行.
1.2.3细胞增殖潜能的测定epc及原代huvec生长至亚汇合状态时分别消化，制成稀释的细胞悬液，密度均为2×107/l，传代接种于25 ml培养瓶中. 然后按此方法对这两种细胞分别持续传代，直至细胞衰老. 每传代细胞1次，记数为1次群体倍增. 以培养时间为横坐标，群体倍增次数为纵坐标，绘制细胞群体倍增曲线图.
1.2.4体外血管形成实验用冷藏的egm?2配置浓度为2 g/l的i型胶原溶液，100 g/l碳酸氢钠滴定溶液ph值7.4~7.6，加入96孔板中每孔100 μl，37℃放置30 min使其成胶. 分别将2~3代贴壁的epc和huvec制成细胞悬液，加入凝胶之上每孔5×104个细胞，置培养箱内孵育，不同时间点倒置显微镜下观察血管生成情况.
1.2.5体内血管生成实验无胸腺裸鼠22只，7~11 wk，购自郑州大学实验动物中心. 收集epcs和huvecs，制成浓度为2×109/l的细胞悬液. 用1.5 g/l的碳酸氢钠、25 mol/l hepes, 100 ml/l胎牛血清、300 ml/l egm?2制备浓度为3 g/l的胶原溶液. 将等量的细胞悬液与胶原溶液混合，每只裸鼠后肢sc细胞?胶原溶液1 ml. 将裸鼠置于饲养笼28℃条件下30~60 min，触摸裸鼠移植部位皮丘呈胶冻感为移植成功，然后常规条件饲养. 21~30 d处死裸鼠，取出移植体行病理切片分析.
统计学处理：采用spss 11.0统计软件进行分析. 计量数据以x±s表示，两组均数间的比较采用t检验，以p<0.05为有统计学差异.
2结果
mnc接种后7~11 d可见有簇状聚集的早期克隆出现，中间是圆形细胞，周边有向外爬行生长的梭状或多角形细胞（图1a）. 持续培养至21~28 d可观察到晚期克隆的出现，细胞均呈多角形或纺锤形，紧密贴壁，聚集向外生长（图1b）. 至35~42 d，可见细胞增殖、逐渐汇合成片，呈现内皮细胞典型的“铺路石”外貌（图1c,d）. huvec接种当时为圆形、悬浮，24 h后细胞即伸展、贴壁，呈梭形或多角形（图2a），5~7 d后贴壁细胞基本汇合成单层，外观与epc来源细胞相同（图2b,c）.
2.1epcs与huvecs表型特征对比huvec相比，epc表达高水平的干/祖细胞标记cd34和kdr（p<0.01，图3）. 单核细胞特异抗原cd14在两组细胞表面仅有微量表达，而泛内皮细胞标记cd146在两组细胞均为高表达但无统计学差异. vwf鉴定两组细胞均阳性证实为内皮细胞起源.a：第7日形成早期克隆 ×40；b：第22日形成晚期克隆 ×40；c：第37日晚期克隆增殖汇合；d：晚期克隆再种植形成单层内皮细胞，呈典型铺路石样外观 ×100.
图1epc体外培养细胞形态
a：种植后24 h伸展贴壁 ×40；b：6 d后增殖汇合 ×40；c：第二代huvecs呈铺路石外观 ×100.
图2huvecs体外培养形态特点
2.2epcs及huvecs体外增殖潜能对比epc传代接种后经历1~2 d潜伏适应期，然后增殖旺盛，每3~4 d传代1次. 在100 d时间内，epc传代46次，曲线陡直上升（图4）. 此后传代时间渐延长，曲线由水平转为下降趋势. huvec传代周期为5~7 d，曲线缓慢平坦上升，表明细胞增殖潜能低于epc. 在68 d时间内、同等培养条件下huvec共传代21次，然后曲线迅速下降，提示细胞开始衰老. 在相同的100 d时间内，huvec总计传代25次.
图3epc与huvec表达抗原阳性百分率比较（x±s, n=33, bp<0.01 vs huvec）
图4epc huvecs体外培养群体倍增曲线
2.3胶原凝胶体外血管生成贴壁的epc和huvec分别消化再种植于i型胶原凝胶上，36 h后可见epc伸展呈纺锤状，并相互连接形成管腔样结构（图5a），72 h后可见原管腔增大，管壁可见有细胞向管腔中央呈发芽状生长（图5b）. 持续观察huvec未见形成管腔样结构，至1 wk后仅见细胞呈圆形或多角形融合成片（图5c）.
a：epcs种植36 h形成管腔结构；b：72 h后管腔扩大，并见管壁细胞向腔内呈发芽状生长；c：huvecs种植不能形成管腔结构.
图5胶原凝胶体外血管生成×100
2.4裸鼠体内血管生成裸鼠22只细胞移植均获成功（epc和huvec组各11只），饲养期间未发现裸鼠有异常反应. 移植体病理切片he染色显示，epc组11只裸鼠中有8只在胶原凝胶移植体中观察到了典型的微血管结构，并与小鼠组织构成了人?鼠嵌合血管，其间可见小鼠的血细胞流动（图6a）. 而huvec组仅在1只裸鼠的移植体中观察到了类似微血管样结构（图6b），其余10只裸鼠移植体中均显示出不规则的细胞聚集现象，未观察到血管结构（图6c）.
a：epc组细胞移植形成典型血管结构，管腔中可见小鼠血细胞；b：huvec组细胞移植仅1例形成不典型管腔；c：其余huvec组细胞移植均不能形成管腔结构，仅有不规则细胞聚集）.
图6细胞移植裸鼠体内血管生成he ×200
3讨论
本 研究 结果显示，成人外周血循环中的单个核细胞在体外内皮培养条件下，于不同时间段内可形成早期和晚期克隆. yoder等［4］研究表明，这种早期克隆属于单核?巨噬细胞系列，再种植不能分化成内皮细胞，因而还不属于真正的epc. 在早期克隆出现后持续培养，直至获得具有内皮细胞形态特征的晚期克隆后，才显现出干/祖细胞和内皮细胞双重生物学特征. 因此，这种晚期克隆及其分化产生的近代细胞，应属于真正的epc. 本研究显示，epc体外再种植培养可呈现典型“铺路石”外观，与huvec形态相同. 两种细胞表达vwf，结合植物凝集素及吞噬乙酰化低密度脂蛋白均为阳性，不表达单核细胞标记cd14而高表达泛内皮细胞标志cd146，提示二者均为内皮细胞来源.与huvec相比，epc表达更高水平的cd34和kdr. 由于cd34是多数干/祖细胞的共有标志，而kdr的高表达预示着细胞对血管内皮生长因子更敏感，增殖力和血管生成能力更强［5］. 由此可见，我们所获得的晚期克隆来源细胞除了具备成熟内皮细胞的全部表型外，还显现出非成熟细胞（即干/祖细胞）的特征.
本研究显示，在同等培养条件下，晚期克隆来源的epc增殖速度快、传代周期短，在100 d时间内传代近50次而无明显衰老征象. 相反，huvec虽然在6代以内的生长方式和细胞形态接近epc，但传代周期进行性延长，在2 mo的时间内只能传代21次即迅速衰老，说明自我复制能力低下，也符合一般成熟细胞的特点. 本研究显示，将晚期克隆来源细胞种植于胶原凝胶中，可生成典型的管腔样结构，而huvec种植后只出现细胞聚集，无典型管腔形成，说明前者具备干/祖细胞和内皮细胞的双重特征. 晚期克隆细胞能够在动物体内增殖并形成血管，因而具有epc完整的生物学特征. 鉴于冠心病患者外周血循环中出现的内皮细胞是自血管壁脱落的衰老细胞，与huvecs相比在体外更不易存活和增殖［6］. 因此有理由相信，我们所获得的晚期克隆细胞属于纯化的epcs，未被成熟血管内皮细胞混杂.
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单细胞动物的特征范文5
【关键词】 永生化；肝细胞；细胞系；生物学特性；SV40；脂质体
Establishment and biological characterization of an immortalized human fetal hepatocyte line
【Abstract】 AIM: To establish an immortalized human fetal hepatocyte line and to study its biological characteristics and functions. METHODS: Human fetal hepatocytes were transfected with pcDNA3.1 recombined vector containing the Simian Virus 40 large T antigen. Characteristics of the immortalized fetal hepatocyte line were evaluated by morphologic and functional detection. RESULTS: One of the hepatocyte clones displaying highly differentiated in liver function and immortalized characteristics had been screened after 40 day selection of 700-300 mg/L G418. The immortalized hepatocyte line maintained the most morphologic characteristics of primary hepatocyte. The cell cloneforming rat was 31.2%. The immortalized human fetal hepatocytes had a normal karyotype and were not able to grow in soft agar culture. It had the ability of composing albumin and the immunohistochemical test showed that the SV40T gene had been integrated into the transformed cell genome. CONCLUSION: The immortalized human fetal hepatocyte line has the similar most morphologic characteristics and biological function to primary hepatocytes, and it would become ideal cell material on the study of bioartificial liver and hepatocyte transplantation.
【Keywords】 immortalized; hepatocytes; cell line; characterization; SV40; liposomes
【摘要】 目的: 构建永生化肝细胞系并对其生物学特性及某些功能进行研究. 方法： 利用SV40T基因和真核表达载体pcDNA3.1经脂质体转染至体外分离培养的人胚胎肝细胞，使其永生化，进一步鉴定其形态学特征和生物学功能. 结果： 经G418 700～300 mg/L筛选，40 d后获得一株阳性克隆. 形态学观察发现，该细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征. 永生化胚胎肝细胞克隆形成率为31.2%，染色体核型分析表明细胞核型无明显异常，软琼脂集落形成试验表明细胞在软琼脂中不能生长，免疫组化证明SV40T基因已整合入细胞，而且该细胞具有合成白蛋白的功能. 结论： 新建胚胎肝细胞系具有与原代肝细胞类似的形态特征及生物学功能，可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中的理想细胞材料.
【关键词】 永生化；肝细胞；细胞系；生物学特性；SV40；脂质体
【中图号】 R512.6
0引言
原位肝移植可以有效治疗各种原因引起的肝功能衰竭，因而成为治疗肝功能衰竭的唯一有效手段. 但由于受到技术复杂、价格昂贵尤其是供肝短缺的困扰，使它的临床应用受到很大限制，难以及时有效地挽救患者的生命. 研究显示生物人工肝及肝细胞移植可以作为一种有效的替代治疗手段，帮助患者渡过危险期等待肝移植甚至直接取得令人满意的疗效，因而为肝衰竭的治疗提供了一种新的选择［1-5］. 而该项技术的应用需要足够数量肝细胞材料，动物肝细胞或者各种肝细胞系由于存在病毒感染及潜在的致瘤危险，无法成为理想的选择. 从理论上讲人源性肝细胞应该是最佳材料，但原代细胞体外培养增殖及传代困难，而且来源同样受到很大限制，为此我们采用脂质体转染的方法，构建了一株永生化胚胎肝细胞系，并对其生物学特性进行研究，希望可以为生物人工肝及肝细胞移植的临床开展提供理想而充足的细胞材料.
1材料和方法
1.1材料含有SV40 Large T抗原片段的质粒pcD2由北京大学人民医院妇科肿瘤中心刘广芝教授惠赠，真核表达质粒pcDNA3.1由本校微生物教研室保存. 14～28 wk水囊引产死胎由本院妇产科提供，DMEM培养基及胎牛血清购自Gibco公司；DMSO及秋水仙素为Sigma公司产品；抗SV40T单克隆抗体购自USBio公司；人血白蛋白单克隆抗体购自DAKO公司，质粒提取试剂盒为Promega产品.
1.2方法
1.2.1重组质粒的构建及鉴定提取含SV40LargeT的pcD2质粒，限制性内切酶BamHⅠ单酶切，10 g/L琼脂糖电泳. 回收含目的DN段的凝胶，纯化后用T4 DNA连接酶与pcDNA3.1空载体进行连接. 制备感受态细胞并提取重组质粒. 用限制性内切酶BamHⅠ进行酶切，10 g/L琼脂糖电泳鉴定.
1.2.2胚胎肝细胞的分离培养及转染取引产死胎儿置无菌托盘中，常规消毒铺单后打开腹腔，显露游离门静脉后插管，用DHanks液（含0.01 g/L EDTA，37℃，pH 7.4，通以含950 mL/L O2及50 mL/L CO2的混和气体）以20 mL/min的速度灌入，随后于下腔静脉插管放出积血积液，并剪开胸腔，夹闭上腔静脉. 灌注5 min至肝脏变色后改为含0.05 g/L胶原酶的Hanks液（37℃，pH 7.4，通以含950 mL/L O2，50 mL/L CO2的混合气体）持续灌注5 min. 取下肝脏，置于含4℃ Hanks液的平皿中，剪开肝被膜，疏下肝细胞，以单层无菌纱布过滤，制成混合细胞悬液，以100目及200目筛网过滤，500 r/min清洗离心3次，每次2 min，弃上清，以4℃ Hanks液重悬，台盼蓝（Trypan Blue）染色判断细胞活率，肝细胞活率>90％时，计数制成肝细胞悬液，以终浓度1×105/mL接种于培养瓶内，选择低糖DMEM培养基，其中含15 mL/L胎牛血清、10 nmol/L胰岛素，培养48 h后采用脂质体转染法将重组质粒SV40T/pcDNA3.1转染至胎肝细胞. 用含700 mg/L G418的培养液筛选1 wk，将G418浓度改为300 mg/L，至出现阳性克隆，将其转移至新培养瓶进行扩大、传代培养.
1.2.3细胞形态的观察在倒置显微镜下观察新建肝细胞系的形态，并在电子显微镜下观察细胞的超微结构.
1.2.4细胞生长曲线的测定细胞消化后制成悬液，以103浓度接种于96孔板内，37℃，50 mL/L CO2孵箱内培养，每天取8孔加入MTT溶液20 μL/孔, 37℃继续孵育4 h，终止培养吸去上清，加入150 μL DMSO，振荡10 min，在酶联免疫检测仪上选择490 nm波长，测定光吸收值取平均值，连续测定12 d. 以时间为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制细胞生长曲线.
1.2.5细胞克隆形成率肝细胞以1个细胞/孔的密度接种于96孔板，连续培养15 d，在倒置显微镜下观察含有50个以上细胞的细胞克隆数，按下列公式计算细胞克隆形成率：克隆形成率（%）＝（克隆数/接种细胞数）×100%.
1.2.6软琼脂试验肝细胞预先制成细胞悬液，在60 mm培养皿中预先铺上含12 g/L琼脂的培养基，将细胞以1×105/皿浓度与37℃预温的含6 g/L琼脂的培养基混匀后，接种于平皿内底层琼脂培养基上，连续培养20 d后观察克隆形成数.
1.2.7染色体检查取对数生长期的肝细胞加入终浓度为0.5 mg/L的秋水仙碱，继续作用4 h，收集分裂中期细胞，离心去上清，加入0.075 mol KCl低渗处理20 min，最后经甲醇冰乙酸固定，制片，Giemsa染色后，在油镜下观察染色体形态.
1.2.8免疫组织化学方法检测整合的SV40T基因及ALB在细胞中的表达新建胎肝细胞系常规爬片，PBS清洗，4℃丙酮固定，30 mL/L H2O2处理，血清封闭，分别滴加人血清白蛋白单克隆抗体及SV40T单克隆抗体，孵育60 min，然后滴加HRP标记的二抗，孵育60 min，苏木精复染. 脱水、透明、封片、镜检.
2结果
2.1重组质粒的鉴定重新构建的质粒SV40T/pcDNA3.1经BamHⅠ单酶切，酶切产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳，获得大小约2600 bp及5600 bp的2条带，前者符合GenBank中SV40T片段大小（图1）.
图1重组质粒酶切鉴定（略）
2.2胚胎肝细胞的培养及转染原代胚胎肝细胞经分离纯化，细胞存活率达91%. 体外培养48 h后，可见80%贴壁，经脂质体转染SV40T/pcDNA3.1重组质粒，G418筛选40 d后出现一簇抗G418的阳性克隆. 将其转移至新培养瓶内继续培养.
2.3细胞形态观察胚胎肝细胞在培养瓶中呈单层贴壁生长，细胞呈椭圆形、典型的上皮细胞样特征，传代一次约需5 d时间（图2A）. 透射电镜观察，细胞呈典型的肝细胞形态与结构，细胞核仁增大，胞内含丰富的糖原颗粒，细胞极性恢复可见紧密连接和毛细胆管重建（图2B）.
图2胚胎肝细胞形态结构（略）
2.4细胞生长曲线根据MTT数据绘制的生长曲线显示，细胞在培养第4日进入对数生长期，第7日进入平台期，第12日后开始出现凋亡（图3）.
图3胚胎肝细胞生长曲线（略）
2.5细胞克隆形成率及软琼脂集落形成试验细胞连续培养15 d，形成非常明显的克隆，克隆形成率为31.2%. 而在软琼脂培养基内，细胞连续生长20 d，未见有细胞克隆形成，说明该永生化肝细胞不能在软琼脂培养基内生长.
2.6染色体核型分析第16，28，45代肝细胞各计数30个分裂相，均为正常二倍体细胞，染色体为23对，核型结构与正常人肝细胞相同（图4）.
图4染色体核型分析（略）
2.7免疫组织化学检测结果以抗SV40T单克隆抗体作一抗，免疫组化检测可见肝细胞核内的棕色颗粒，证实SV40T基因已整合入胚胎肝细胞（图5A）. 另外该永生化胚胎肝细胞具备合成白蛋白的能力，免疫组化检测可见胞浆内有棕色颗粒着色（图5B）.
图5免疫组织化学染色（略）
3讨论
近年来在重型肝炎的治疗方面已得到共识，即生物人工肝及肝细胞移植可以作为原位肝移植的有效替代治疗手段治疗肝功能衰竭，而且取得了一定的临床治疗效果. 然而由于供肝短缺和原代肝细胞体外培养增殖困难，使得肝细胞材料的相关研究成为关注的热点. 人们曾尝试采用异种肝细胞或各种肝细胞系如C3A，HepG2来解决这一问题［6-9］，常用的猪肝细胞应用最为广泛，效果也可靠，但异种肝细胞可引起强烈的免疫排斥反应，而且由此带来的人畜共患疾病的感染无法避免［10］. 采用C3A, HepG2的生物人工肝在动物实验及部分临床试验中已取得肯定的结果，可是细胞系的来源为肿瘤细胞，研究显示它的细胞色素P450酶活性、氨清除和尿素合成功能均较差，加之用于处于免疫抑制状态的重型肝炎患者，潜在致瘤的风险始终令人担忧［11-12］.
我们利用真核表达载体pcDNA3.1，将猿猴病毒40大T抗原基因通过脂质体转染至体外培养的原代胚胎肝细胞，经G418筛选40 d后获得一阳性细胞克隆. 生长曲线观察结果表明，该细胞具有永生化细胞系典型的“S”特征，细胞生长的每一阶段特征明显. 光学显微镜下观察，细胞呈典型的上皮细胞样贴壁生长，细胞增殖较快；透射电镜观察发现，细胞呈典型的肝细胞形态与结构，细胞核仁增大，胞内含丰富的糖原颗粒，细胞极性恢复可见紧密连接和毛细胆管形成. 表明转染肝细胞在形态结构上与原代细胞无明显差异. 此外，我们构建的永生化胚胎肝细胞系的克隆形成能力较强，在软琼脂培养基中不能生长，而且核型组成与正常肝细胞相同，说明该细胞没有发生恶性转化. 经免疫组织化学检测，转染肝细胞核内染色可见大量棕色颗粒，表明SV40T抗原已整合入胚胎肝细胞内，另外人血白蛋白在细胞胞浆中有明确表达，说明该细胞系具备分泌蛋白的能力，具有正常肝细胞的某些功能.
本研究结果表明，利用SV40T抗原，采用脂质体转染方法建立的这株永生化胚胎肝细胞系，具备了原代肝细胞的典型形态特征以及某些生物学功能，为肝细胞体外长期培养以及功能维持提供了可能，应该可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中的理想细胞材料，从而为生物人工肝及肝细胞移植临床的广泛应用奠定更加坚实的基础.
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单细胞动物的特征范文6
在有些松柏类植物叶片的下表面，肉眼可见到白色的条带，这就是很多气孔聚集形成的气孔带(图1.日本冷杉叶背面的气孔带)。人们仅凭肉眼是不能分辨出单个气孔的，要想看清楚单个气孔的形态和结构需要借助显微镜。将洗干净的叶片放在扫描电子显微镜下，在气孔分布集中的区域，可以看到密密麻麻的小孔，这些小孔就是气孔(图2.扫描电镜下的柳杉叶片表面)。对叶片进行一些化学处理，用解剖针分开叶片的上下表面，在光学显微镜或电子显微镜下，可以看清气孔的结构(图3，经过化学处理后的柳杉叶片表面扫描电镜照片)。
植物学上，气孔是两个保卫细胞以及由其围绕形成的开口的总称，围绕保卫细胞周围的是副卫细胞。保卫细胞和副卫细胞都是特化的表皮细胞，外形上与表皮细胞不同。两个保卫细胞围成的开口，也就是我们在显微镜下观察到的小孔，是植物与外界交换气体的主要通道。
气孔特征，植物分类的辅助标准
植物学研究中，植物生殖器官的形态结构特征是对植物进行分类的主要依据，枝叶等营养器官的特征是对植物进行分类的辅助依据。不同植物的气孔形态和结构千差万别，并且这些特征相对固定，因而气孔的分布、排列方向、副卫细胞的数目等特征也可以作为植物分类的参考特征。
对于植物化石来说，很多情况下仅有枝叶保留了下来，生殖器官并没有保存下来，因而人们也就无法获得生殖器官的特征等参数指征。在这种情况下，只有研究植物的枝叶，并从这些枝叶里尽可能多的获取其生物学特征，才能对古植物进行分类和鉴别。化石植物叶表皮特征是获取细胞信息的重要来源，有时甚至是唯一的来源。因而植物表皮的特征，气孔的形态等成了人们对化石植物进行分类鉴定的重要依据。比如水松和落羽杉这两种植物的条形叶外形极为近似，有些植物学家认为二者难以区分。后来，人们研究发现，水松的气孔长轴与叶片长轴平行，也就是气孔平行排列(图4.水松的气孔)，而落羽杉的气孔长轴与叶片长轴垂直(图5.落羽杉的气孔)。因此只要知道植物的气孔特征，二者就比较容易区分了。
气孔的开闭，艰难的抉择
气孔的开闭与保卫细胞的形态特征有关，保卫细胞通常呈肾形或哑铃形。对于’肾形的保卫细胞来说，位于气孔内侧的细胞壁较厚，坚韧而有弹性；外侧的细胞壁较薄，可胀缩；而哑铃形的保卫细胞，其两端壁薄，中间壁厚。气孔的开闭与保卫细胞细胞壁的厚薄均匀程度密切相关。气孔开闭的动力则来自保卫细胞膨压的变化，当保卫细胞内的水分增加时，细胞膨压增大，肾形的保卫细胞位于孔口边的胞壁厚，保卫细胞膨胀时向孔口一边弯曲，引起气孔张开。哑铃型的保卫细胞两端球型部分胞壁薄，中部胞壁坚厚。当细胞膨压提高、体积增大时，其两端向外膨胀，两个保卫细胞向对方挤压，迫使位于中部的气孔张开。而当膨压明显减小时，则正好相反，气孔趋向关闭。
对于在陆地上生活的植物来说，气孔的开闭能控制植物与外界的气体交换和水分蒸发。气孔的开闭是一件两难的选择，一方面植物需要张开气孔，以便吸收更多的二氧化碳进行光合作用；另一方面气孔张开的同时不可避免地会引起水分大量散失，因而从保持水分的角度讲，气孔应该关闭。由于陆地上的植物经常面临缺水的情况，从长期的进化结果看，气孔倾向于以最小的蒸腾来换取最大的光合作用。自然环境条件下，气孔的开闭受多种环境因素的综合影响，光照、二氧化碳、水分和温度等是影响气孔开闭的环境因素，同时气孔的开闭也与植物本身的发育阶段等因素相关。不同类型的植物气孔开闭对环境的变化有不同响应，这也反映了植物应付生态环境战略的差异化。
气孔的数量及表示方法
气孔在叶片表面的分布状况和数量的多少与植物种类有关，同时也受环境因素的影响。定量描述气孔的数量，通常用气孔参数，也就是单位叶表面的气孔数量表示。气孔密度和气孔指数是两种常用的气孔参数。气孔密度为单位叶表面积内的气孔个数，通常要换算为每平方毫米内的气孔个数。气孔指数是单位叶表面积内的气孔个数除以气孔个数和表皮细胞个数之和，再乘以100。用公式表示为：气孔指数=100×气孔个数(气孔个数+表皮细胞个数)。
由气孔密度的计算方法可知：气孔密度的大小与气孔数量和表皮细胞的大小密切相关。比如，同一片叶子，在良好的生长条件下，生长发育较快，在气孔数量几乎不变的情况下，叶片的表皮细胞生长迅速，叶片表面积较大。这种情况下计算出的气孔密度值较小，而实际的气孔数量几乎不变。在上述情况下(即气孔和表皮细胞的数量不变，气孔和表皮细胞体积增大)，由气孔指数的计算方法可以看出，气孔指数的值不变，气孔指数可以部分消除表皮细胞大小带来的影响，显然用气孔指数表示气孔的数量更科学。
气孔数量，记录大气二氧化碳浓度变化
工业化革命以来，大气中二氧化碳浓度的变化，以及由此引起的温室效应，受到人们的普遍关注。环境和气候―旦发生变化，生活在其中的植物就会做出相应的改变，如种群数量和分布区的变化，以及个体形态结构和生理功能的变化等。反过来讲，植物的这些变化特征，也能反映出周围环境和气候的变化。换句话说，大气中二氧化碳浓度的改变可以直接影响到生活在其中的植物。实验证实，气孔参数的改变是植物对大气二氧化碳浓度变化的主要反应之一，因而利用气孔的数量变化可以推测出大气中二氧化碳浓度的变化。
短期内大气中二氧化碳浓度的变化，只能影响气孔的开闭，只有二氧化碳浓度的变化持续几个生长季节，才能改变植物的气孔参数。开展长时间尺度上二氧化碳浓度与气孔参数相关性探索始于1987年伍德沃德的工作。伍德沃德研究了230多年前采集的8种温带树种的标本、分析其气孔参数，并与现在采集的材料进行比较。结果发现，二氧化碳浓度从当时的280微摩尔／摩尔增加到目前浓度的过程中，这些树种的气孔参数大约减少了40％。
类似的结果在许多人为控制二氧化碳浓度的实验中也得到了证实。在叶片生长过程中，气孔参数对大气中二氧化碳浓度的变化非常敏感，经过几个生长季节后，气孔参数与大气中二氧化碳浓度呈负相关关系，但这种关系与植物的种类有关，也就是说，并不是每种植物与大气中二氧化碳浓度的变化之间都存在这种相关性。
受腊叶标本采集时间以及人工控制条件下的实验周期的限制，目前我们只能研究几年到几百年范围内大气中二氧化碳浓度的变化。不过，通过研究在古代墓室内发现的3000多年前的植物叶片，科学家把气孔密度与二氧化碳浓度的相关性研究向前推了几千年。
