关节软骨的生物力学特性范文1
【关键词】 骨关节炎 软骨退变 软骨下骨 骨重塑 骨硬化
【摘要】 ：很多实验证明软骨下骨在骨关节炎的发生发展过程中发挥着重要作用，软骨下骨硬化可能是关节炎发病的始发因素，但是关节软骨退变与软骨下骨硬化之间的因果关系至今仍不完全清楚。骨重塑异常导致的软骨下骨硬化，极大的减弱了软骨下骨吸收应力震荡的作用，使其丧失保护关节软骨的功能，进而引起关节软骨退变，加速骨关节炎进程。研究软骨下骨在骨关节炎发病机制中的作用、开发调控软骨下骨重塑的药物必将给骨关节炎的防治开辟一条崭新的途径。
【关键词】 骨关节炎 软骨退变 软骨下骨 骨重塑 骨硬化
role of subchondral bone in the pathogenesis of osteoarthritis
shan peng-cheng,cao yong-ping
department of orthopaedic surgery，peking university first hospital,beijing 100034, china
abstract: many studies have proved that the subchondral bone plays an important role in the development of osteoarthritis ,and may be the initial factor of the disease, but the exact relationship between articular cartilage degeneration and subchondral bone sclerosis is still unclear. subchondral bone sclerosis caused by bone remodeling abnormality severely decreases the ability of subchondral bone stress absorption and protective function of articular cartilage ,which finally leads to cartilage degeneration and osteoarthritis deterioration . studying the role of subchondral bone in the pathogenesis of osteoarthritis and developing potential drugs to regulate subchondral bone remodeling will provide a new way of prevention and treatment for osteoarthritis.
key words：osteoarthritis; cartilage degeneration; subchondral bone; bone remodeling; bone sclerosis
骨关节炎(osteoarthritis，oa)是一种主要累及负重关节的慢性、退行性疾病，其典型的病理特征为关节软骨进行性退变、软骨下骨骨质硬化。临床上以关节疼痛、肿胀、活动受限、关节畸形等为主要表现。oa病因复杂，至今仍不完全清楚，导致oa发病的可能因素包括年龄、肥胖、过度负重及创伤等。长期以来，骨关节炎被认为始发于关节软骨代谢紊乱、局部软骨降解［1、2］，但是近些年的研究发现，oa早期已经出现软骨下骨骨转化增强、骨小梁结构改变，而且很多实验证明，软骨下骨硬化在骨关节炎的发生和发展中发挥着重要作用，可能是oa发病的始发因素［3、4］。因此研究软骨下骨在oa进程中的作用以及调控软骨下骨硬化来防治oa，已经成为目前oa研究的热点。
1 软骨下骨的解剖构成
软骨下矿化组织可以分为三层：钙化软骨、软骨下皮质骨和软骨下松质骨(图1)，它们在形态学、生理学及机械作用方面是各不相同的［5］。作者通常所说的软骨下骨包括软骨下皮质骨及其下方的骨小梁、血管和小梁间腔隙等。软骨下骨区含有数量众多的动脉、静脉和神经，它们的细小分支不规则地排列成口径不一的窦状小管，这些窦状小管的末端与构成横向静脉窦的细小静脉丛相连。软骨下骨区的小动脉、小静脉和窦状小管穿行在皮质终板的血管通道中，将髓腔和钙化软骨层连接起来，向得不到关节液滋养的深层软骨提供营养。
2 软骨下骨的生物学功能
软骨下骨的主要生物学功能为吸收应力、缓冲震荡和维持关节形态。
软骨下骨的弹性模量比关节软骨低，但数量相对较多，所以在缓冲震荡中起主要的衬垫作用，保护关节软骨免受过度应力的损伤［6］。在正常负重情况下，富含水分的关节软骨可将所受应力分散传导，但却仅能缓冲所受应力的1%～3%。当所受应力从关节软骨向骺端传导时会形成较大的剪切力，此时钙化软骨、软骨下骨和锯齿状潮线的波动可将这种剪切力转化为压力和张力，所以当关节所受的应力传到软骨下骨时几乎完全是压力和张力［7］。软骨下骨可将传来的力缓冲掉30%，其余的部分被皮质骨和周围的关节囊所吸收。正常关节中软骨下骨的密度和厚度是不均一的，所以不同部位软骨下骨的生物力学特性也有所不同，其缓冲震荡的衬垫作用也随所受应力的改变而改变，使不同部位的软骨下骨力学特性与其衬垫作用达到最佳平衡，从而维持关节的正常生理环境。
软骨下骨的另一作用是维持了不一致的关节表面形态，使周围的关节面保持密切接触，而中央的关节面不接触。这样关节在负重时其中央部分可发生轴向移动，将所受的应力传到周围的皮质骨，这有助于维持关节软骨浅层的营养。
3 骨关节炎中软骨下骨的病理生理
在骨关节炎中软骨下骨硬化非常常见， 目前就软骨下骨硬化与关节软骨退变之间的关系存在两种假说：一种观点认为作用在关节上反复的超负荷压力导致骨与关节软骨的轻微损伤、水肿和出血。随着关节软骨的缓慢侵蚀，软骨下骨逐渐硬化，最终导致软骨下骨硬度升高，这可能反过来引起关节软骨进一步损伤［1］；另一种观点认为，软骨下骨的硬化发生在关节软骨改变之前，关节软骨的完整性依赖于其下方骨床的生物力学特性，因此软骨下骨硬化可能是骨关节炎发病的始发因素［3、4］。
oa软骨下骨硬化可能与成骨细胞的功能缺陷有关。研究表明来自oa软骨下骨的成骨细胞在甲状旁腺激素和前列腺素的刺激下合成环磷酸腺苷的能力较来自正常人群的成骨细胞低［8］。软骨下骨的硬化还可能与局部和系统的力学因子有关，这主要是指胰岛素样生长因子(igf)和血浆酶原，并且血浆酶和血浆酶原系统调节着igf系统的活性。igf以及igf连接蛋白系统的激活促进软骨下骨成骨细胞过度增殖，从而导致软骨下骨的增厚和硬化［8、9］。
软骨下骨具有粘弹性特性，急性过度负重比逐渐过度负重更容易导致微损伤。软骨下骨和钙化软骨的反复微损伤将启动骨重塑过程［10］。mori和sokoloff等研究发现oa患者钙化软骨和软骨下骨的微损伤增加，这些微损伤启动了骨重塑过程，由于骨重塑区的血流增加和破骨细胞的局部溶骨，软骨下区可表现为短暂的骨质疏松。重塑过程中纤维血管长入钙化软骨中，产生了新的软骨下骨和新的软骨矿化区，导致了潮线的扩展和软骨下骨的硬化，软骨下骨的这种慢性改变最终导致了关节软骨的变薄和丢失［11、12］。关节软骨和软骨下骨的过度负重还可以导致未钙化软骨的结构改变，包括纤维损伤和产生异常基质蛋白，导致软骨水肿和深层软骨区的肿胀。如果持续过度负重，软骨下骨的硬化、纤维化、囊性变等将导致其血液循环减少，进一步加重深层关节软骨和软骨下骨的损伤以及未钙化软骨浅层发生剥脱并导致关节表面不规则，甚至关节软骨的全层缺失。
4 软骨下骨硬化与关节软骨退变的关系
关节软骨退变是进展期骨关节炎的显著病理改变，因此很多学者认为骨关节炎始自关节软骨细胞合成蛋白多糖的减少，并逐渐发展为胶原纤维框架结构改变，最终导致关节软骨退变［1］。然而，burr db认为在骨关节炎发病中软骨下骨起着重要作用，软骨下骨硬化不仅可以加速疾病进程，而且可能是骨关节炎发病的始发因素［5］。day等通过实验证明在骨关节炎早期关节软骨退变之前，软骨下骨已经出现弹性模量减低、骨量减少的改变［13］。他们认为软骨下骨在oa发病中发挥着至关重要的作用。
1986年，radin和rose首先提出软骨下骨硬化可能是导致软骨损伤的重要因素。他们认为软骨下骨就像一把坚硬的椅子，而关节软骨就像放在上面的软垫，如果椅子表面的硬度不均匀，垫子承重后就会产生剪切力，造成关节软骨损伤［6］。在众多相互争论的关于骨关节炎病因的理论中，这是第一个主要强调软骨下骨作用的一种假说。1993年，dieppe等首次用实验数据证明了软骨下骨与关节软骨之间存在密切关系。他们对94位膝骨关节炎患者进行5年的前瞻性研究，结果显示入组时48%的患者胫股关节面存在软骨下骨硬化，34%的患者存在关节间隙狭窄>2 mm或者需要手术治疗，54%的人最终发展到关节间隙狭窄>2 mm或是行膝关节置换术。64%的膝关节有同位素异常浓聚，其中88%为进展期骨关节炎。这组数据强有力的支持了关节软骨进行性损伤与软骨下骨硬化之间存在密切关系。遗憾的是，此实验未能从根本上说明关节软骨降解与软骨下骨硬化之间的因果关系［14］。
为了进一步研究二者之间的关系，libicher等利用狗前交叉韧带横断骨关节炎模型，通过mri检查，发现在软骨退变发生之前软骨下骨已经出现骨髓水肿［3］。tomoya muraoka等利用hartley豚鼠自发性骨关节炎模型进行研究，结果发现2个月龄时其软骨下骨已经发生结构的改变，直到3个月龄时才发现关节软骨细胞减少，而且随时间延长数目不断减少。通过此实验，tomoya muraoka认为，软骨下骨改变是发生在关节软骨降解之前的［4］。
然而，yamada等通过对72名志愿者140膝的研究发现，软骨下骨增厚及骨密度增加不是导致关节软骨退变的原因，软骨下骨硬化更像是继发于关节软骨损伤的结果［2］。raudenbush等认为软骨下骨硬化与关节软骨降解之间不存在必然联系［15］，这就意味着软骨下骨硬化可能并不是关节软骨降解的病因。
目前，虽然关节软骨退变与软骨下骨硬化之间的因果关系仍不完全清楚，但是人们对骨关节炎的发病机制已经有了新的认识，不再认为是由于单纯的关节软骨磨损及撕裂而导致的不可避免的结果。软骨下骨在骨关节炎发病中的作用越来越受到重视，而且越来越多的研究支持软骨下骨硬化继发关节软骨损伤这一理论。
5 调控软骨下骨重塑对关节软骨退变的作用
早在上世纪80年代，radin和rose便已提出骨关节炎的发病中机械因素起至关重要的作用［6］。而且很多研究证实骨关节炎中软骨下骨改变早于关节软骨退变［3、4］。骨重塑异常导致的软骨下骨密度增高和硬化，极大的减弱了软骨下骨吸收应力震荡的作用，使其丧失保护关节软骨的功能，引起继发性关节软骨退变［5］。因此，通过调控软骨下骨重塑来防治骨关节炎越来越受到研究者的关注。
tadashi hayami等人［16］建立大鼠前交叉韧带横断骨关节炎模型，发现在骨关节炎早期骨转换增强，继发软骨下骨硬化，应用阿仑磷酸钠后，不仅抑制了软骨下骨硬化，而且还降低了关节软骨降解产物血清软骨低聚物基质蛋白和尿ⅱ型胶原c端肽的水平，有效地减缓了骨关节炎进程。lajeunesse等［17］利用狗膝关节前交叉韧带横断oa模型，通过体外培养膝关节软骨下骨成骨细胞，测量其代谢表型标志物、碱性磷酸酶、骨钙素及upa、igf-1等物质的水平，发现oa成骨细胞与正常细胞相比代谢活性明显增强，应用环氧化酶抑制剂licofelone后，其分泌的upa、igf-1、peg2等因子的水平明显降低。因此，lajeunesse认为licofelone可以改变软骨下骨代谢活性，间接稳定关节软骨的生物力学环境，减少关节软骨的损伤。此外，hayami等［18］应用大鼠膝关节创伤性骨关节炎模型，发现在软骨退变及软骨下骨硬化之前已经出现软骨下骨骨吸收增强，而且与oa早期发病关系密切，认为骨吸收抑制剂可以作为潜在药物用于oa的防治。
tat等［19］利用oa患者膝关节置换术后股骨髁标本进行软骨下骨成骨细胞体外培养，加用硫酸软骨素及氨基葡萄糖进行干扰，结果发现：两种药物对骨吸收活性均有抑制作用，硫酸软骨素能够增加骨转换过程中骨保护素／rankl的比率，在oa疾病进程中发挥积极作用。boileau等［20］应用相同的方法，证明双醋瑞因可以抑制骨吸收因子mmp-13及组织蛋白酶k的活性，抑制破骨细胞的生成，调节软骨下骨异常代谢，对关节软骨产生保护作用。
软骨下骨硬化在oa的发生和发展中发挥着至关重要的作用。软骨下骨代谢增强、骨重塑加快所导致的软骨下骨硬化可能是引起软骨退变的始发因素，而且会进一步加速oa的进程。研究软骨下骨在oa发病机制中的作用，通过调控软骨下骨硬化以减少关节软骨损伤必将给oa的防治带来新的理念。
6 展望
虽然软骨下骨在骨关节炎发病机制中的作用还不完全清楚，但是软骨下骨与关节软骨紧密的解剖关系决定了它的特殊作用。很多实验已经证实，通过药物调控软骨下骨代谢活性、抑制骨重塑速度可以延缓骨关节炎的进程。因此，开发调控软骨下骨代谢和重塑的药物，调节软骨下骨的代谢活性和骨重塑强度，改善软骨下骨硬化，必将为骨关节炎的防治开辟一条崭新的途径。
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关节软骨的生物力学特性范文2
【关键词】 骨关节炎；软骨；潮线；软骨退变；软骨下骨；相关性；大鼠
doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2014.01.002
Correlation Study of Cartilage Tidal Line Drift and Degradation in Osteoarthritis
LI Xi-hai，LIANG Wen-na，YE Hong-zhi，LIU Fa-yuan，LI Hui-ting，ZHENG Chun-song，WU Guang-wen，
XU Hui-feng，CHEN Wen-lie， LIU Xian-xiang
【ABSTRACT】 Objective：To investigate the correlation between cartilage tidal line drift and degeneration in osteoarthritis.Methods：20 SD rats of 8 weeks old were randomly and equally divided into the normal group and the model group.Injections of 4% papain were given to their double knee joint cavities to replicate the osteoarthritis models.After 8 weeks，the bilateral knee joints of the rats were taken conventionally，fixed，decalcified，embedded and sliced，respectively using hematoxylin-eosin，safranin O-fast green，toluidine blue and Masson trichrome staining，observing the osteoarticular histological changes.Results：The normal joints characterized smooth articular surface，cells arranging in neat rows，four-layer structure being clear，tidal lines being complete wavy and subchondral bone trabeculas being regular； but the joints with osteoarthritis characterized deformed and rough articular surface，cells arranging in disorder，the four-layer structure being not clear，multiple tidal lines or interrupted tide lines being visible and subchondral bone trabeculas being sclerotic and cystic.Conclusion：Cartilage tidal line drift is the necessary pathological changes in the process of cartilage degeneration in osteoarthritis.
【Keywords】 osteoarthritis；cartilage；tidal line；cartilage degeneration；subchondral bone；relevance；rats
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见的慢性、进行性关节疾病，在生物学和力学因素共同作用下导致软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨三者降解和合成正常偶联失衡的结果[1-2]。目前，OA研究主要集中在软骨退变方面，而软骨潮线漂移研究相对较少。软骨潮线漂移引起软骨下骨重建异常，导致软骨下骨生物力学改变，降低对关节软骨保护能力，从而引发软骨退变[3]。本文旨在通过观察软骨潮线漂移与软骨退变的关系，探讨软骨潮线漂移在骨关节炎病理进程中的作用。
1 实验材料
1.1 实验动物 清洁级8周龄SD大鼠20只，雄性，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：SCXK（沪）2007-0005。医学实验动物环境设施为福建中医学院动物实验中心鼠类实验室，清洁级（合格证号：医动学第23-016号）。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。
1.2 药品与试剂 10%水合氯醛，批号SF0341，上海士锋生物科技有限公司生产；4%木瓜蛋白酶，批号107147，sigma公司生产；苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin，HE），批号G1120，北京索莱宝科技有限公司生产；番红O-固绿，批号DB0082，北京雷根生物技术有限公司生产；甲苯胺蓝，批号198161，sigma公司生产；Masson三色，批号C0620，百浩生物生物科技有限公司生产。
2 方 法
2.1 实验方法 采用抽签法将SD大鼠随机分为正常组和模型组，每组10只。模型组第1，4，7天，用10%水合氯醛3 mL・kg-1腹腔麻醉，4%木瓜蛋白酶0.2 mL双膝关节腔注射建立骨关节炎模型[4]，
8周后，取双侧膝关节股骨髁（0.4 cm×0.3 cm×
0.2 cm）常规固定、脱钙、包埋和切片，分别采用HE、番红O-固绿、甲苯胺蓝和Masson三色染色法，观察关节软骨组织形态的变化。参考Mankin's骨关节炎组织学分级方法进行评分[5]。
2.2 检测方法
2.2.1 HE染色 切片常规脱蜡，苏木精染液4 min，
1%盐酸酒精分化液分色10 s，伊红染液3 min，脱水透明封片。HE染色观察软骨组织结构、软骨细胞与软骨下骨的变化。
2.2.2 番红O-固绿染色 切片常规脱蜡，新鲜配制的试剂（A）即Weigert苏木素染液染色3 min，盐酸乙醇分化液分化15 s，蒸馏水洗1 min， 固绿染色液内浸染5 min，蒸馏水洗1 min，番红 O染色液内浸染 2 min，蒸馏水洗1 min，用乙酸溶液洗涤切片1 min，脱水透明封片。番红O-固绿染色观察蛋白聚糖的变化。
2.2.3 甲苯胺蓝染色 切片常规脱蜡，0.1%甲苯胺蓝溶液10 min，蒸馏水稍洗，快速95%与100%乙醇脱水，二甲苯透明和封固。甲苯胺蓝观察蛋白多糖的变化。
2.2.4 Masson三色染色 切片常规脱蜡，Weigert苏木素A和Weigert苏木素B等比混合，染色10 min，
蒸馏水洗1 min，Masson复合染色液染色15 min，蒸馏水稍冲洗，1%磷钼酸液处理5 min，苯胺蓝染色液复染5 min，1%冰醋酸水处理1 min，脱水透明封片。Masson 三染色观察软骨基质胶原的变化。
2.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。数据以表示，采用one-way ANOVA分析；计量资料采用Logistic回归分析Chi-square tests。
3 结 果
3.1 骨关节炎退变软骨的组织形态 正常组软骨细胞核呈深蓝色，胞浆及软骨基质呈粉红色，着色均匀；软骨表面光滑平整，表层细胞较小呈长扁形，平行于软骨表面排列；移行层软骨细胞较大呈椭圆形或圆形，同源细胞群分布散在；放射层软骨细胞较大单个或趋于柱状排列，分布散在。细胞排列整齐，四层结构清晰，潮线完整。软骨下骨致密层厚度适中，松质层骨小梁密度和宽度适中，排列规律，骨细胞呈梭形，分布均匀，骨基质均匀红染。图1（1）。模型组软骨表面粗糙，完整性破坏，表层软骨出现纤维化变性及软骨缺损，甚至软骨下骨，软骨细胞出现簇集现象，或肥大软骨细胞增多，可见较多空软骨陷窝。细胞排列紊乱，四层结构不清晰，可见多重潮线或潮线中断。软骨下骨致密层变薄，骨松质层骨小梁稀疏，硬化或囊变，边缘有丘状隆起的骨赘。图1（2）。正常组与模型组的干骺端组织形态结构未见明显异常，图1（3）、1（4）。
图1 关节软骨与干骺的形态学观察（HE染色×40）
3.2 骨关节炎软骨基质的蛋白多糖含量减少和纤维变性 番红O与固绿染色分别染色，软骨与软骨下骨染色均匀，不能区分各组织的层次结构，图 2、图3。正常组软骨基质中蛋白多糖红染均匀，胶原纤维呈绿色，潮线清晰，软骨下骨皮质和骨小梁呈绿色，软骨与软骨下骨界限清楚，图4（1）。模型组软骨基质中蛋白多糖染色较淡，染色范围小，而绿色范围增大，由软骨表层和放射层向中间延伸，软骨表面的膜样结构破坏，图4（2）。正常组与模型组的干骺端蛋白多糖与胶原纤维表达未见明显异常。图4（3）、4（4）。
甲苯胺蓝染色，正常组软骨细胞核呈蓝色，软骨基质中的蛋白多糖异染呈紫蓝色，染色深且阳性面积范围大，软骨下骨基质染色很淡，图5（1）。模型组软骨基质染色的深度和面积都明显下降。图5（2）。正常组与模型组的干骺端蛋白多糖表达，未见明显异常，图5（3）、5（4）。
Masson三色染色，正常组软骨基质和胶原纤维呈绿色，着色均匀，向钙化层方向染色逐渐加深，潮线清晰，软骨和软骨下骨边界清晰，软骨下骨的密质骨及骨小梁呈绿色，骨胶原呈红色，图6（1）。模型组软骨失染，有裂隙，纤维化明显，潮线附件有大量火焰状升起的深色红染，升起较高，范围较大，软骨和软骨下骨边界不清晰，图6（2）。正常组与模型组的干骺端胶原纤维表达未见明显异常，图6（3）、6（4）。
3.3 OA软骨退变的程度 Mankin's软骨组织形态学的分级标准，根据软骨退变程度计分，表层软骨细胞分裂增生（0～3分）、细胞排列（0～3分）、潮线（0～3分）、血管翳样物生成（0～3分）、AB-PAS染色（0～4分），最高为16分，是判断骨关节炎软骨退变的常用方法之一。关节软骨Mankin's评分，模型组（10.25±2.68）明显高于正常组（1.17±0.61）（P < 0.01），图7。正常组软骨潮线清晰，呈波浪起伏的曲线，模型组均出现软骨潮线紊乱，Logistic回归分析Chi-square tests显示软骨潮线变化与骨关节炎的发生发展密切相关（P < 0.01）。
正常组 模型组
图7 关节软骨Mankin's评分
注 1）P < 0.01
4 讨 论
OA本质上可能是一种生物学的重建过程，是多种生物因素与机械损伤因素相互作用所致生物力学紊乱而引起的病理改变。OA的发病率随着人口老龄化逐渐增加，已成为严重的公共健康问题。目前，OA发病的分子机制尚不清楚，且缺乏有效治疗方法，故OA的发病机制和防治是临床和基础研究的热点问题。OA动物模型的建立是研究OA发病机制及防治的常用方法，通过观察关节软骨的组织形态学，探讨动物模型的成功与否及防治疗效，为OA的深入研究提供了一个有效的技术平台。
关节软骨由软骨细胞和软骨基质组成，在生理条件下，软骨基质成分的分解与合成之间保持动态平衡。软骨细胞是软骨中唯一细胞类型，也是调节软骨代谢反应的主要来源，软骨细胞能感受细胞外基质微环境的变化并做出相应的反应，以维持基质成分分解与合成代谢的平衡，保持关节软骨的正常生理功能[6]。胶原和蛋白多糖是软骨细胞外基质的主要成分，软骨基质中的胶原以Ⅱ型胶原为主，是软骨基质的特征性胶原成分，构成软骨内的纤维网架结构；蛋白多糖由不同分支状的多糖聚合体组成，能吸引大量的水分子形成凝胶，保持软骨的良好弹性和膨胀能力。OA患者软骨基质结构发生破坏，以蛋白多糖和Ⅱ型胶原的破坏为主，出现胶原的变性、裂解、破坏、减少及晚期胶原纤维网架的消失，蛋白多糖含量下降，进而引起软骨细胞功能改变，基质成分分泌减少，从而加速软骨退变。软骨下骨由软骨下骨板及其下方的骨小梁、血管和小梁间腔隙构成，是关节软骨的重要功能单位，对软骨起到机械性和代谢性的保护作用[7]。OA的病理过程中，软骨下骨发生骨塑形重建的方式是直接在关节软骨负重面的下方，或在关节的边缘，形成OA的骨赘[8]。在骨重建过程中，骨形成与骨吸收相耦联，成骨和破骨在同一部位有序进行，OA早期，软骨下骨重建以骨吸收占主导，后期则骨形成为主，从而导致软骨下骨硬化[9-10]。
潮线位于软骨放射层与钙化层的连接部，呈波浪起伏的曲线，具有防止软骨钙化的作用，属于放射软骨层的组成部分，潮线上下的胶原纤维是连接的，有利于放射层软骨的胶原纤维牢固地附着在钙化软骨层的髓腔层，并且有密集的胶原纤维平布潮线的表面，以对抗剪应力和限制软骨钙化[11-12]。潮线在关节软骨钙化过程中发挥重要的调控作用，虽软骨潮线漂移与软骨下骨变化的因果关系尚不确定，但软骨潮线漂移程度与软骨下骨变化存在一定的相关性，在OA软骨退变病理过程中发挥重要的调控作用。
HE染色法是依据苏木素的嗜酸性及伊红的嗜碱性特点，苏木素染组织中酸性成分（如核酸）呈蓝色，而伊红染组织中碱性成分（如蛋白质）呈红色，从而显示组织的形态结构[13]。HE染色法显示，OA的软骨层破坏，层次结构紊乱，软骨细胞凋亡，潮线漂移；软骨下骨硬化及囊变的病理现象。但HE染色的骨关节组织，软骨和软骨下骨的界限不清晰，也难以特异显示软骨基质的病变情况，可结合特殊染色法以弥补常规染色的不足。因此，本研究采用特殊染色法（番红O-固绿、甲苯胺蓝及Masson三色染色法）观察OA的蛋白多糖和胶原纤维的变化。
番红O-固绿染色法是OA组织形态研究的常用特殊染色法，番红O是一种碱性染料，即阳离子染料，能与酸性蛋白多糖（含阴离子）结合呈红色，染色强度曲线与软骨基质中固定电荷的密度曲线呈线性关系，可以通过图像分析系统进行半定量分析软骨基质中的蛋白多糖；固绿是酸性染料，与富含碱性氨基酸的胶原结合呈绿色，具有衬染的作用[14]。实验结果显示，番红O-固绿染色法能清晰区分软骨和软骨下骨，也能清晰地显示软骨潮线，可以用于观察软骨组织的层次结构及软骨厚度的形态计量学。甲苯胺蓝染色法是骨关节染色研究中的常用方法之一，常用于培养软骨细胞的鉴定及软骨蛋白多糖的半定量分析，甲苯胺蓝是一种碱性染料，与软骨基质中酸性蛋白多糖异染呈紫蓝色，其原理是糖蛋白上的酸性基团与甲苯胺蓝的阳离子结合时，染料分子发生聚合反应，导致吸收光谱的改变出现异染。实验结果显示，甲苯胺蓝染色法可清晰区分关节软骨与软骨下骨界限，潮线结构的显示亦可，而软骨下骨的形态结构不能清晰显示。
Masson三色染色法由Mallory三色染色改造，主要用于胶原纤维和肌纤维的鉴别染色，利用2种或3种阴离子染料混合一起或先后作用完成染色，与组织的渗透性和阴离子染料分子的大小有关。根据组织的渗透性能不同，选择分子大小不同的阴离子染料进行染色，胶原纤维、软骨与粘液呈蓝色，肌纤维、纤维素及红细胞呈红色，细胞核呈蓝黑色[15]。
Masson三色染色法可清晰显示软骨的各层结构，软骨和软骨下骨的界限显示不够清晰；胶原纤维分为多种类型，骨组织以Ⅰ型胶原为主，软骨以Ⅱ型胶原为主，且OA病理过程中软骨细胞的表型和胶原纤维的类型发生转化，而Masson三色染色法使所有的胶原纤维呈同一种颜色，不能区分胶原纤维的变性，可采用Ⅰ型、Ⅱ型胶原免疫组织化学法观察关节软骨和软骨下骨胶原成分的变化。
通过染色观察，HE染色显示模型组软骨破坏严重，同时伴有潮线紊乱、软骨下骨硬化或囊变、关节边缘骨赘，提示软骨潮线漂移与软骨退变有一定的相关性。番红O-固绿染色与甲苯胺蓝染色结果显示，模型组蛋白多糖失染明显；Masson三色染色显示模型组软骨绿色丢失程度明显，且染色同软骨下骨及骨小梁胶原，提示OA病理进程中，软骨基质中胶原和蛋白多糖的含量减少及胶原类型的转变。Mankin's评分结果显示，OA组明显高于正常组，表明本实验造模方法能较好的建立膝OA的动物模型。
综上所述，软骨潮线漂移是OA软骨退变进程中必经的病理变化，参与软骨基质代谢及软骨下骨重建的调节过程。HE染色、番红O-固绿染色、甲苯胺蓝染色与Masson三色染色均能清晰观察关节软骨的组织形态结构，但各种方法所显示组织形态结构的部分不同，可根据实验设计的目的不同，选择不同染色方法，为OA关节软骨染色方法的选择提供参考依据。
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关节软骨的生物力学特性范文3
【关键词】骨性关节炎 透明质酸钠 分子量
中图分类号：R684文献标识码：B文章编号：1005-0515（2011）11-264-02
骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病,是老年人关节功能障碍和致残最常见的原因之一[1]。透明质酸钠(sodium hyaluronate) 广泛存在于生物体内，为关节腔滑液的主要成分，也是软骨基质主要成分之一，关节腔内注射透明质酸钠可明显改善滑液组织的炎症反应，提高滑液中透明质酸钠含量，保护关节软骨，促进关节软骨的愈合与再生，缓解疼痛，增加关节的活动度，因此关节腔内注射透明质酸钠是一种安全可靠的治疗膝骨性关节炎的方法[2]。透明质酸属于粘多糖的一种，由特定的重复双糖单位构成，具有良好的生物相容性、自动粘附性和可吸收性，这对滑膜关节的、软骨的保护以及对关节生物力学特性的维持起着重要作用[3]。组成透明质酸钠的基本双糖单位的多少决定了它的分子量大小，不同分子量的透明质酸钠在治疗上具有不同的临床意义。本研究即选用不同厂家、不同分子量的透明质酸钠，针对骨性关节炎修复治疗作用的特点开展了实验研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物 新西兰大白兔，体重(2.2±0.3)kg，郑州大学医学院动物实验中心提供，自由觅食和饮水，室温(23±2)℃，自然光照。
1.2 药品 透明质酸钠注射液，透明质酸钠25mg，分子量90万(阿尔治，2.5ml/支，日本生化学工业株式会社生产，批号7726)；透明质酸钠注射液，透明质酸钠20mg，分子量150～250万(施沛特，2.0ml／支，山东博士伦福瑞达制药有限公司生产，批号070211022)
1.3 实验方法
采用木瓜蛋白酶致兔膝骨性关节炎进行病理学研究。4组新西兰大白兔，每组15只，分为两个给药组(大分子量透明质酸钠组和小分子量透明质酸钠组)、空白对照组和生理盐水对照组(NS组)。其中，给药组和生理盐水对照组关节腔内注入木瓜蛋白酶造成骨关节病变模型，空白对照组不做造模。兔右膝关节腔内注入1.6％木瓜蛋白酶(Merck产品)生理盐水溶液0.5 ml，隔3天后，再注射第2次，共注射木瓜蛋白酶2次。于末次注射后的第7天，对治疗组和NS组分别在右膝关节腔内注射药物和生理盐水0.3 ml，每周1次，共5周。于末次注射后的第7天，将兔处死，打开关节腔进行大体观察后取标本，进行组织学研究。对侧标本作为正常对照。观察指标：膝关节有无积液和滑膜肿胀等滑膜炎表现，并于解剖显微镜下观察股骨内髁关节面的病理改变。按以下标准评分：
0分：关节面光整，色泽如常；
1分：关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰暗；
2分：关节面糜烂，软骨缺损深达软骨表中层；
3分：关节面溃疡形成，缺损深达软骨深层；
4分：软骨剥脱，软骨下骨质暴露。
取膝关节股骨髁及部分半月板软骨和滑膜做光镜标本。滑膜行4％多聚甲醛固定，再按常规脱水、浸蜡、包埋、切片、HE染色观察滑膜形态学变化。软骨标本采用4％多聚甲醛(pH 7.4)固定72 h，15％乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙10周，石蜡包埋，HE染色观察软骨形态学变化。
1.4 统计学处理 结果采用SPSSl7.0软件处理，采取单因素方差分析(one―way ANOVA)检验，以P
2 结果
透明质酸钠对木瓜蛋白酶致兔膝骨性关节炎的治疗作用病理学研究显示，空白对照组关节软骨排列规整，层次无明显异常，生理盐水对照组滑膜组织增生，血管扩张充血，大量炎细胞浸润，大分子量透明质酸钠组显示滑膜组织增生，炎细胞浸润，但与生理盐水对照组相比改善显著；小分子量透明质酸钠组关节软骨和滑膜炎性改变较轻，较生理盐水对照组改善非常显著。
表l病理学评分显示，大、小分子量透明质酸钠治疗组较生理盐水对照组均有显著性差异，两种药物治疗效果明确。其中，小分子量透明质酸钠组较模型组差异非常显著(P
表1 木瓜蛋白酶致兔膝骨性关节炎各组股骨内髁关节面的病理学评分
（1）P
3 讨论
透明质酸钠为广泛存在于动物和人体内的生理活性物质。在人皮肤、关节滑膜液、脐带、房水、眼玻璃体中均有分布。自20世纪70年代以来，透明质酸钠应用于临床治疗骨性关节炎，疗效确切[3,4]。本品具有高度的粘弹性、可塑性、以及良好的生物相容性，在预防粘连和修复软组织方面有明显作用。透明质酸钠为关节滑液的主要成分，是软骨基质的成分之一。在关节腔内起作用，可覆盖和保护关节软骨，改善关节挛缩，抑制软骨变性变化表面，改善病理性关节液，增加功能。还可抑制局部炎症的发生，从而延缓关节软骨退行性变的进程，通过遮蔽痛觉感受器以降低痛觉敏感性，缓解关节疼痛[5]。
本实验旨在观察不同分子量构成的透明质酸钠对骨性关节炎的治疗作用及其差异。选用目前国内临床常用的阿尔治和施沛特这两种不同分子量范围的透明质酸钠，阿尔治分子量90万， 施沛特分子量150～250万，可见，施沛特主要为相对大分子量透明质酸钠，阿尔治主要为相对小分子量透明质酸钠。
研究结果表明，在木瓜蛋白酶注射法制造的兔膝骨性关节炎模型中，骨性关节炎病理表现更严重，大分子量与小分子量透明质酸钠两组药物均显示有明确的治疗作用，其中，小分子量透明质酸钠组与生理盐水对照组比较改善更明显，较大分子量透明质酸钠组也有显著差异，提示小分子量透明质酸钠可能在促进软骨组织修复和减少滑膜组织增生方面治疗效果较好，优于大分子量透明质酸钠。可能机制是小分子量透明质酸钠更容易与纤维母细胞上的蛋白质结合，使纤维母细胞表现出运动活性，向组织损伤处移行，促进愈合，有保证营养物质渗透作用，为损伤细胞增生、合成、分泌胶原提供充足营养。
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关节软骨的生物力学特性范文4
【关键词】 组织工程 生物陶瓷 软骨修复 软骨细胞 成骨细胞
Abstract ［Objective］To evaluate the feasibility of repairing cartilage defect with tissue-engineered cartilage ，which was made of chondrocytes and osteoblast seeded onto a biodegradable porous bioceramic β-tricalcium phosphate (β-TCP)［Method］ A porous bioceramic template of β-TCP was created in the shape of a circular cylinder Chondrocytes and osteoblasts induced from dog bone marrow stem cells were seeded onto the β-TCP and then kept them growing together for 1 week prior to transplantation into the cartilage defects After 12 ， 16 weeks ，the specimens were harvested and examined macroscopically， histologically and immunohistochemically ［Result］ Gross morphological and histological analysis of the specimens from the β-TCP complex demonstrated new cartilage construction The result was better than that in control group ［Conclusion］ These findings suggest that porous bioceramic (β-TCP) is a good“matrix”for chondrocytes and osteoblasts， and can be used for cartilage engineering
Key words：tissue engineering;bioceramic;repair of cartilage;chondrocyte; osteoblast
关节软骨损伤是骨科临床的常见疾病，软骨损伤的修复一直是关节外科的一个难题。20世纪80年代以来，组织工程技术的迅速发展，为这一难题的解决提供了一种可行性的方法［1］。作者采用软骨组织工程技术，体外分离骨髓间充质干细胞（MCSc）为种子细胞，将其诱导为成骨细胞和软骨细胞，与β-磷酸三钙多孔陶瓷（β-TCP）复合培养后，移植到犬关节软骨缺损处，通过组织学及组织化学等观察，以了解和评估其软骨修复性能。
1材料和方法
11材料及仪器
（1）DMEM 培养基等试剂为Gibco 公司产品。（2）β-TCP 多孔陶瓷材料:由上海贝奥路生物材料有限公司提供。材料平均孔径为400~600 μm，孔隙率为75%±10%，气孔沟通率达100%。
12方法
121MSCs的提取及诱导培养
自比格犬股骨大转子下穿刺抽取约7 ml骨髓，Percoll分离法分离骨髓间充质干细胞，用含10%胎牛血清和青霉素及链霉素的L-DMEM培养液在37 ℃、5%CO2、 95%相对湿度的培养箱中培养。4 d后分别换含软骨细胞诱导因子、成骨细胞诱导因子的条件培养液继续培养。成骨细胞诱导因子的组成：地塞米松10nmol／L，β-甘油磷酸钠10 mmol／L，维生素C 50 mg／L；软骨细胞诱导因子的组成：转化生长因子β110 ng／L，胰岛素10 u／ml，地塞米松100 nmol／L。122Ⅱ型胶原免疫组化
在细胞诱导培养的第14 d，应用Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒（购于武汉博士德公司）在细胞爬片上染色并计算阳性细胞数。
123碱性磷酸酶染色
采用Gomori法，将无菌玻片放入培养皿中，待细胞长至半汇后取出，PBS冲洗后用冷丙酮固定10 min，蒸馏水冲洗数次；置于孵育液中（组成：3%β-甘油磷酸钠5ml，2%巴比妥钠5 ml，蒸馏水10 ml，2%CaCl210 ml，2% MgSO41 ml），37 ℃孵育4~6 h，自来水再冲洗数次；2%硝酸钴中浸3~5 min，蒸馏水再冲洗数次；1%的硫化铵中浸泡2 min，自来水冲洗，自然干燥，封固，光镜下观察。
124矿化结节染色
采用茜素红法，培养皿用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10 min，蒸馏水冲洗3次；加入少量01%茜素红-Tris-HCL(PH83)，置于37 ℃培养箱中30 min后，蒸馏水冲洗，干燥，封片，光镜下观察。
125体外构建细胞-生物陶瓷复合体
含软骨细胞诱导因子条件培养液培养BMSCs至14 d，取1 ml细胞悬液（含细胞2×107个）接种到β-TCP支架上，形成上端为软骨细胞的复合体，培养1周后，将1 ml成骨细胞诱导因子条件培养液培养BMSCs至14 d的细胞悬液（含细胞2×107个）注入软骨细胞-生物陶瓷复合体下端，形成软骨细胞-成骨细胞-β-TCP复合体(骨软骨细胞生物陶瓷复合体)，复合体培养1周后，行扫描电镜观察细胞贴附情况。
126骨缺损的建立及复合体的植入
比格犬15只，体重10~12 kg。用外径为6mm的环锯与股骨纵轴及矢状轴垂直方向在股骨髁最宽大处制成直径为6 mm，深10 mm的腔隙性缺损，根据植入骨类型分为三组：Ⅰ组：软骨缺损处植入软骨细胞-成骨细胞-β-TCP复合体；Ⅱ组：缺损处全层植入软骨细胞-未诱导分化组的MSCs -β-TCP复合体；Ⅲ组：空白对照，不植入任何材料。
于材料植入后的第12周、16周分两批处死动物，第1批每组2只动物，第2批每组3只动物，取材包括股骨下端的关节面，行镜下组织学观察及关节软骨缺损的组织学评分。
2结果
21细胞转化结果
211Ⅱ型胶原免疫组化结果
诱导培养后第14 d，MSCs定向分化为软骨细胞的阳性表现为细胞浆内棕黄色细密颗粒。光镜下MSCs细胞的胞浆染成黄色或棕黄色为阳性信号。A组细胞阳性染色，B组:有少许阳性细胞。在20×10视野下，每张爬片平均阳性细胞数见表1。
表1Ⅱ型胶原免疫组化阳性细胞数（个／视野）组别标本数阳性细胞数A组(加软骨细胞诱导液组)52353±375B组（对照组，只加培养基）5549±294A组与B组比较 ：t=473 有显著性差异 P＜005
212碱性磷酸酶（ALP）染色
成骨细胞具有合成分泌ALP功能，功能活跃的成骨细胞ALP组织化学染色呈阳性反应。采用钙钴法，如图1a。
213矿化结节染色
成骨细胞具有体外矿化的特征，培养细胞可形成肉眼可见的白色矿化结节， 采用茜素红法染色显示。如图1b。
214骨软骨细胞复合体培养1周后，行扫描电镜观察细胞贴附情况，分别显示软骨细胞、成骨细胞在β-TCP支架上粘附、伸展和增殖良好。如图2a，2b。
22犬股骨髁骨缺损修复的组织学观察
术后12周：Ⅰ组，缺损区形成透明样软骨组织，比周围正常软骨偏厚，软骨细胞数量多，出现明显的规律，表面层的软骨细胞平行关节面排列，深层纵向排列，软骨基质染色较四周淡，软骨下骨丰富。 Ⅱ组，边缘区厚度与周围正常软骨接近，软骨细胞排列不规则，与周围软骨结合可，无明显裂隙存在。近中央区仍以纤维组织修复为主，细胞数很少，局部有裂隙。Ⅲ组 表面为纤维组织，细胞成分较少。
转贴于
术后16周：Ⅰ组，缺损区软骨厚度较正常软骨组织厚，细胞排列规律好，与透明软骨组织相似，软骨下骨形成，潮线基本恢复，与周围正常软骨连接较好，如图3a；Ⅱ组，边缘修复区较正常软骨组织薄，软骨细胞排列不规则，中央区以纤维修复为主，如图3b；Ⅲ组，缺损区内主要为纤维组织，如图3c。
23组织学评分结果比较
软骨缺损修复的组织学评分标准见表2，12周、16周后各组软骨修复组织学评分结果如表3，说明Ⅰ组组织学评分明显优于Ⅱ组和Ⅲ组，表现在细胞数量多，软骨组织生长快，基质丰富，表面光滑，与周围正常软骨组织整合好。
表2关节软骨缺损修复的组织学评分标准分值 细胞形态基质染（着色度）表面修复情况(占修复表面的面积)软骨厚度（与周围正常软骨比较）与周围宿主的整合度0透明软骨正常（与周围宿主正常软骨比较）光滑（＞3/4）＞2/3两侧均有界限1大部分为透明软骨轻度减退中度光滑(＞1/2-3/4)1/3-2/3一侧无界限2大部分为纤维软骨明显减退不规整（1/4-1/2） ＜1/3两侧均无界限3仅有少量软骨无染色＜1/4－－4无软骨－－－－表3各组软骨修复组织组织学评分结果组别标本数时间12周末16周末Ⅰ565±03542±012Ⅱ598±04175±023Ⅲ5132±026105±042表明：各时间段Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅲ组比较均有显著性差异，P＜005
3讨论
关节软骨损伤难以自身修复，曾经采用过的治疗方法［2］，包括关节灌洗术和关节清理术、骨髓刺激技术（磨削关节成形术、软骨下骨钻孔术、微骨折术）、自体或异体软骨膜和骨膜移植等，但是，以上方法疗效都很有限，修复组织也多以纤维软骨为主，缺乏正常透明软骨的力学性能及耐用性，并且经常发生并发症［3］，组织工程学的发展有望解决这一难题。图1a 成骨细胞碱性磷酸酶染色（钙钴法）显示犬成骨细胞胞质内灰黑色颗粒或块状沉淀（200×）
图1b矿化结节茜素红染色，显示不同形态矿化结节（40×）图2a 软骨细胞－支架复合体扫描电镜（100×）图2b成骨细胞－支架复合体扫描电镜（ 100×）图3aⅠ组缺损区软骨下骨结合紧密，潮线形成，与周围软骨组织融合好图3bⅡ组缺损由纤维组织修复，细胞排列规律，与软骨下骨结合尚可，局部有裂隙图3cⅢ组缺损部分由纤维组织修复，排列杂乱，见分泌基质31种子细胞的选择
种子细胞的获取是组织工程技术构建软骨的基础。理想的种子细胞应具备以下特点：（1）取材方便，对供体损伤小，来源充足；（2）体外培养增殖能力强，能持续保持细胞表型不变；（3）植入人体后能适应受区环境，并保持或恢复原有细胞的功能。目前，最常用的种子细胞有间充质干细胞 (MSCs)、胚胎干细胞 (ESCs) 和自体软骨细胞。
MSCs在适宜的条件下分化成骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪、骨髓基质等，具有典型的干细胞特点，终身存在于骨髓和其他组织器官中，负责组织的修复和更新［4］。MSCs可从患者自体骨髓穿刺获得，操作简单，并发症少，可避免产生免疫排斥反应，其传代增殖能力很强，多次传代仍可保持良好的增殖分化活性，在体外培养过程中始终保持多向分化潜能，但体内含量少，因此在植入人体前需体外培养扩增。ESCs也具有多向分化潜能，经定向诱导和分化，可获得无免疫排斥性的软骨细胞，但是，使用ESCs 作为种子细胞存在着伦理学问题，并且，种植于体内可形成包含三个胚层的细胞畸胎瘤，所以如何有效控制ESCs 向特定类型细胞分化有待进一步研究。自体软骨细胞可由骨关节软骨、肋软骨、骺板软骨等软骨组织分离培养获得，在严格的三维条件下培养，自体软骨细胞可以维持表型稳定达8个月之久，数量可以扩增2 000倍以上，但自体软骨细胞常规培养传代和增殖能力有限，在体外培养过程中易发生去分化现象［5］，且其活性随着患者年龄的增长而明显下降，蛋白多糖分泌减少，丧失成软骨能力。自体软骨细胞来源有限，且难以用少量的自体软骨细胞经体外培养而获得大量具有正常功能的软骨细胞，这一缺点大大限制了自体软骨细胞在关节软骨缺损修复中的临床应用。
32细胞因子的作用
大量研究证实生长因子如转化生长因子-β1(TGF-β1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、骨形态发生蛋白（BMP）、胰岛素样生长因子（IGFs）等对软骨细胞的增殖、代谢及干细胞向软骨细胞分化过程中发挥重要的作用［6］。TGF-β1和IGFs均可促进软骨细胞的增殖、分化和软骨基质的合成；bFGF对多种属细胞有促进有丝分裂的作用，能促进软骨细胞增殖并促使其分化，促进软骨基质合成，使修复组织更厚，并含有更多的蛋白多糖和Ⅱ型胶原；BMP可促进软骨细胞合成基质，改善软骨的修复；细胞介素（IL）-10等细胞因子也对软骨细胞的增殖代谢有保护作用［7］。
33合适的生物支架材料
寻找新型细胞支架材料目前已经成为软骨组织工程研究的热点之一。当前，在组织工程中可作为细胞培养支架的生物支架材料主要分为两类，即天然生物支架材料和人工合成的支架材料。天然生物支架材料具有细胞信号识别，促进细胞的黏附、增殖和分化良好的生物相容性及良好的生物降解性等优点［8］；人工合成的支架材料可大规模生产，且其生物学和力学特性可根据需要进行改变。其中可降解的人工合成支架材料的生物学特征类似胶原，其多孔结构可以方便种子细胞的长入，且其降解性避免了取出移植物的手术损伤。生长因子和其他一些药性刺激因子同样可以涂于支架上面以刺激细胞增殖和分化。
在本实验中作者选用的材料是β－TCP多孔陶瓷，该材料具有良好的生物相容性和生物降解性，机械强度高，孔径大小适合细胞长入，体内完全降解时间为4个月左右。以该材料为支架接种软骨细胞和成骨细胞，体外构造骨软骨复合体，在体内成功地培养出具有三维立体形态及组织学特征良好的新生软骨组织，表明β-TCP多孔陶瓷是软骨细胞和成骨细胞较为适宜的载体材料，其微结构适宜新生软骨的形成。
研究结果表明，MSCs适合成为软骨组织工程的种子细胞，β-TCP支架是理想的软骨组织工程支架材料。MSCs经向软骨细胞、成骨细胞定向分化后复合β-TCP 支架材料，在体内构建骨软骨复合体，可以有效修复骨软骨缺损。相信通过上述研究的不断完善和深入，将能够使这种新型生物性人工软骨广泛用于人体各种软骨组织缺损的修复治疗中。
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关节软骨的生物力学特性范文5
自从1965年chestman和Smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来 ［1］，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。 实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨［2］。虽 然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所 表现出的生物学特性也有差别。软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持 表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其 细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。软骨细胞的生长密度对其 生长也至关重要。在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分 裂经过和形态功能完全不同。组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分 泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌 或旁分泌信号的方式而存活。
1 细胞因子对体外培养软骨细胞的影响
软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外 大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益 深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培 养研究又提出了一个新方向。近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化 等的影响研究也较多。也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细 胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。目前认为促进软骨细胞增殖和基 质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF，FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL- 1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下 ：
1.1 转化生长因子beta(TGF-β)
TGF-β最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。T GF-β可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞。现已实验证明TGF-βs具有促进软骨细胞增 殖、调节其分化和胞外基质合成的能力［3］。F.Redni等实验证明培养兔关 节软骨细胞表达了不同的TGFβ受体且与软骨细胞生长周期功能有关，软骨细胞在S期表现了 低亲和力受体表型(kd=appiox 1100pm)然而GO/G期的软骨细胞表现了高亲和力受体。因此 ， TGF-β对软骨细胞的作用有多种受体参与。同时也有实验证明TGF-β更多的结合在GO/G1 期比S期的同步化软骨细胞，从而说明TGF-βs对软骨细胞的作用是通过 不同的途径［ 4］。也有学者证明TGF-βs在不同的条件下对成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重 作用，1-10ng/ml浓度的TGF-β可诱导大鼠胚胎肌细胞分化成软骨细胞，合成特异性的Ⅱ型 胶原和蛋白多糖，而在0.4mol/L浓度下，TGF-β可诱导大鼠颅骨成骨细胞的碱性磷酸酶 活 性，减少软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖的合成［5］。同时也有实验证明TGF-β可 抑制培养兔关节软骨细胞的终末分化及钙化。TGF-β可能与多种因素如胞外基质和其它分 化调控生长因子参与对细胞的调节作用［6］。TGF-β在细胞对其它各种分化信号 的应答过程中同样也有调节作用。Wen-Ning Qi等实验证明Ⅱ型胶原能特异的调节TGF- β刺激软骨细胞合成Ⅱ型前胶原DNA和蛋白多糖，同时说明Ⅱ型胶原在TGF-β存在的条件下 调节软骨细胞特异性基因表达具有剂量依赖性(量效关系)。因此Ⅱ型胶原基因表达的变化在 TGF存在条件下受Ⅱ型胶原的调控［7，8］。
体外实验证明，许多细胞因子对软骨细胞有协同或拮抗作用如TGF-βs、IGFs、FGF、BMP、 IL-1等，兔关节软骨细胞体外培养时，TGF-β对IGF的分泌作用有三种，(1)减少41KD的IG FBP；(2)增加IGF受体的结合位点；(3)下调了诱导型IGF-1受体的自身磷酸化［9］ ，从而促进软骨细胞的增殖和特异性基质的合成。也有学者认为TGF-β和IGF可以使反分化 的软骨细胞再分化诱导和持久表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖［10］。软骨细胞在传代培 养中表型的变化可能与软骨细胞自分泌IL-1有关，而TGFβ可作为一种IL-1的拮抗剂，减 少了IL-1对胞外基质的分解代谢同时也下调了IL-1受体及其金属蛋白酶的表达［1 1］。TGFβ可能通过以下两种途径拮抗IL-1的作用，(1)刺激成软骨细胞中蛋白糖抑制 剂的产生。(2)抑制软骨细胞蛋白酶的产生，因而对细胞外基质的合成有促进作用［1 2］。
1.2 骨形态发生蛋白(BMP)
BMP是TGFβ的超家族成员之一，BMP-7(OP-1)是BMP家族中的一员，其对无血清培养的高密 度单层细胞和悬浮在琼脂糖中的细胞有促进生长和成熟作用，可增加其碱性磷酸酶活性和提 高mRNA和Ⅱ型胶原的合成能力。实验rhBMP(OP-1)能有效促进胚胎和成人关节软骨细胞合成 蛋白多糖和Ⅱ型胶原而Ⅰ、Ⅲ型胶原没有增加。也有实验证明OP-1对人软骨细胞特异性胶 原、蛋白多糖的促合成作用比IGF-Ⅰ、TGF-β和激活素更显著［13］。在培养软 骨细胞生长周期的不同时期，BMP的作用也不同，rhBMP调节软骨细胞增殖、分化作用依赖于 细胞的成熟状态，且静止区软骨细胞更敏感，同时对软骨细胞的自分泌也有作用［14 ］。关节软骨细胞原代培养时表达了BMP-4功能性受体。1998年Rach1，venena等实 验证明BMP2和维生素C共同作用下培养的软骨细胞没有诱导其肥大，同时BMP-2独自干预下 细胞凋亡明显少于维生素C的干预，从而说明软骨细胞向肥大软骨细胞的过度与细胞增殖数 量减少而相对高的凋亡水平有关。软骨细胞体外传代培养渐反分化为成纤维样细胞或过度为 肥大软骨细胞与细胞生存的微环境有关［15］。
1.3 胰岛素样生长因子(IGFs)
IGF于1953年由salmon和Danghaday研究表明，IGFs家族由两种相关多肽组成即IGF-Ⅰ和IGF -Ⅱ。在软骨细胞表面有IGF的受体且软骨细胞能合成和分泌这种多肽。IGF-Ⅰ能与软骨细 胞膜上的受体结合也以旁分泌和自分泌的方式起作用。IGF-Ⅰ能强烈刺激软骨细胞合成Ⅱ 型胶原和蛋白多糖，IGF-Ⅰ还能刺激软骨细胞集落形成和细胞增殖，体内IGF-Ⅰ能促进骨 骺软骨生长。而IGF-Ⅱ能刺激软骨细胞DNA和RNA的合成且比IGF-Ⅰ更有效的刺激胚胎细 胞的生长。但IGF-Ⅰ对成年软骨细胞的作用强于IGF-Ⅱ，也能促进蛋白多糖的合成。软骨 细胞表面的IGF-Ⅱ的受体与IGF-Ⅰ相比，两者的结构与体外活性相似，但体内生物效应不 同。而IGF结合蛋白(IGF1BPs)它通过特异性结合IGFs而起作用，尽管目前对IGFBPs的生理功 能还不十分清楚，但它们对IGFs的调节作用是肯定的，它们通过结合IGFs减少了IGFs与其受 体的相互作用，从而降低了IGFs的活性。onley等人实验表明细胞因子可以调节IGFBPs的产 生，IGFBPs反过来调节IGF的作用，同时表明IL-1α、TNF-α降低细胞对IGF-Ⅰ的反应 性可能是通过增加IGFBPs而起作用。
1.4 成纤维细胞生长因子(FGFs)
FGFs最初是从牛脑垂体分离出来的一种蛋白质，后来发现它在人体组织包括骨、软骨基质中 广泛存在，且对胚胎发育及软骨修复起重要作用。体外实验发现它能促进软骨细胞的增殖、 成熟和胞外基质的合成，而bFGF是一种强大的软骨细胞有丝分裂原，它能刺激生长板中软骨 细胞蛋白多糖的合成。在成人关节软骨中它与IGF有协同作用，两者协同刺激软骨细胞有丝 分裂和蛋白多糖的合成，抑制软骨细胞分化为肥大表型。
1.5 白介素和肿瘤坏死因子(IL、TNF)
近来报道IL-1对关节软骨细胞代谢的干预作用主要表现为抑制透明软骨特征性Ⅱ、Ⅳ型胶 原的合成，而促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成使软骨细胞变性，抑制软骨细胞增殖和蛋白多糖的合 成同时IL-1对关节软骨的降解作用主要表现在促进软骨细胞合成和分泌金属蛋白酶，并提 高软骨基质中溶解蛋白分子酶类的活性。TNF是通过IL-1而抑制Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成 ，但其作用远弱于IL-1。
2 力学刺激对培养软骨细胞的影响
关节软骨主要由软骨细胞和胞外基质组成，而胞外基质主要包括胶原和蛋白多糖，其中Ⅱ型 胶原占胶原的95%，聚合素是蛋白多糖的主要成分，关节运动时软骨经历循环应力载荷而发 生周期性变形和恢复，循环载荷是软骨细胞执行正常功能和维持胞外基质正常表型的基本因 素。而体外培养软骨细胞其随传代次数增加而发生代谢、表型的变化伴有Ⅱ、Ⅳ型胶原合成 减少，Ⅰ、Ⅲ型胶原合成增加和蛋白多糖分子量的改变，为维持体外培养软骨细胞的正常形 态和功能则许多学者进行了软骨细胞培养的力学刺激实验研究。这种压力可分为两种：一种 是持续静压力，一种是循环动压力，力学刺激对调控软骨代谢和维持其胞外基质正常表型起 重要作用，其中静压力刺激减少了Ⅱ胶原和蛋白多糖的合成，而正常动压力刺激则促进Ⅱ型 胶 原和蛋白多糖的合成［16，17］，K.Koarninnta［18］实验表明持 续高流体静压力抑制蛋白多糖的合成和分泌，减少了聚合素mRNA的表达，改变了高尔基氏器 的形态和抑制微丝的组成。在循环压力作用下软骨组织内4种物理特性发生变化；①静水压 ；②毛细液流；③流能；④组织与细胞变形。低频循环压力促进基质降解而高频循环压力则 促进软骨细胞合成代谢。所以力学刺激是软骨细胞的一个重要调节者，但软骨细胞又如何接 受力学刺激信号呢自从认识软骨细胞可以分泌整合素以来，整合素就在软骨细胞与胞外基 质信号转导方面起着重要作用。整合素是一种异二聚体(α、β)转膜糖蛋白特异性受体，力 学刺激使胞外基质与整合素结合同时与细胞骨架相连，从而影响着基因表达和调控细胞生长 和分化［19，20］。力学刺激促进胶原合成增加同时整合素合成也上调，力学刺激 增加了α2整事素亚单位mRNA表达。实验表明在软骨细胞培养一周后，给予循环压力刺激 15次/min，结果3h后，循环压力促进了Ⅱ型胶原和聚合素mRNA的表达，从而说明胞外基 质 调节整合素来应答力学刺激。α2 β1整合素是Ⅱ型胶原受体。软骨基质受体作为一 种 应力感受器在软骨基质网络中通过力学刺激信号来调控软骨细胞。周期性力学刺激促进基质 合成，而静压力则促进基质合成减少［21，22］，所以力学刺激信号可能通过力学 刺激、细胞外基质、整合素、细胞骨架(肌动蛋白)而调控软骨细胞的增殖和分化功能。Taka haki-k［23］等实验证鞒咚降木菜褂盏糏L－6和TNF-α mRNA表达增加 而缩减了蛋白多糖核心蛋白的表达，生理水平的静水压则增加了蛋白多糖核心蛋白的表达， 组织与细胞变形可兴奋ECM受体［24］细胞膜张力受体、细胞网架结构［25 ］而促进合成功能，总之，机构压力对培养软骨细胞的作用在有效范围内与压力值无关， 而与压缩程度(静压力)和频率(循环压力)有关，持续的静压力抑制软骨细胞的合成代谢，一 定频率的循环压力则促进软骨细胞的合成功能［26］。转贴于
3 其它因素对培养软骨细胞的影响
体外培养软骨细胞随其传代而表型整个发生改变，正常的Ⅱ、Ⅳ型胶原合成减少，Ⅰ、Ⅲ 型胶原合成增加，在不同的培养条件下(如培养基、PH细胞的接种密度、血清浓度、氧分压 及其培养基的离子浓度、培养方式)其表型不同，有时可以反分化或向肥大软骨细胞转化。 体外培养只有保持其正常形态才能保持其正常功能。Freed［27］等将软骨细胞移 植于DGA、PLA进行三维体外培养，证明三维培养6周后其细胞数扩增了近8.3倍，且传代后细 胞产生蛋白多糖和Ⅱ型胶原的能力较佳，所以软骨细胞三维培养有利于维持其形状，常利用 胶原纤维蛋白、琼脂、海澡酸盐、PGA、PLA等为附属物进行三维培养。也有学者认为无血清 培养可以阻止软骨细胞反分化。培养基PH值轻度偏碱不利于蛋白多糖的合成，偏酸则相反。 低钙环境有利于软骨细胞的稳定［28］。1995年Baragi［29］等将IL - Rα和标记基因LacZ分别构建在腺病毒上转染软骨细胞并将它们分别与骨关节炎软骨组织块 一起培养，结果表明与IL-1Rα转染软骨细胞培养的组织块能抵制IL-1β的作用而与LacZ 细胞培养的软骨细胞块抵制作用明显减弱，从而说明基因转染可以用来调控软骨细胞从而维 持其表型。
4 结束语
体外培养软骨细胞的优点是可以大量扩增及研究其生命活动的状况，但要维持其正常表型则 受到众多复杂因素的调控。就其细胞因子而言，细胞因子对体外培养软骨细胞的作用非单一 的，而是一个复杂的网络调节作用，如生长因子的生物学活性是由受体介导的，生长因子在 软骨细胞合成分泌后，多为无活性的前体分子需要经过特异性的激活才能发挥作用。生长因 子之间存在基因表达及其活性的相互调控TGF-β能促进PDGF的A链和B链的mRNA表达和分泌 ［30］。bFGF能促进TGF-β mRNA的表达，诱导间充质细胞分化成软骨细胞，增强 TGF对软骨细胞的增殖及其基质合成作用。生长因子之间还存在受体水平的调控，胰岛素不 影响TGF-Ⅱ型受体的亲和力但增加了Ⅱ型受体的数目引起受体上调效应，从而Ⅱ型受体与 Ⅰ型受体竞争，使胰岛素与Ⅰ型受体结合减少。IL-1可使TNF受体下调，而IFN-γ却使TNF 受体上调等。但是网络生长因子如何调控体外培养软骨细胞的增殖、分化阻滞反分化或向肥 大型转化、维持其正常软骨细胞表型及合成特异性胞外基质还需进一步的研究。总之软骨细 胞体外培养维持其正常表型则受到众多因素的影响如培养条件及其方式，细胞的微环境，PH 值、细胞密度、力学变化、生长因子等等。随着细胞生物学和分子生物学的发展，软骨细胞 体外培养大量扩增、分化维持其正常的表型及代谢的调控因素会渐为人们所明晰，为组织工 程化软骨修复软骨缺损、体外培养软骨细胞建立软骨细胞库(永生化软骨细胞)及揭示退变性 骨关节病又开拓了一条新的途径。
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关节软骨的生物力学特性范文6
膝关节骨性关节病（Knee Osteoarthritis）简称膝OA，又称膝关节骨性关节炎，是骨科常见病、多发病。本病以中老年人居多，据流行病学报道［1］，在美国50 岁以上的人群中，骨关节炎的发病率居全部病种中的第2 位。在美国65 岁以上有影像学异常的人群中，骨关节炎发病率约为70%，其中膝关节的发病率居第3位，且女性的发病率高于男性。该病最主要的临床表现为膝关节疼痛，尤以上下楼及蹲下站起时为著，部分患者膝关节反复肿胀，活动时有弹响，若日久失治可出现膝关节内翻或外翻畸形，最终导致膝关节功能丧失。
王平主任医师从事临床科研工作近20 年，特别是对膝关节疾病颇有造诣。对于本病的治疗，王师认为首先应明确诊断，然后根据病人病情所处阶段，分期论治。在治疗时，王师特别强调应筋骨并重、关节内外同治，此外，王师还指出，本病宜早诊断，早治疗。笔者有幸师从王师，得其悉心教诲，受益匪浅。现将王师治疗中早期膝OA经验与特色总结如下。
1 病因病机
膝OA的病因病机十分复杂，传统医学认为该病属中医“骨痹”范畴。王师认为本病的病因病机从中医角度上讲：人至中年，肝肾渐亏，气血渐虚，筋骨失养，不荣则痛，此属内因；膝关节长期劳损，加之跌仆扭伤，气滞血淤，风寒湿邪趁机侵袭，留滞经络，导致气血运行不畅，不通则痛，此为外因。内外因素共同作用发为本病。
现代医学认为本病的发生与年龄、性别、体重、种族、气候等因素有关，其病理改变与骨内压升高、氧自由基和一氧化氮、自身免疫反应、细胞因子和生长因子等有关。一般认为［2］，OA是力学和生物学因素的共同作用下，软骨细胞、软骨细胞外基质及软骨下骨3者降解和合成失衡的结果。从现代医学角度分析：王师认为该病病理改变虽以关节内的软骨退变为主，但关节外的肌肉、韧带、肌腱因素也不可忽视，这些膝关节周围的软组织是维持膝关节生物力学稳定及平衡的重要因素。由于各种原因导致这平衡遭到破坏，是本病发生的重要因素，如股四头肌与其拮抗肌群发生病变，导致膝关节失稳，生物力学发生改变，关节软骨局部承受的压力过大，易致软骨损伤；同时，软骨的退变也容易造成关节周围软组织的病变，形成恶性循环，加快本病进程，故王师认为关节内外因素共同作用发为本病。
2 治疗
2.1 诊断与鉴别诊断 王师认为诊断是治疗的前提，只有在诊断明确的基础上才能采取有效的治疗手段。王师诊断膝OA的标准是参照2003 年中华医学会风湿病学会起草的《骨关节炎诊治指南（草案）》［3］推荐的诊断标准。由于导致膝关节疼痛的疾病很多，王师强调还要注意鉴别诊断，最常见的与风湿性关节炎、类风湿性关节炎、结核性关节炎、牛皮癣性关节炎、化脓性关节炎等相鉴别。
2.2 筋骨并重、分期论治目前，临床上对膝OA的分级方法主要有X线分级法、MRI分级法、关节镜下分级法等。常用的为Kellgren和LawrenceX线分级法：0级：正常；Ⅰ级：关节间隙可疑变窄，可能有骨赘；Ⅱ级：有明显的骨赘，关节间隙变窄（少于正常关节间隙的1/2）；Ⅲ级：中等量骨赘，关节间隙变窄较明显，有硬化性改变（多于正常关节间隙的1/2）；Ⅳ级：大量骨赘，关节间隙明显变窄，严重硬化性病变及明显畸形。Recht的MRI分级标准：0级正常关节软骨；I级软骨分层结构消失，软骨内出现局限性低信号区，软骨表面光滑；Ⅱ级软骨表面轮廓轻至中度不规则，软骨缺损深度未及全层厚度的50%；Ⅲ级软骨表面轮廓中至重度不规则，软骨缺损深度深达全层厚度的50%以上，但未见完全脱落；Ⅳ级软骨全层缺损、剥脱，软骨下骨质暴露伴或不伴软骨下骨质信号改变。
2.2.1 早期病变关节轻度疼痛，晨僵不超过10 min，伸屈功能可：0～130°，触诊有摩擦感及滑膜肥厚感，X线检查见骨硬化或骨赘，关节间隙仍正常，MRI检查处于0级或Ⅰ级改变。
2.2.2 中期病变关节疼痛或伴肿胀，晨僵不超过20 min，伸屈功能轻度受限：5～110°，触诊有摩擦感及滑膜肥厚感。X线检查见关节间隙狭窄，MRI检查处于II或III级改变。
2.2.3 后期病变关节疼痛、变形，晨僵不超过30 min，伸屈功能严重受限：10～90°，X线检查见关节间隙明显狭窄，大量骨赘生成，负重面磨损或缺损，MRI检查为IV级表现。
王师根据患者的病情分期，采取筋骨并重的疗法治疗。“筋”指关节周围肌肉、韧带、肌腱、滑膜、关节囊等即现代医学所指的软组织，“骨”即指骨骼及关节软骨。《内经》曰：“诸筋者皆属于节”，说明人体之筋都附着于骨上，大筋联络关节，小筋附于骨外。筋骨并重和现代医学关节内外兼治理论是一致的。
对于早期患者，王师认为其病变虽有关节内的软骨退变，但其引起疼痛的主要原因是膝关节周围的肌肉、肌腱、韧带病变，如鹅足囊损伤，腘窝伤筋等导致膝关节周围软组织的平衡遭到破坏。故其治疗以关节外为主，关节内为辅。具体方法为：①理疗加中药离子导入。其机理是利用热力，使关节周围韧带松弛，局部血流加速。借助离子导入设备将具有通经活络，活血化瘀的中药渗入关节内，以达到“通则不痛”之目的； ②骨伤推拿按摩。其主要手法有按、揉、拿捏、滚、擦、拨法。其机理是通过手法使关节周围肌肉肌腱及韧带粘连得以缓解。促进局部血液循环、淋巴结回流和炎性物质吸收，降低关节内压力，使膝关节肿痛得以缓解；③中药敷贴－消淤止痛膏及活血止痛膏。以上两种膏药均为本院制品，在临床应用多年，疗效显著，其作用是通过较长时间贴附于膝关节皮肤，使药物慢慢渗入皮肤内，而达到活血、消淤、止痛之目的；④中药熏洗。王师以伸筋透骨外洗汤为基本方，根据患者病情辨证加减，其主要作用是舒筋活络、活血化淤，使膝关节经络通利，气血运行通畅，则疼痛自止；⑤中药汤剂口服。王师根据中医辨证将患者主要分为3型而给予不同的方药治疗：气滞血瘀型主要用身痛逐瘀汤加减；寒湿痹阻型以独活寄生汤加减；肝肾亏虚型则以六味地黄丸为基本方加减。此法主要是通过补益肝肾，调理气血而达到内外兼治之目的；⑥针灸疗法。王师主穴选取膝眼、阳陵泉、足三里、梁丘，随证加减血海、丰隆、阴陵泉及阿是穴。其主要功效是通筋活络，消肿止痛。对于早期膝OA患者，王师往往根据病人不同病情采用一种或几种不同疗法综合应用，以期获得最佳效果。王师认为［4］随着基础研究的进一步深入，针对本病某一阶段某一类型，依据辨证论治的原则，专人专方专用，能获得更好疗效。特别是在膝OA早期应用中药配合针刺及手法按摩的综合治疗能够起到事半功倍的效果。
对于中期患者，王师认为关节内的软骨退变已较重，但关节外的因素也不可忽视，故其主张关节内外并重。其对于关节外的治疗主要有中药离子导入，中药敷贴和推拿按摩，其具体操作方法基本同上，但视病人具体情况根据中医辨证，适当调整药物和手法。其对关节内的治疗除了中药汤剂口服以全身调整外，还有膝关节腔注射施沛特，其主要成分是透明质酸钠（HA），HA是人体内6种最重要的糖胺聚糖之一，为粘多糖高分子物质，在膝关节腔里与蛋白结合成的蛋白质复合物游离于关节液中，黏附于关节软骨或滑膜表面，并组成软骨基质。其在关节腔里的生物学功能主要有：润滑和缓冲应力，抑制炎症反应，屏障作用。王师的具体操作是在严格无菌环境中，在局麻下，用注射器直接将HA 2 ml注入关节腔里，如果关节腔内有积液，则先抽出积液后再注入HA，之后稍许活动膝关节，以使HA均匀分布于关节腔内，最后加压包扎。1次/周，5次为1个疗程。对于有关节镜检加清理术适应证的患者，王师主张在微创下清理关节内退变的软骨，增生的滑膜、游离体等，以缓解其引起的继发症状。然而，由于膝关节骨性关节病病因复杂，病人个体的差异，临床报道部分患者术后膝关节仍残留一些疼痛［5］，王师建议患者术后进行系统的康复治疗，以期最大程度恢复膝关节功能。其具体方法有活血化瘀的中药熏洗，补肝肾、强筋骨的中药汤剂口服，骨伤推拿手法及系统的功能锻炼等。
对于后期患者，王师认为关节内的软骨已严重退变，关节面已严重磨损，必须先改善关节内的环境，然后再行关节外的治疗，方能取得较好疗效。如截骨术、人工关节置换术等。
此外，王师还建议患者平时要注意减轻关节负荷，如避免负重，减轻体重等；减少运动量，避免长时间步行、站立、蹲位和爬山运动。最好多卧床休息，但卧床休息时要注意膝关节的功能锻炼，如股四头肌等长收缩练习、蹬踏空车动作等，以增加股四头肌的力量，代偿部分膝关节功能。平时还要注意膝关节的保暖，避免寒凉刺激。
3 典型病例
女，67岁，左膝关节疼痛半年余，加重1周。自诉半年前无明显诱因出现左膝关节疼痛，以上下楼时明显，自贴伤湿止痛膏后有所缓解，未系统治疗。1周前因受凉后疼痛加重，自贴膏药未见好转，遂来王师门诊求治。经查X线片示左膝关节股骨内侧髁及胫骨内侧平台有少量骨赘形成，股髌关节及胫股关节面硬化，髁间嵴变尖，内侧关节间隙较外侧略窄。查体：髌研磨试验(+)，挺髌试验(+)，麦氏征(-)，浮髌试验(-)，鹅足囊有压痛，伸屈功能：0～110°，苔白，脉沉缓。诊断为膝关节骨性关节病。治疗：理疗加中药离子导入、骨伤推拿手法按摩，1次/d，来门诊治疗。予中药敷贴睡觉前贴于膝关节，晨起摘除洗净皮肤，防止过敏。6 d后，症状缓解80%，为巩固疗效，休息1 d后，继续治疗6 d，症状全部消失。
按：患者系老年女性，肝肾已亏，筋骨失养，故平素左膝疼痛。近又感受寒凉，寒邪凝滞经络，导致经气运行不利，发为膝痹。故给予理疗和中药离子导入以祛除寒邪，骨伤推拿手法按摩、中药敷贴以舒筋活络、行气活血。寒邪祛、经络通、气血行则疼痛自止。至于为何不予口服药，系考虑到患者患有心脏疾病，长期口服治疗心脏疾患药物，故不予口服药以免药物过多过杂刺激胃肠道。
参考文献
［1］邱贵兴．骨关节炎流行病学和病因学新进展［J］.继续医学教育，2005，19(7)：69.
［2］陈百成，张静．骨关节炎［M］.北京：人民卫生出版社，2004：1.
［3］中华医学会风湿病学分会．骨关节炎诊治指南(草案)［J］.中华风湿病学杂志，2003，7(11)：703.
［4］王平．中医外治法治疗膝关节骨性关节病的临床概况［J］.天津中医学院学报 ，2005，24(3)：177.
