细胞的生活范例6篇

细胞的生活范文1

【关键词】 CIK细胞；DCCIK细胞；生物学活性；抗淋巴瘤

The biological activity and antitumor effect against　lymphoma cells in DCCIK cells

ABSTRACT: Objective To investigate the proliferation activities， phenotype changes， level of secretory cytokines and antitumor activity against lymphoma cells of DCCIK cells in coculture of cytokineinduced killer (CIK) cells with dendritic cells (DC). Methods DC and CIK were prepared from healthy human peripheral blood mononuclear cells. They were cocultured peripherally. CIK cells were cultured alone as controls. Increased number of cells were counted by tapanblue staining， killing activity was detected by MTT assay， cells phenotypes were analyzed by flow cytometry， secretions of INFγ and IL12 were determined by ELISA. Results The proliferation activity of DCCIK cells was significantly higher than that of CIK cells (P

KEY WORDS: cytokineinduced killer cell; dendritic cellscytokine induced killer cell; biological activity; antilymphoma

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinduced killer cells， CIK)是一种体外增殖能力强、杀瘤活性高及对多重耐药肿瘤细胞较敏感的广谱抗瘤免疫活性细胞[1]。树突状细胞(dendritic cells， DC)是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞，可以在体内、外向T淋巴细胞递呈抗原，并诱发细胞毒T淋巴细胞反应[2]。在本研究中，我们通过多种细胞因子组合从正常人外周血中诱导DC、CIK细胞，并将两者共培养，观察DCCIK细胞体外增殖能力、杀伤活性、免疫表型变化及分泌细胞因子水平，旨在为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 rhIL2、RPMI 1640培养基及四甲偶氮唑盐(MTT)均为Sigma公司产品，培养用CD3McAb由Neomarkers公司提供，rhIL1、rhIFNγ、rhTNFα为上海生物制品研究所产品，rhGMCSF为先灵葆雅公司惠赠，rhIL4购自Gibco BRL公司，流式细胞仪标记抗体CD3、CD3CD4、CD3CD8、CD3CD56及检测细胞因子(IL12、IFNγ)的ELISA试剂盒均购自晶美生物工程有限公司，鼠抗人CD1a、CD14、HLADR和FITC兔抗鼠荧光二抗购自中国医学科学院天津血液学研究所。

1.2 靶细胞来源 Raji为人组织淋巴瘤细胞株，引自上海第二医科大学瑞金医院血液学研究所；新鲜淋巴瘤细胞取自外科手术切除的淋巴瘤标本(淋巴结或脾脏)，去除结缔组织和坏死组织，剪成1mm3的组织块，2.5g/L的胰酶消化后过100钢目，经淋巴细胞分离液分离，获得恶性淋巴瘤细胞(malignant lymphoma cells， MLC)，存于液氮中待用。要求靶细胞比例>95%，活体细胞>90%。

1.3 CIK细胞的培养扩增 采集健康人外周血，肝素抗凝，以FicollHypaque淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞(MNC)，RPMI 1640洗3次，调细胞密度为4×106/mL；贴壁培养1-2h，收集悬浮细胞用含10%(体积分数)小牛血清(FSC)的RPMI 1640液调细胞密度为1×106/mL，第0天加入rhIFNγ1000u/mL，放置37℃，5%(体积分数)CO2孵育箱中培养24h后加入rhIL2300u/mL、rhIL1100u/mL、CD3McAb 50μg/L，继续培养，以后每3d更换新鲜培养液，补加rhIL2。

1.4 DC的体外培养 参照文献方法[3]。获得健康人外周血MNC中的贴壁细胞，用含10%(体积分数)FSC的RPMI 1640培养基培养，其中包含rhGMCSF 550u/mL，rhIL4500u/mL。隔日半量换液，补加细胞因子，收获前72h再加入rhTNFα 50u/mL，诱导DC成熟。

1.5 DCCIK细胞的培养 收获培养第9天的DC细胞及CIK细胞经活细胞计数后按1∶5混合培养，第3天和第6天，收集细胞做生物学活性测定。

1.6 细胞毒活性的测定 以不同效靶比(5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1)，把效应细胞和靶细胞放入96孔板，另设单独靶细胞及效应细胞孔，每孔设3个复孔，置37℃，5%(体积分数)CO2孵育箱中培养48h，按本室建立的MTT法[4]测杀伤活性。杀伤活性(%)=[1-(实验组A-效应组A)/靶细胞A]×100%。

1.7 细胞免疫表型的分析 用流式细胞仪检测CIK及DCCIK细胞的免疫表型；间接免疫荧光法测定DC免疫表型。

1.8 细胞因子的检测 收集培养细胞上清液进行IL12、IFNγ水平测定。采用ELISA双抗夹心法，操作按试剂盒说明。

1.9 统计学处理 数据以±s表示，组间比较采用t检验，以P

2 结果

2.1 增殖能力的观察 CIK细胞培养第6天进入显著增殖期，部分细胞体积明显增大，成丛或集落状悬浮生长。与DC共培养可明显提高CIK细胞增殖速率。培养第15天，经台盼蓝排斥法活细胞计数，CIK细胞总数扩增到原来的(43.57±5.11)倍，而DCCIK细胞为(60.75±4.89)倍，两组差异有统计学意义(P

图1 培养时间与增殖倍数的关系（略）

Fig.1 The relationship between the culture time and proliferation fold

2.2 细胞表型的分析

2.2.1 DC的形态及表型检测 培养第9天的DC 细胞在倒置显微镜下可观察到典型的树状或毛刺状突起。检测细胞表面分子表达，其特异性标志CD1a的阳性率为(80.56±1.72)%，MHCI类分子HLADR的阳性率为(92.06±3.20)%，CD14的表达率为(8.69±1.76)%。表明此种方法可以诱导较高纯度的成熟DC。

2.2.2 DC与CIK细胞共培养后的免疫表型 CIK细胞单独培养，随着培养时间的延长，CD3+CD8+及CD3+CD56+细胞的比例逐渐增加。与DC共培养的CIK细胞CD3+CD8+及CD3+CD56+双阳性细胞的比例明显高于同条件下未共培养组(P

2.3 体外细胞毒性 共培养3d的DCCIK细胞，对Raji细胞株及新鲜MLC的杀伤活性均明显高于单纯CIK细胞(P

表1 CIK和DCCIK细胞免疫表型的变化（略）

Table 1 The phenotype changes of CIK and DCCIK cells

*P

表2 DC CIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤活性（略）

Table 2 Killing activity of DCCIK cells on MLC and cell line Raji

2.4 细胞因子的测定 DC与CIK细胞共培养3d，其上清液中IFNγ、IL12的水平分别为(438.02±213.17)ng/L和(30.65±9.10)ng/L，而同条件下，CIK细胞组IFNγ为(213.96±137.00)ng/L，IL12为(10.10±0.35)ng/L，两组相比，DCCIK细胞分泌IFNγ、IL12的水平显著高于CIK细胞(P

3 讨论

CIK细胞是由多种细胞因子如IL2、IFNγ和CD3单克隆抗体等诱导的一种免疫活性细胞，其兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性与NK细胞的非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀瘤特点[5]。DC摄取、加工、处理抗原，高表达MHCI、MHCⅡ类分子、共刺激分子及黏附分子，在体内外具有激发初次和继发性T细胞免疫应答功能，并能分泌Th1型细胞因子IL12，诱导T细胞和NK细胞产生IFNγ和增强激活NK细胞的细胞毒活性。为此，将具有高效杀瘤活性的CIK细胞和具有强大肿瘤抗原递呈能力的DC共培养，无疑会起到一定的抗肿瘤协同作用。研究发现DC刺激CIK细胞后，细胞毒活性显著增强[6]。本实验显示DC、CIK细胞一起培养后，共培养物DCCIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤作用显著高于同条件下单纯CIK细胞。虽然与文献报道[67]有关DCCIK细胞来源、制备方法、效靶比、效靶细胞作用时间以及靶细胞种类不尽相同，但DCCIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤活性与文献中DCCIK细胞对胰腺癌细胞DANG及CML细胞的杀伤活性强于CIK细胞的结论相同。证实DCCIK细胞确实具有比CIK细胞更强的抗肿瘤活性。CIK细胞属于异质细胞群，其抗肿瘤作用与CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞及分泌细胞因子的水平密切相关。将DC、CIK细胞一起培养后，两者所分泌的细胞因子及表面分子表达发生了变化。研究发现DC与CIK细胞共培养时，DC成熟表面标志CD86、CD80、CD40、HLADR的表达增加[8]。而CD4+CD25+细胞(调节细胞T细胞)和IL10水平下降，对肿瘤细胞的细胞毒活性增强[9]。负载CA199(肿瘤相关抗原)的DC与CIK细胞混合培养24h后IL12的分泌量为CIK细胞单独培养时6.93倍[7]。DC的抗原提呈作用能使CIK细胞分泌IFNγ的时间延长，分泌量增加[10]。我们的实验显示，共培养条件下，DCCIK细胞上清液中IL12、IFNγ分泌量均比同条件下单纯CIK细胞培养分泌高，且CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞比例也比CIK细胞组显著增多。说明DCCIK细胞的高杀伤活性与大量增殖的CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞有关，细胞因子IL12、INFγ对杀伤肿瘤也发挥了直接和间接的重要作用。DC能够激活CIK细胞增殖。与DC共培养14d后CIK细胞的增殖倍数比共培养7d时高出两倍左右[7]。本研究结果表明，共培养DCCIK细胞不仅具有很强的杀瘤活性，且比同源CIK细胞具有更强的增殖速率，共培养6d，DCCIK细胞总数比单独培养CIK细胞总数多扩增了17倍。说明利用共培养条件可提高CIK细胞的增殖能力，获得大量高效的免疫细胞，这对于肿瘤临床具有重要意义。本研究初步证实，DCCIK细胞增殖活性、抗淋巴瘤作用均高于单纯CIK细胞，这为其临床应用治疗或辅助治疗淋巴瘤提供了实验和理论依据。

基金项目：陕西省“三五人才工程”专项基金资助项目

【参考文献】

[1]Yamaguchi Y， Ohshita A， Kawabuchi Y， et al. Adoptive immunotherapy of cancer using activated autologous lymphocytescurrent status and new strategies [J]. Hum Cell， 2003， 16(4):183189.

[2]周昌菊，马薇，周建大，等. 自体宫颈癌树突细胞疫苗激活的CTL杀伤效应 [J]. 癌症杂志， 2006， 25(2):143147.

[3]Motta MR， Castellani S， Rizzi S， et al. Generation of dendritic cells from CD14+ monocytes positively selected by immunomagnetic adsorption for multiple myeloma patients enrolled in a clinical trial of antiidiotype vaccination [J]. Br J Haematol， 2003，121(2):240250.

[4]魏绪仓，邢佩霓，赵文理，等.人脐血CD3AK细胞生物学活性及抗瘤作用的实验研究 [J]. 西安交通大学学报(医学版)， 2005， 26(1):5285.

[5]Wang FS， Lin MX， Zhang B， et al. Antitumor activities of human autologous cytokine induced killer (CIK) cells against hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo [J]. World J Gastroenterol， 2002， 8(3):464468.

[6]Linn YC， Hui KM. Cytokineinduced killer cells: NKlike T cells with cytotolytic specificity against leukemia [J]. Leuk Lymphoma， 2003， 44(9):14571462.

[7]Marten A， Schottker B， Ziske C， et al. Increase of the immunostimulatory effect of dendritic cells by pulsing with CA199 protein [J]. J Immunother， 2000， 23(4):464472.

[8]Hackstein H， Thomson AW. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs [J]. Nat Rev Immunol， 2004， 4(1):2434.

细胞的生活范文2

一本章的主要内容和特点

本章是在学生初中阶段初步学习过细胞的知识，以及在前一章学习了关于生命的物质基础知识的基础上，进一步学习高中阶段的关于细胞的知识。生物体的一切生命活动，主要是在细胞内进行的。因此，高中阶段有必要从细胞是生命活动的基本单位的高度，进一步讲述真核细胞的亚显微结构和主要功能的知识，以及有关细胞增殖、分化、癌变和衰老的知识。

本章包括三节教材：第一节《细胞的结构和功能》；第二节《细胞增殖》；第三节《细胞的分化、癌变和衰老》。第一节《细胞的结构和功能》内容很丰富，共分三小节：第一小节《细胞膜的结构和功能》，本小节内容以及章的引言和第一节的引言，共需用3课时教学；第二小节《细胞质的结构和功能》，需用2课时教学；第三小节《细胞核的结构和功能》，共需用2课时教学。第二节《细胞增殖》，需用1课时教学。第三节《细胞的分化、癌变和衰老》，需用1课时教学。此外，本章有两个学生实验。

第一节《细胞的结构和功能》，在分成小节讲述之前，用了几小段文字和一些图表，先介绍了几点有关的内容：观察细胞内部的精细结构，必须应用电子显微镜或其他更为精密的仪器；细胞的种类繁多，大小、形状各不相同，功能也不相同；细胞可分为原核细胞和真核细胞两大类，绝大多数生物是由真核细胞构成的；细胞虽然微小，但是有非常精细的结构和复杂的自控能力，这些是细胞能够进行各种生命活动的基础。真核细胞比原核细胞复杂得多，因此，首先学习关于真核细胞的结构和功能的知识。

第一节的第一小节《细胞膜的结构和功能》，主要讲述细胞膜的分子结构和细胞膜的主要功能两方面的内容。第一方面，关于细胞膜的分子结构，明确提出细胞膜是一层由磷脂和蛋白质构成的膜。在细胞膜的中间是磷脂双分子层，这是细胞膜的基本支架；有的蛋白质分子排布在磷脂双分子层的表层；有的蛋白质分子部分嵌插或贯穿在整个磷脂双分子层中。构成细胞膜的磷脂分子和蛋白质分子大都是可以流动的，这种特点对于细胞膜完成各种生理功能非常重要。再有，在细胞膜的外表有一层糖蛋白，叫做糖被，它在细胞生命活动中有重要功能。第二方面，关于细胞膜的主要功能，主要讲述细胞膜与周围环境进行物质交换的功能，而对细胞膜的其他多种功能不可能都加以介绍。由于细胞膜与周围环境进行物质交换的内容比较复杂，学生在学习上有一定难度，因此教材本着化繁为简、深入浅出的精神，主要讲述了自由扩散方式和主动运输方式，略去了其他运输方式。教材强调指出，自由扩散是被动运输的方式；主动运输方式的特点是必须有载体蛋白质的协助，需要消耗细胞内新陈代谢所释放的能量。主动运输能够保证活细胞按照生命活动的需要，主动地选择吸收所需要的营养物质。接着，在讲了上述两种运输方式的基础上，明确指出细胞膜的通透性特点：细胞膜是一种选择透过性膜。

第一节的第二小节《细胞质的结构和功能》，主要讲述细胞质基质和细胞器两方面的内容。第一方面，关于细胞质基质的内容有：细胞质基质中含有多种无机的和有机的化合物；细胞质基质是活细胞进行新陈代谢的主要场所；在细胞质基质中存在着多种细胞器。第二方面，关于细胞器的内容，占了本节的大部分篇幅，重点讲了线粒体和叶绿体这两种细胞器，主要说明这两种细胞器在动植物体中存在的部位、在细胞内的分布、基本结构和主要功能，这些知识是学习后面有关章节必备的基础知识。此外，还简要讲述了内质网、核糖体、高尔基体、中心体和液泡这5种细胞器。本节教材最后强调指出，在活细胞完成各种生命活动的过程中，细胞质基质和细胞器是相互协调的，各种细胞器之间也是密切联系的。，全国公务员共同天地

第一节的第三小节《细胞核的结构和功能》，主要讲述细胞核的结构、细胞核的主要功能、原核细胞的基本结构三点内容。第一点，关于细胞核的结构，简要介绍了核膜、核仁和染色质的知识。第二点，关于细胞核的主要功能，强调了细胞核是遗传物质储存和复制的主要场所，是细胞遗传特性和细胞代谢活动的控制中心，因此它是细胞结构中最主要的部分。第三点，关于原核细胞的基本结构，很简要地介绍了原核细胞在大小、细胞壁、细胞膜、细胞质、拟核这几个方面与真核细胞不同的特点，并且强调指出原核细胞最主要的特点是没有由核膜包围的细胞核。

第二节《细胞增殖》，在节的引言中指出细胞增殖是生物体的重要基本特征，细胞以分裂的方式进行增殖；细胞分裂是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础；真核细胞的分裂方式有有丝分裂、无丝分裂和减数分裂三种方式。本节教材主要讲述两方面内容：一方面，以大部分的篇幅讲述真核细胞的有丝分裂方式；另一方面，简要介绍真核细胞无丝分裂方式的特点。

关于有丝分裂的内容，主要有三点。在讲述这三点内容之前，先明确指出有丝分裂方式是真核细胞进行细胞分裂的主要方式，多细胞生物体以有丝分裂的方式增加体细胞的数量，体细胞进行有丝分裂是有周期性的。接着，讲述第一点内容，即细胞周期，主要讲述了细胞周期的概念、细胞周期包括分裂间期和分裂期两个阶段、这两个阶段所占时间的长短。第二点内容，讲述细胞分裂间期，强调指出这个时期是新细胞周期的开始，最大的特点是完成了DNA分子的复制和有关蛋白质的合成，为紧接着的细胞分裂期准备了条件，因此，细胞分裂间期是细胞周期中极为关键的准备阶段。第三点内容，讲述细胞分裂期，明确指出这个时期的特点主要是细胞核明显地发生着染色体的有规律的连续变化。为了研究的方便，分裂期又分为前期、中期、后期、末期。本节教材以较多的篇幅，着重讲述了分裂期各个时期细胞核内染色体的变化特点。在讲述了有丝分裂上述知识的基础上，最后指出有丝分裂的重要意义：将亲代细胞的染色体经过复制以后，精确地平均分配到两个子细胞中去；由于染色体上有遗传物质，因此使生物的亲代和子代之间保持了遗传性状的稳定性。

关于无丝分裂方式，简要介绍了这种分裂方式的过程，以及因为在分裂过程中没有出现纺锤丝和染色体，所以叫做无丝分裂。

关于减数分裂方式，仅仅指出这种分裂方式是一种特殊方式的有丝分裂，与有性生殖细胞的形成有关，具体的分裂过程留待后面的有关章节讲述。

第三节《细胞的分化、癌变和衰老》，主要讲述了三方面的内容。关于细胞的分化，主要内容有：首先，明确指出细胞分化是生物界中普遍存在的一种生命现象，仅有细胞的增殖，而没有细胞的分化，生物体是不能正常发育的。接着，讲述了细胞分化的概念，并且说明细胞分化是在生物体整个生命进程中的一种持久性变化，但是在胚胎时期达到最大的限度。再有，提出多细胞生物必须经过细胞分化，体内才会形成多种不同的细胞和组织。最后，说明高度分化的植物细胞仍然保持着细胞的全能性。

关于细胞的癌变，之所以放在本节教材的第二部分来讲，是因为细胞的畸形分化与癌细胞的产生有直接关系，与细胞分化的知识有密切联系。细胞癌变的主要内容有：首先，提出癌细胞有一些独具的特征，教材中只介绍了癌细胞能够无限增殖、形态结构发生了变化、表面也发生了变化等特征。其次，讲述了导致细胞癌变的三大类致癌因子，即物理致癌因子、化学致癌因子和病毒致癌因子，同时也提出了致癌基因。最后，简要讲述了从多方面来预防细胞发生癌变。

关于细胞的衰老，首先说明细胞的衰老和死亡也是一种常见的生命现象。接着，进一步说明衰老的过程是细胞内生理和生化发生变化的过程，最终反映在细胞的形态、结构和功能上发生了变化，因而具有细胞衰老的共同特征，教材中提出了5种衰老的特征。最后指出，至今还没有一种假说能够完全揭示细胞衰老的原因。目前的科研工作表明，细胞衰老可能是多种内因和外因共同作用的结果。

二本章与其他章的联系

1.关于细胞膜的分子结构特点和功能的知识，对于后面学习《生物的新陈代谢》，讲述物质出入细胞、物质代谢等内容，是重要的基础知识。

2.关于细胞器的知识，与讲述物质代谢和能量代谢有直接关系。例如，叶绿体的结构和功能与光合作用关系密切，线粒体的结构和功能与有氧呼吸关系密切。

3.关于有丝分裂的知识，对于后面学习《生物的生殖和发育》一章中关于减数分裂的知识，是重要的基础。

细胞的生活范文3

【关键词】  朊蛋白;小胶质细胞;白细胞介素6

【摘要】  目的 探讨prp105132作用下体外小胶质细胞的活化及对il6产生的影响。方法 体外培养大鼠神经胶质细胞，用不同剂量prp105132(0、20、40、80 μmol/l)干预小胶质细胞，elisa法检测24 h后细胞上清液中il6含量。结果 朊蛋白肽段干预后小胶质细胞活化，胞体增大，细胞突起变短、消失，呈圆状、杆状、阿米巴状;并且随prp105132剂量的增加，il6分泌量增多(p<0.01)。结论 prp能够诱导体外小胶质细胞分泌il6，并且具有剂量依赖关系。

【关键词】  朊蛋白;小胶质细胞;白细胞介素6

【abstract】 objective to investigate the microglia secret il6 in the condition of prp105132. methods rat microglia culture was exposed to prp105132(0, 20, 40, 80 μmol/l) in vitro. the il6 level in cell supernatant was measured by commercial enzyme immunoassay (elisa) after 24 h. results microglia were activated in the condition of prp peptide. a dosedependent increase in il6 secretion by the prp105132 exposed rat microglia was obtained. conclusions prp may induce microglia secret il6.

【key words】 prion; microglia; interleukin6

朊蛋白病又称传染性海绵状脑病(tses)，是一类人畜共患的致死性神经退行性疾病，主要病理特征为脑组织中存在淀粉样改变，其主要成分为异常prp沉积，周围可见大量的胶质细胞〔1〕。胶质细胞在神经元的生存和整个生命活动中起着支持、营养、保护和修复等重要作用，并具有不同的免疫活性，构成中枢神经系统(cns)抵御病原体入侵的第一防线。细胞因子是固有免疫反应和适应性免疫反应的关键调节剂。在cns感染性疾病中，组织浸润性免疫细胞、cns相关的巨噬细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞已经被确定为cns特异性炎症中细胞因子的来源。然而，无论是在疾病条件下还是在培养体系中，是小胶质细胞而不是星形胶质细胞作为关键的前炎症细胞因子和免疫调节性细胞因子的主要来源〔2〕。通过研究克雅氏病患者脑脊液，发现前炎症细胞因子白介素(il)6在脑脊液中含量升高〔3〕。本实验应用prp干预体外小胶质细胞，旨在进一步明确朊蛋白病中il6的可能来源。

1 材料与方法

1.1 朊蛋白肽段处理

prp105132肽段(ktnlkhvagaaaagavvgglggymlgsa)采用固相合成法合成，实验前将本条多肽取少量放入离心管中，先用适量的稀乙酸溶解，然后再加入双蒸水稀释，并用稀乙酸将其调回中性ph值。

1.2 细胞培养

1.2.1 神经胶质细胞混合培养

取10只新生wistar大鼠(出生1 d)，在无菌条件下，剪开颅骨，取出脑组织(皮质和髓质)至盛有加糖dhanks液的培养皿中反复冲洗以去除血污。剥离脑表面的脑膜和血管，用加糖dhanks液洗脑组织块1～2次。剪刀剪碎脑组织块至1～3 mm，加入体积比组织块总量多30～50倍的胰酶，在37℃条件下用吸管反复吹打消化液变混浊。加入完全培养液(高糖的dmem/f12 1∶1培养液+10%胎牛血清)终止消化，再次吹打制成单细胞悬液，将细胞悬液转移至消毒离心管中，配平。离心1 000 r/min，10 min，弃上清。加定量完全培养液再次制成细胞悬液，接种入6个50 ml细胞培养瓶，密度为100 000～120 000个细胞/cm2。置于培养箱中，37℃条件下培养。

1.2.2 小胶质细胞的分离、纯化、传代

第3天更换1次培养液，不换液培养10～12 d后再更换培养液，24 h后用dhanks液3∶1稀释胰酶edta溶液(0.25%胰蛋白酶和0.02%edta，1∶1)，37℃下作用40 min。轻轻晃动培养瓶，使贴附在底层星型胶质细胞上的小胶质细胞脱落下来。将含漂浮小胶质细胞的培养液转入培养瓶中，24 h后更换培养液。待细胞长满后，再次用胰酶消化进行传代培养，得到小胶质细胞。

1.3 培养细胞的免疫细胞化学染色

待小胶质细胞长成片后，取出盖片，依次进行0.9%盐水清洗3次，每次5 min;4%多聚甲醛固定40 min;0.01 mol/l磷酸缓冲液(ph7.3)清洗3次，每次5 min，4℃冰箱备用。sp法免疫细胞化学染色。

1.4 prp105132处理体外小胶质细胞

1.4.1 体外小胶质细胞分泌il6含量的测定

体外培养小胶质细胞24、48及72 h，收集细胞上清液，-20℃保存。il6含量检测采用abc夹心elisa法。

1.4.2 不同剂量prp105132对体外小胶质细胞分泌il6含量的影响

应用prp105132，分别为0、20、40、80 μmol/l剂量下干预小胶质细胞，采用abc夹心elisa法检测培养后24 h细胞上清液内il6含量。

1.5 统计学分析

计量数据采用x±s表示，用spss13.0统计软件分析。

2 结 果

2.1 培养小胶质细胞的活体观察

第一代小胶质细胞少，呈漂浮状，圆形，折光性强。传代培养5～10 d后，细胞贴壁，数量增多，并长成片，细胞出现较多短小弯曲的突起。加入prp105132肽段后小胶质细胞胞体增大变圆，细胞突起变短、消失，呈圆状、杆状、阿米巴状。

2.2 培养小胶质细胞纯度的鉴定

cd68单克隆抗体的免疫细胞化学染色显示，成片的细胞cd68免疫反应强阳性(即小胶质细胞)，细胞圆形，部分细胞有较短的突起。用苏木素复染的盖片，在镜下随机抽取5个视野，记数视野下的cd68阳性细胞和cd68阴性细胞(苏木素显示细胞核)，求出cd68阳性细胞的百分比。抽查5张盖片，其小胶质细胞阳性率均>95%。

2.3 il6的含量

体外培养小胶质细胞24、48、72 h上清液il6含量分别为(69.06±6.25)、(68.09±3.04)、(69.61±1.05) pg/ml，组间比较无显著性差异(p>0.05)。分别应用0、20、40、80 μmol/l剂量prp105132干预小胶质细胞，24 h后il6含量依次为(69.06±6.25)、(70.33±0.67)、(87.38±4.16)、(109.64±7.40) pg/ml，表明il6含量随prp105132剂量增大而增大，80 μmol/l组与其他三组组间比较有显著性差异(p<0.01)。

3 讨 论

prp105132肽段(ktnlkhvagaaaagavvgglggymlgsa)对应prpc的跨膜区域，是prpc向prpsc构型转变的关键部位〔4〕，是所有异常prp同工型的共有结构。在不同的环境(离子强度、ph值、溶质成分等)中表现不同的二级结构。prp105132在体外与整个prpsc有某些相同的性质，可形成淀粉样纤维，并具有蛋白酶k抵抗性。在实验中发现，体外培养小胶质细胞中加入该肽段后细胞胞体增大变圆，细胞突起变短、消失，呈圆状、杆状、阿米巴状;并且随prp剂量增加， il6分泌量增多，prp剂量80 μmol/l时il6的分泌量最高，进一步明确了prp105 132肽段对小胶质细胞的激活作用。

小胶质细胞激活是朊蛋白病的神经病理性损害特征，并且这种特征在体内和体外实验中均得到证实〔5〕。组织学研究发现朊蛋白病中，在cns小胶质细胞与异常朊蛋白的聚集有关,并发现体外朊蛋白诱导小胶质细胞介导炎症反应，导致神经元缺失〔6〕。小胶质细胞介导炎症反应需要各种细胞因子的合成和参与。目前已有研究证实prp可使小胶质细胞诱导表达cox2〔7〕，合成il1β、pge2〔8〕。本实验发现prp干预体外小胶质细胞后，培养上清液内il6含量升高，证实了朊蛋白病中小胶质细胞是细胞因子il6来源之一。

【参考文献】

  1 iwasaki y，iijima m，kimura s,et al.autopsy case of sporadic creutzfeldtjakob disease presenting with signs suggestive of brainstem and spinal cord involvement〔j〕.neuropathology，2006;26(6):5506.

2 webster sd，park m，fonseca mi,et al.structral and functional evidence for microglial expression of c1q receptor that enhances phagocytosis〔j〕. j leukoc biol，2000;67(1):10916.

3 杨蕴天,江新梅,林世和.克雅氏病患者脑脊液中细胞因子il6的变化〔j〕.中国老年学杂志,2009;29(2):1878.

4 thellung s，florio t，corsaro a,et al.intracellular mechanisms mediating the neuronal death and astrogliosis induced by the prion protein fragment 106126〔j〕.int j dev neurosci，2000;18(45):48192.

5 moresco rm，messa c，tagliavini f,et al.creutzfeldtjakob disease：activated microglia detected in vivo by molecular imaging〔j〕.neuropathol appl neurobiol，2004;30(4):4156.

6 brown gc，neher jj.inflammatory neurodegeneration and mechanisms of microglial killing of neurons〔j〕.mol neurobiol，2010;41(23)：2427.

细胞的生活范文4

关键词：雪旺细胞基因转染脑源性神经生长因子

中图分类号：R329.28 文献标志码：B 文章编号：1004-7484（2010）12-0029-03

脑源性神经生长因子（BDNF）是一种重要的神经营养因子，能够促进创伤后神经的修复与再生和减少神经元的死亡[2]。本研究通过将携带有BDNF基因的重组腺病毒表达载体转染体外培养的雪旺细胞，以检测BDNF基因的调控表达情况。探索基因治疗外周神经损伤的新途径，为进一步临床应用治疗基因通过腺病毒载体转染雪旺细胞促进周围神经损伤修复奠定实验基础。

1材料与方法

1.1材料

倒置相差显微镜；光学显微镜；CO2孵箱；超净工作台；高速冷冻离心机；DUR530核酸蛋白分析仪；PCR仪；微型垂直平板电泳槽及电转移系统；凝胶成像分析系统；酶标仪；DMEM培养液；山羊抗 S-100 多克隆抗体；兔抗 BDNF 多克隆抗体；HRP标记的兔抗山羊IgG抗体；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体；DAB显色剂；总RNA提取试剂盒；RT-PCR反应试剂盒；DNA Marker DL2000；硝酸纤维素膜；胎牛血清；胰蛋白酶；Ⅰ型胶原酶；阿糖胞苷；多聚赖氨酸；Geneticin；牛脑垂体提取物；SABC试剂盒；兔抗S-100单抗； ECL 试剂；鼠BDNF蛋白ELISA试剂盒。

1.2方法

1.2.1SCs分离培养取出生6～7天的SD小鼠，由第四军医大学实验动物中心提供，常规引颈处死、消毒，取其两侧坐骨神经，采用0.25%胰蛋白酶与0.15%的Ⅰ型胶原酶混合消化，消化完全后含血清培养液中和、离心，行双30min差速贴壁法两次后接种于预铺有多聚赖氨酸的培养瓶内，37℃、5%CO2孵箱中进行培养。阿糖胞苷与Geneticin进行纯化[3，4]，牛脑垂体提取物（BPE，100µg/ml）促进SCs增殖。待细胞80%融合时准备病毒转染。

1.2.2Ad-BDNF转染雪旺细胞含BDNF基因的重组腺病毒（Ad-BDNF）购自中国军事医学科学院基础医学研究所。在进行转染前，按照M.O.I分别为0（即未经感染的正常SCs）、50、100、200和400 pfu/cell计算所需的病毒量，用无血清DMEM培养液稀释Ad-BDNF原液后取相应体积。将病毒加入孔中，轻柔摇晃培养板使病毒平坦的扩散到单层生长细胞上。37℃、5%CO2孵箱中培养72小时。将各组SCs用 2.5 g/L 胰酶消化制备成细胞悬液，1000 r/min 离心10 min，PBS 洗涤 1 次，收集细胞沉淀备用。

1.2.3总RNA提取及纯度分析按试剂盒说明采用 Trizol液一步法裂解细胞，提取总 RNA。取RNA样品5 μL用995 μL DEPC水稀释（1：200）后，用紫外分光光度计测定 260 nm和 280 nm处的吸光度。每个样品读取三次，取均值。RNA样品浓度=200×A260×40mg/L。以A260/A280比值确定RNA纯度，比值应在 1.8~2.0 范围内。连续进行三次实验，以消除非特异性差异。

1.2.4cDNA引物设计BDNF cDNA特异性引物序列参照文献设计[5]，由上海生工生物技术公司合成。

上游引物为5’-CACTCTGACCCTGCCCGCCGAG，

下游引 物为5’-GCATTTAGGTGACACTATAG-3’，扩增片段长度为 430 bp。

1.2.5 RT-PCR 反应试验按Invitrogen公司的RT-PCR反应试剂盒说明书进行。反应条件：94℃变性 1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1min，30个循环。

1.3统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件，两组间同一时间点采用配对t检验，同组内各时间点采用SNK-q检验。

2结果

2.1光镜观察

原代培养雪旺细胞成功后，经阿糖胞苷、Geneticin联合作用，BPE促增殖，传代，镜下见第二代雪旺细胞呈典型的长梭形、双极状，“肩并肩”排列生长。感染后4小时，镜下未见有任何细胞形态变化，状态良好；24小时，镜下见雪旺细胞仍呈双极状、“肩并肩”排列生长；48小时，镜下观察雪旺细胞亦无明显的形态学变化，长势良好。

2.2感染后SCs中BDNF mRNA的表达

提取感染各组和对照组SCs的总RNA，经RT-PCR后均扩增出了约430 bp大小的基因片段，与构建的表达单元大小一致。经灰度分析可知，其中DNA 条带灰度以MOI为200组为著，正常SCs对照组最低（图1）。此结果证实，经 Ad-BDNF 感染后的SCs有外源性 BDNF mRNA 的表达，且表达量明显高于正常SCs；MOI 为 200 感染时，外源性 BDNF 基因转移效率最高。

M0123 4

图1：不同MOI感染SC后BDNF mRNA的表达

（0：正常SC对照组；1：MOI＝50； 2：MOI＝100；3：MOI＝200；4：MOI＝400；M：DNA Marker）

2.3ELISA检测培养液上清中BDNF的表达

从感染后3 d开始，感染后SCs培养液上清中BDNF表达量即开始出现升高，6~12 d升高趋势明显，15~21 d 升高趋势减缓，但BDNF表达量能够维持在较高水平。对照组在各时间点BDNF 表达量均明显低于感染组（P

表1在不同时间点感染后SC和正常SC培养液上清中BDNF的表达（±s，n=10，μg/L，MOI=200）

时间点（d） 正常SC对照组 感染后 SC 组 P值

3 0.31±0.07 0.63±0.11

6 0.41±0.12 0.90±0.13

9 0.47±0.13 1.52±0.14

12 0.53±0.11 3.18±0.15

15 0.56±0.12 3.39±0.15

18 0.61±0.12 3.45±0.19

21 0.65±0.11 3.57±0.16

3讨 论

目前用于感染细胞的病毒载体主要有腺病毒载体系统和逆转录病毒载体系统。其中后者只能感染正在分裂的细胞，并且有插入突变及激活癌基因的危险，繁殖滴度低，故不太适合于体内基因治疗。而腺病毒载体系统具有稳定、安全、滴度高和宿主范围广等优点，还能感染非分裂期细胞，可直接体内应用，适于临床神经系统的基因治疗[6]。在基因转移效率和蛋白表达效率的平衡点上我们选择了腺病毒载体，它不仅能够感染包括神经元细胞和胶质细胞在内的多种细胞，而且感染效率高，容易将外源性基因片段转移到易感细胞中[7]。曹延林等[8]用逆转录病毒BDNF基因成功感染脊髓神经干细胞。因此，我们尝试利用重组腺病毒BDNF基因感染体外培养的SC，以期能进一步应用于周围神经的损伤修复。

我们采用解剖显微镜下机械性剥除神经外膜与束膜、差速贴壁法、阿糖胞苷与Geneticin联合应用纯化、BPE促进雪旺细胞增殖，可以获得纯度90%以上大量雪旺细胞[9]。

Ad-BDNF感染的SCs，RT-PCR检测到BDNF mRNA 的表达，且表达量明显高于正常SCs；ELISA法检测Ad-BDNF感染后SC培养液上清中高度表达BDNF，而正常SCs对照组未检测到BDNF，说明外源性BDNF基因确实转移到SCs体内，并经转录、翻译，最终得以表达。与文献报道的结果相符[10]。Ad-BDNF在MOI为200时转移BDNF基因效率最高，这可能与制备的Ad-BDNF本身性质以及 SD大鼠源性SCs的易感性有关。

总之，通过重组腺病毒介导外源性 BDNF 基因的转移，可以获得能够长时间高度表达BDNF的SC，这将为进一步修复周围神经损伤和保护受损神经元提供保证。此为应用重组腺病毒载体携带脑源性神经生长因子基因转染雪旺细胞促进损伤神经修复奠定了试验基础，探索了基因治疗外周神经损伤的新途径。

参考文献

[1] 韩岩，汤朝伍，王剑波，等.利用Geneticin纯化雪旺细胞的实验研究[J].中华显微外科杂志，1997，20（4）：277-280.

[2] 张勇杰，金岩，聂鑫，等.多步法分离和纯化雪旺细胞的实验研究[J].中华神经外科疾病研究杂志，2002，l（4）：347-350.

细胞的生活范文5

关健词：SPF鸡胚；绒毛尿囊膜；CEF传代细胞；疫苗批产量

鸡传染性喉气管炎（K317株）活疫苗的传统生产方法是接种SPF胚，收获感染的鸡胚绒毛尿囊膜制备而成，绒毛尿囊膜接种法工艺繁琐，制备人工气室不仅耗费时间长，而且合格率达不到100%，收获时污染率高，尤其是气候炎热的季节污染率更高，造成不必要的损失和浪费，加大了生产成本。用鸡胚成纤维传代细胞代替鸡胚绒毛尿囊膜生产该疫苗，生产工艺容易掌握和控制，可批量生产，节约了鸡胚的使用量，降低了生产成本。

1 材料

1.1 鸡传染性喉气管炎（K317株）基础种毒（膜毒），由本公司质管部提供。

1.2 SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物有限公司，25日龄、40日龄SPF鸡，由生产车间孵化。

1.3 CEF由细胞组制备。

2 方法

2.1 细胞制备

2.1.1 CEF原代细胞制备 按《规程》方法进行，所不同的是用冷消化方法，消化过程在4℃进行。

2.1.2 CEF二代细胞制备 CEF原代细胞长成致密单层后，按常规方法进行传代，可连续传3代，二代细胞和原代细胞相比，杂细胞和细胞碎片少，细胞更加纯净，细胞活力好，产毒效价高。细胞产量大，减少鸡胚使用数量，降低成本。

2.2 生产用种毒制备 基础种毒按0.5～1%接种CEF二代细胞，37℃吸附1小时，补足细胞维持液，37℃培养，96～120小时收获，如此方法连续盲传，直至出现典型有规律的细胞病变（CPE）为止，病毒液冻融两次，-20℃保存备用。

2.3 生产用细胞毒的检验 按照《规程 》方法进行。

2.4 细胞病毒液制备及检验 取生产用细胞毒按0.5～1%比例接种CEF二代细胞，置37℃培养，当CPE达75～80%时收毒，冻融2次，-20℃保存。效力检验方法采用鸡胚检验法。

3 结果

3.1 细胞制备 采用胰酶冷消化法进行。好处其是：胰酶温和消化，细胞碎片少，细胞形态好，获得细胞数量多，每胚可至少获得3亿个细胞。

3.2 生产用毒种制备 共盲传三次，第一次盲传未出现CPE，第二次盲传96小时后出现轻微的CPE，第三次盲传后72小时出现明显的CPE，96小时CPE达到80%时收获，冻融2次，-20℃保存。

3.3 生产用细胞毒检验结果：无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染；EID50为105.75/0.2ml；安全性好，5只鸡无任何异常均健活；最小免疫量为l0-4/0.06ml；特异性检验成立，为鸡传染性喉气管炎病毒。

3.4 细胞病毒液制备及检验结果 共生产三批半成品，收毒时间在92～96小时之间，CPE达到80%时收获，三批半成品无菌检验均为阴性，鸡胚效力检验其EID50分别为 105.68、106.0和105.83。

3.5 两种疫苗安全、效力对比试验结果（详见表1、表2）。

4 讨论与小结 4.1 用鸡传染性喉气管炎（K317株）膜毒接种CEF二代细胞，盲传三代细胞发生典型的细胞病变，所制备的细胞毒各项指标均符合《规程》中对生产用毒种的要求，可代替组织毒作为生产用种毒。

细胞的生活范文6

【关键词】 大鼠；血管内皮细胞生长因子；缺血皮瓣；明胶海绵；成活率

文章编号：1003-1383(2007)02-0115-03

中图分类号：R 622+.1 文献标识码：A

皮瓣的成活在修复与重建外科领域是一个很关键的问题。尤其是提高缺血皮瓣的成活能力更是研究的重点。引起皮瓣坏死的主要原因是皮瓣血流动力学的改变，动脉血供不足，静脉排流不畅，或者是二种情况同时存在。而血管内皮细胞生长因子（VEGF）通过与存在于血管内皮上的其受体特异性结合，刺激血管形成，同时在促进创伤愈合与组织修复、促进组织再生方面起着十分重要的作用。本实验通过建立大鼠背部缺血皮瓣模型（蒂∶长度＝4∶1），主要通过RTPCR方法来观察以不同方式给予外源性VEGF后，对皮瓣成活能力的影响。

材料和方法

1.材料 试验动物：选健康SD大鼠，体重250～280 g，雌雄不限、由锦州医学院实验动物中心提供。VEGF购自美国R&D Systems公司。VEGFmRNA RTPCR试剂盒购于上海生工生物工程技术服务有限公司。

作者简介：王继红(1973-)，女，辽宁省锦州市人，主治医师，医学硕士。

2.造模 将45只大鼠随机分为A、B、C三组，每组15只。腹腔内注射氯胺酮100 mg/kg麻醉，无菌条件下，于背部作6 cm×1.5 cm［1］蒂部位于双侧髂棘连线上的全层皮瓣，皮瓣内包括背部肉膜层,在背部肌膜的浅面进行解剖。用无菌生理盐水将VEGF配成10 ng/100 μl的工作液。术中皮瓣形成后，各组分别给予下述处理：①A组：于皮瓣双侧缘的2 cm、4 cm处, 及最远端中心点的供区及受区5对共10个位点，每位点皮下注射100 μl生理盐水，每瓣共1 ml。②B组：同A组的10个位点每一位点注射VEGF工作液100 μl,每瓣共1 ml,含VEGF100 ng。③C组：将6 cm×1.5 cm明胶海绵先敷于创面上，待其湿润后同A组的5对位点将100 ng 的VEGF溶液注入到明胶海绵上。 用1号丝线间断原位缝合皮瓣。

3.检测指标 ①外科观察：观察愈合过程中皮瓣的颜色、质地、组织水肿、坏死、炎症情况。术后每日定时观察并记录。②瓣成活率检测：于术后3天、7天和14天，用硫酸纸准确描绘各组皮瓣的形态,坏死区域用墨汁涂黑，数码照相，用图象分析软件PHOTO SHOP予以分析。皮瓣成活率=(原始皮瓣面积－坏死皮瓣面积)/原始皮瓣面积×100%。③组织学观察：分别于第3 d、7 d、14 d，每组处死5只动物。取皮瓣中远段(5 cm)处0.5 cm×1.0 cm组织块，置40 g/L中尔马林溶液中固定后，石蜡定向包埋,连续切片，片厚5 μm，行HE染色后用普通光镜观察。

4.VEGFmRNA的检测 分别于术后3、7、14 d，切取三组大鼠相同部位的有活力的皮瓣组织，取材后快速放入液氮中冷冻。组织彻底冻透后放入-90℃冰箱里保存。 RTPCR的检测步骤为：①总RNA提取；②按逆转录试剂盒说明操作进行逆转录反应；③PCR扩增。PCR反应参数：94℃预变性4 min。然后，94℃ 50 s、53℃ 50 s、72℃ 50 s，共35个循环，最后延伸7 min，得到反应产物。VEGF正义引物序列为：5’TGC ACC CAC GAC AGA AGG GGA3’,反义引物序列为5’TCA CCG CCT TGG CTT GTC ACA T3’，扩增产物的片段为：VEGF121-360 bp,βactin正义引物序列为：5’GGT GGG TAT GGG TCA GAA3’；反义引物序列为5’TGC ATC CTG TCA GCG ATG3’,扩增产物的片段为801 bp。引物由上海生工生物技术工程有限公司合成。取10 μl PCR产物上样，20 g/L琼脂糖凝胶电泳。扫描电泳照片,用凝胶成像系统测定PCR产物条带灰度值，以VEGF与相应内参βactin基因条带灰度的比值作为结果进行分析。

5.统计学处理 采用SPSS11.5软件在计算机上进行数据处理，计量数据用-±s表示，样本间的比较采用方差分析，P

结果

1.大体观察 术后45只大鼠全部喂养成活。以皮片质地变硬、失去弹性、颜色变黑为判断皮片坏死标准。B、C组皮片比A组皮片肿胀轻，消退早。术后3天各组皮瓣远端色泽变暗，B、C两组皮瓣的切缘处有较多的渗出。随着时间延长，各组皮瓣中、远端出现面积不等的坏死，坏死部份干涸回缩形成黑色痂壳。于14天取材时C组最远端黑色痂壳下面已有新生的表皮生长，与远端的受皮床完全结合。

2.皮瓣成活率 计算各组皮瓣在不同时期的成活率，发现术后3天各组成活率即有显著性差异(P

3.组织学观察 术后3天光镜下可见：三组皮瓣下及切口边缘均见渗出物，以中性粒细胞和淋巴细胞为主，可见少量血管内皮细胞及成纤维细胞。B、C组皮瓣下，有毛细血管芽及新生血管形成。肉芽组织增长优于A组(对照组),血管内皮细胞，成纤维细胞数量明显多于对照组。术后7天，三组皮瓣下均有肉芽组织生长。B、C两组皮片下渗出物减少，肉芽组织增长优于对照组，尤其C组血管内皮细胞、成纤维细胞及新生毛细血管数量明显多于对照组且新生毛细血管，血管腔增大，出现血管平滑肌细胞并初步形成毛细血管网。术后14天三组远端皮瓣比较，B、C组皮片成活良好。且C组优于B组, 表皮完整，腺体增多且形态完整，胶原纤维排列有序，基底肉芽组织中成纤维细胞大部分转化为成熟的纤维细胞，毛细血管多，毛细血管网结构正常，B组表皮较C组薄，腺体少，胶原纤维排列稍混乱，基底肉芽组织中毛细血管相对较少，对照组皮片坏死为主，无表皮层，基底肉芽组织中成纤维细胞增殖紊乱，形态不规则，毛细血管数量较少。

4.VEGFmRNA的表达 在第3天和第7天时各组间有明显差异(P0.05）。且于7天时C组的VEGFmRNA表达为高峰期。见表2和图1。

讨论

皮瓣移植的创面愈合大致可分为三个阶段：①炎症反应，溶解、清除坏死组织和渗出物。②结缔组织细胞和血管内皮细胞游动、增殖、形成肉芽组织。③新生结缔组织基质沉积和新生组织改建。三个阶段相辅相成，互相联系，每一阶段均受到机体的精细调节，还有赖于多种化学介质的调控。血管内皮细胞生长因子与含激酶插入区血管内皮生长因子受体（VEGFR）结合后，在炎症早期经丝裂素活化蛋白激酶(MAPKs)，MAPKs亚通路中细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)激活后磷酸化,调节各种氧依赖型血管内皮生长因子(VEGF)，通过微血管形成的作用，造成氧转运和养料运输的改变，影响修复。在增殖阶段，细胞依赖Toll样受体能够激活NFκB，该受体信号的转导引起其诱导内皮细胞分裂增殖、胶原合成等过程［2］。同时上调尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂和组织型纤维蛋白溶酶原激活剂的表达，导致血管基底膜的降解；还可以增加血管通透性，使血浆蛋白外渗，形成血管生成的临时基质。这些作用都有利于血管新生。VEGF作为内皮细胞特异的强效有丝分裂原，对缺血皮瓣一方面体现在直接作用于血管内皮细胞，促其增殖分化，促进皮瓣的毛细血管新生，提高再生血管的数量和质量，加快皮瓣与受区及皮瓣与切缘之间的血运重建，改善皮瓣远端微循环。另一方面，可减轻皮瓣缺血再灌注损伤［3，4］。

本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文

由于血管内皮生长因子的干预,本实验中VEGFmRNA在3天时对照组与VEGF两组之间即开始出现明显差异，说明外源性VEGF可明显促进VEGFmRNA的表达，而VEGFmRN的增高，又通过一系列的信号传导引起血管内皮细胞的增殖和分裂；进而促进了肉芽组织中毛细血管的再生；因此在术后3天其皮瓣成活率的检测各组间就有显著性差异，C组和B组明显高于A组。说明在皮瓣形成早期局部由于出血，组织细胞坏死，炎性细胞反应使得血供相对减少，氧分压降低，低氧强烈诱导 VEGFmRNA的表达，加之有外源性VEGF的存在，促进了血小板、成纤维细胞及内皮细胞通过旁分泌或自分泌方式产生该细胞因子，使VEGF与其他血管生成因子共同促进血管内皮细胞增殖、分化和血管形成。在第7天时是VEGFmRNA表达的高峰期，同时也是毛细血管和成纤维细胞的快速生长期，组织切片可见C组皮片下肉芽组织含量较对照组明显增多,血管腔增大,出现血管平滑肌细胞并初步形成毛细血管网。术后14天时各组VEGFmRNA的表达量已无明显差异，说明在皮瓣修复的后期，修复趋于完成，各组间VEGFmRNA的表达也趋于平衡。本实验给予的是鼠重组VEGF165，可证明大鼠皮肤再生过程中给予外源性VEGF后可以促进内源性VEGF的旁分泌或自分泌作用，从而起到一个正反馈的作用，更加强了VEGF的局部作用，因此达到促进皮瓣再生的目的。

因为VEGF在血浆中半衰期仅30～45 min［5］。因此如何延长其作用时间，许多学者对其给药方法和途径进行了许多探讨［6~8］。本实验就是通过比较创缘供区和受区均注射VEGF和皮瓣下应用明胶海绵携带VEGF两种给药途径对皮瓣成活能力的促进作用，探讨一种更有效的给药途径。经试验证明，无论是在VEGFmRNA的基因水平上，还是在血管和成纤维细胞的组织形态上，在大体标本上，用明胶海绵作载体局部敷用VEGF比皮下注射VEGF更有效的发挥其促进缺血皮瓣的再生作用。其机制是明胶海绵作为一种可吸收的生物材料可以延长VEGF在局部的作用时间［9］，使之更持久的作用于缺血部位，促进血管内皮细胞的分裂和增殖，加快毛细血管及毛细血管网的形成从而改变局部缺血缺氧的状态，减轻再灌注造成的组织损伤，从而有效的促进缺血皮瓣的存活能力。另外明胶海绵在皮瓣下的存在起了一个支架作用，使炎症早期的炎细胞更容易黏附，从而释放出大量的细胞因子，趋化更多的炎细胞，构建起一个利于血管生成的微环境，使巨噬细胞和内皮细胞通过旁分泌和自分泌作用更多、更持久的产生内源型的VEGF，作用于缺血皮瓣的局部。并且较之目前研究较多的VEGF基因转染的方法比较起来，前者更经济，并且更容易获得，临床应用起来更方便，还避免了基因转染缺乏安全性的问题，也可避免VEGF 的非特异的全身作用。

因此，局部应用携带有VEGF的明胶海绵，对于大鼠缺血皮瓣的存活能力有明显的促进作用，其作用明显优于单纯皮下注射VEGF，并且安全无副作用，对临床治疗缺血性创面和皮瓣具有重要参考价值。