细胞学范文1
[关键词] 液基细胞学；恶性肿瘤；非妇科细胞学标本；细胞学诊断
[中图分类号]R446[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2007）07（c）-101-02
液基薄层细胞学检测（ThinPrep Cytology Test，TCT）技术因取材、制片及ThinPrep2000系统程序化处理等优势，目前已广泛用于妇科阴道及宫颈上皮内病变诊断与筛查[1] ，但是用于非妇科细胞学检查报道较少。本文报告我科应用该方法对非妇科细胞学标本的检查结果，并分析探讨其诊断价值及临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
随机取自2005年5月～2006年1月北京大学临床肿瘤医院临床送检的非妇科标本636例。其中胸水347例，腹水186例，腹腔冲洗液23例，脑脊液68例，心包积液12 例。男310例，女326例。年龄16～82岁。所有病例均为病理诊断明确的恶性肿瘤。
1.2 仪器
美国新柏氏（ThinPrep）液基细胞自动制片机。
1.3 方法
将体液标本取50 ml倒入离心管中，用离心机离心（小于2000 r/min）10 min，去上清液，取沉淀物制备普通细胞学涂片；剩余沉淀物移入ThinPrep PreservCyt处理液中混匀震荡10 min，再次离心（小于1000 r/min）10 min，去上清液，将沉淀物移入ThinPrep PreservCyt保存液中混匀，用美国Cytyc公司的 ThinPrep2000制片机常规制备液基薄片。两种涂片均用95%乙醇固定15 min后，常规HE染色，光学显微镜下阅片。
1.4 细胞学诊断标准
采用巴氏5级分类诊断法将细胞检查结果分为5级。1级：未见异常或不正常细胞；2级：细胞有异型形但无恶性特征；3级：可疑恶性细胞,但证据不足；4级：高度可疑恶性细胞；5级：肯定恶性细胞[1]。所有细胞标本同时作传统涂片方法对比，均以双盲法由同一细胞学专家组诊断。
2 结果
636例标本中用TCT涂片法检出恶性238例，可疑24例，其中包括：胸水恶性123例，可疑11例；腹水恶性75例，可疑12例；腹腔冲洗液恶性12例；脑脊液19例；心包积液9例，可疑1例。普通涂片检出恶性151例，其中包括胸水恶性81例；腹水及腹腔冲洗液恶性66例；脑脊液0例；心包积液4例。普通涂片总体阳性率为23.7％（151/636），TCT涂片总体阳性率为37.4％（238/636），TCT涂片方法诊断准确率明显高于传统细胞涂片方法（表1、图1）。
636例标本中，病理分类包括腺癌275例、鳞癌87例、其他恶性肿瘤274例（包括：恶性淋巴瘤、软组织肉瘤、恶性间皮瘤、移行细胞癌）。用传统细胞涂片法检测，阳性率分别为：腺癌41.5％（114/275）；鳞癌23.0％（20/87）；其他恶性肿瘤4.4％（12/274）。用TCT涂片法检测，阳性率分别为：腺癌62.5％（172/275）；鳞癌40.2％（35/87）；其他恶性肿瘤9.5％（26/274）。对以上各类肿瘤的诊断准确率，TCT涂片方法明显高于传统细胞涂片方法（P
体液中恶性肿瘤细胞形态特征①腺癌：腺癌细胞占积液转移癌的90%以上，细胞形态多样，细胞大小相差悬殊。另外腺癌细胞排列形式多变，分为单个散在为主和聚集成团为主两型。单个散在癌细胞亦为三维结构外观，胞核呈圆形或椭圆形，偏位，核仁明显增大或增多，胞浆中常含有空泡。成团排列的癌细胞有的排列疏松，有的排列紧密，拥挤重叠。②鳞状细胞癌：积液中较少见，仅占2%~3%。鳞癌细胞可单个散在，细胞体积大小不等，多呈圆形，细胞核大，圆形或畸形，居中，核染色质浓集，深染，分布不均，胞浆丰富偏酸性，亦可成堆或成团出现。③其他恶性肿瘤细胞：细胞学诊断为恶性肿瘤细胞，表明只是确定了良恶性，但不能明确组织类型，需进一步明确诊断。
3 讨论
细胞学诊断是肿瘤病理诊断的重要组成部分。其特点是将成块组织或非成块以及液体标本制成涂片，在光镜下观察，结合临床资料做出诊断。以往肿瘤细胞的阳性诊断率明显偏低，传统涂片以痰液为例,其假阴性约30%[1~4]。究其原因可能为：①标本采集及处理方法导致镜下所见多为变性、坏死细胞或人工吸取细胞层制片时与下层红细胞相混，涂片中红细胞多，其他细胞成分少；②涂片过厚或过薄、染色过深或过浅，致使细胞结构形态不清，诊断困难；③传统涂片面积过大，致使读片时间长，易产生漏诊；④传统涂片多为自然干燥或风干，致使涂片未能湿性固定，造成肿瘤细胞人为假象。液基薄层细胞制片技术变革了标本采集和处理方法，而且提高了制片质量，改善了观察效果，从而提高了诊断细胞病理学鉴别诊断的能力。液基薄层细胞制片技术于1996年获得美国食品与药品管理局（Food and Administration，FDA）认证，1999年被引入国内，也称TCT检测，（ThinPrep Cytology Test）现已经广泛应用于妇科宫颈脱落细胞学诊断及普查工作，用于非妇科细胞标本报道较少。我们研究636例标本中，普通涂片阳性率分别为腺癌41.5％（114/275）、鳞癌23.0％（20/87）和其他恶性肿瘤4.4％（12/274）；TCT涂片阳性率分别为腺癌62.5％（172/275）、鳞癌40.2％（35/87）和其他恶性肿瘤9.5％（26/274）；尤其是19例脑脊液细胞学阳性的标本均是通过TCT方法检出，而普通涂片均未检出阳性。液基薄层细胞涂片方法诊断准确率明显高于传统细胞涂片方法（P
[参考文献]
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细胞学范文2
【关键词】 CIK细胞；DCCIK细胞；生物学活性；抗淋巴瘤
The biological activity and antitumor effect against lymphoma cells in DCCIK cells
ABSTRACT: Objective To investigate the proliferation activities， phenotype changes， level of secretory cytokines and antitumor activity against lymphoma cells of DCCIK cells in coculture of cytokineinduced killer (CIK) cells with dendritic cells (DC). Methods DC and CIK were prepared from healthy human peripheral blood mononuclear cells. They were cocultured peripherally. CIK cells were cultured alone as controls. Increased number of cells were counted by tapanblue staining， killing activity was detected by MTT assay， cells phenotypes were analyzed by flow cytometry， secretions of INFγ and IL12 were determined by ELISA. Results The proliferation activity of DCCIK cells was significantly higher than that of CIK cells (P
KEY WORDS: cytokineinduced killer cell; dendritic cellscytokine induced killer cell; biological activity; antilymphoma
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinduced killer cells， CIK)是一种体外增殖能力强、杀瘤活性高及对多重耐药肿瘤细胞较敏感的广谱抗瘤免疫活性细胞[1]。树突状细胞(dendritic cells， DC)是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞，可以在体内、外向T淋巴细胞递呈抗原，并诱发细胞毒T淋巴细胞反应[2]。在本研究中，我们通过多种细胞因子组合从正常人外周血中诱导DC、CIK细胞，并将两者共培养，观察DCCIK细胞体外增殖能力、杀伤活性、免疫表型变化及分泌细胞因子水平，旨在为其临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 rhIL2、RPMI 1640培养基及四甲偶氮唑盐(MTT)均为Sigma公司产品，培养用CD3McAb由Neomarkers公司提供，rhIL1、rhIFNγ、rhTNFα为上海生物制品研究所产品，rhGMCSF为先灵葆雅公司惠赠，rhIL4购自Gibco BRL公司，流式细胞仪标记抗体CD3、CD3CD4、CD3CD8、CD3CD56及检测细胞因子(IL12、IFNγ)的ELISA试剂盒均购自晶美生物工程有限公司，鼠抗人CD1a、CD14、HLADR和FITC兔抗鼠荧光二抗购自中国医学科学院天津血液学研究所。
1.2 靶细胞来源 Raji为人组织淋巴瘤细胞株，引自上海第二医科大学瑞金医院血液学研究所；新鲜淋巴瘤细胞取自外科手术切除的淋巴瘤标本(淋巴结或脾脏)，去除结缔组织和坏死组织，剪成1mm3的组织块，2.5g/L的胰酶消化后过100钢目，经淋巴细胞分离液分离，获得恶性淋巴瘤细胞(malignant lymphoma cells， MLC)，存于液氮中待用。要求靶细胞比例>95%，活体细胞>90%。
1.3 CIK细胞的培养扩增 采集健康人外周血，肝素抗凝，以FicollHypaque淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞(MNC)，RPMI 1640洗3次，调细胞密度为4×106/mL；贴壁培养1-2h，收集悬浮细胞用含10%(体积分数)小牛血清(FSC)的RPMI 1640液调细胞密度为1×106/mL，第0天加入rhIFNγ1000u/mL，放置37℃，5%(体积分数)CO2孵育箱中培养24h后加入rhIL2300u/mL、rhIL1100u/mL、CD3McAb 50μg/L，继续培养，以后每3d更换新鲜培养液，补加rhIL2。
1.4 DC的体外培养 参照文献方法[3]。获得健康人外周血MNC中的贴壁细胞，用含10%(体积分数)FSC的RPMI 1640培养基培养，其中包含rhGMCSF 550u/mL，rhIL4500u/mL。隔日半量换液，补加细胞因子，收获前72h再加入rhTNFα 50u/mL，诱导DC成熟。
1.5 DCCIK细胞的培养 收获培养第9天的DC细胞及CIK细胞经活细胞计数后按1∶5混合培养，第3天和第6天，收集细胞做生物学活性测定。
1.6 细胞毒活性的测定 以不同效靶比(5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1)，把效应细胞和靶细胞放入96孔板，另设单独靶细胞及效应细胞孔，每孔设3个复孔，置37℃，5%(体积分数)CO2孵育箱中培养48h，按本室建立的MTT法[4]测杀伤活性。杀伤活性(%)=[1-(实验组A-效应组A)/靶细胞A]×100%。
1.7 细胞免疫表型的分析 用流式细胞仪检测CIK及DCCIK细胞的免疫表型；间接免疫荧光法测定DC免疫表型。
1.8 细胞因子的检测 收集培养细胞上清液进行IL12、IFNγ水平测定。采用ELISA双抗夹心法，操作按试剂盒说明。
1.9 统计学处理 数据以±s表示，组间比较采用t检验，以P
2 结果
2.1 增殖能力的观察 CIK细胞培养第6天进入显著增殖期，部分细胞体积明显增大，成丛或集落状悬浮生长。与DC共培养可明显提高CIK细胞增殖速率。培养第15天，经台盼蓝排斥法活细胞计数，CIK细胞总数扩增到原来的(43.57±5.11)倍，而DCCIK细胞为(60.75±4.89)倍，两组差异有统计学意义(P
图1 培养时间与增殖倍数的关系（略）
Fig.1 The relationship between the culture time and proliferation fold
2.2 细胞表型的分析
2.2.1 DC的形态及表型检测 培养第9天的DC 细胞在倒置显微镜下可观察到典型的树状或毛刺状突起。检测细胞表面分子表达，其特异性标志CD1a的阳性率为(80.56±1.72)%，MHCI类分子HLADR的阳性率为(92.06±3.20)%，CD14的表达率为(8.69±1.76)%。表明此种方法可以诱导较高纯度的成熟DC。
2.2.2 DC与CIK细胞共培养后的免疫表型 CIK细胞单独培养，随着培养时间的延长，CD3+CD8+及CD3+CD56+细胞的比例逐渐增加。与DC共培养的CIK细胞CD3+CD8+及CD3+CD56+双阳性细胞的比例明显高于同条件下未共培养组(P
2.3 体外细胞毒性 共培养3d的DCCIK细胞，对Raji细胞株及新鲜MLC的杀伤活性均明显高于单纯CIK细胞(P
表1 CIK和DCCIK细胞免疫表型的变化（略）
Table 1 The phenotype changes of CIK and DCCIK cells
*P
表2 DC CIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤活性（略）
Table 2 Killing activity of DCCIK cells on MLC and cell line Raji
2.4 细胞因子的测定 DC与CIK细胞共培养3d，其上清液中IFNγ、IL12的水平分别为(438.02±213.17)ng/L和(30.65±9.10)ng/L，而同条件下，CIK细胞组IFNγ为(213.96±137.00)ng/L，IL12为(10.10±0.35)ng/L，两组相比，DCCIK细胞分泌IFNγ、IL12的水平显著高于CIK细胞(P
3 讨论
CIK细胞是由多种细胞因子如IL2、IFNγ和CD3单克隆抗体等诱导的一种免疫活性细胞，其兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性与NK细胞的非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀瘤特点[5]。DC摄取、加工、处理抗原，高表达MHCI、MHCⅡ类分子、共刺激分子及黏附分子，在体内外具有激发初次和继发性T细胞免疫应答功能，并能分泌Th1型细胞因子IL12，诱导T细胞和NK细胞产生IFNγ和增强激活NK细胞的细胞毒活性。为此，将具有高效杀瘤活性的CIK细胞和具有强大肿瘤抗原递呈能力的DC共培养，无疑会起到一定的抗肿瘤协同作用。研究发现DC刺激CIK细胞后，细胞毒活性显著增强[6]。本实验显示DC、CIK细胞一起培养后，共培养物DCCIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤作用显著高于同条件下单纯CIK细胞。虽然与文献报道[67]有关DCCIK细胞来源、制备方法、效靶比、效靶细胞作用时间以及靶细胞种类不尽相同，但DCCIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤活性与文献中DCCIK细胞对胰腺癌细胞DANG及CML细胞的杀伤活性强于CIK细胞的结论相同。证实DCCIK细胞确实具有比CIK细胞更强的抗肿瘤活性。CIK细胞属于异质细胞群，其抗肿瘤作用与CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞及分泌细胞因子的水平密切相关。将DC、CIK细胞一起培养后，两者所分泌的细胞因子及表面分子表达发生了变化。研究发现DC与CIK细胞共培养时，DC成熟表面标志CD86、CD80、CD40、HLADR的表达增加[8]。而CD4+CD25+细胞(调节细胞T细胞)和IL10水平下降，对肿瘤细胞的细胞毒活性增强[9]。负载CA199(肿瘤相关抗原)的DC与CIK细胞混合培养24h后IL12的分泌量为CIK细胞单独培养时6.93倍[7]。DC的抗原提呈作用能使CIK细胞分泌IFNγ的时间延长，分泌量增加[10]。我们的实验显示，共培养条件下，DCCIK细胞上清液中IL12、IFNγ分泌量均比同条件下单纯CIK细胞培养分泌高，且CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞比例也比CIK细胞组显著增多。说明DCCIK细胞的高杀伤活性与大量增殖的CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞有关，细胞因子IL12、INFγ对杀伤肿瘤也发挥了直接和间接的重要作用。DC能够激活CIK细胞增殖。与DC共培养14d后CIK细胞的增殖倍数比共培养7d时高出两倍左右[7]。本研究结果表明，共培养DCCIK细胞不仅具有很强的杀瘤活性，且比同源CIK细胞具有更强的增殖速率，共培养6d，DCCIK细胞总数比单独培养CIK细胞总数多扩增了17倍。说明利用共培养条件可提高CIK细胞的增殖能力，获得大量高效的免疫细胞，这对于肿瘤临床具有重要意义。本研究初步证实，DCCIK细胞增殖活性、抗淋巴瘤作用均高于单纯CIK细胞，这为其临床应用治疗或辅助治疗淋巴瘤提供了实验和理论依据。
基金项目：陕西省“三五人才工程”专项基金资助项目
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细胞学范文3
【关键词】 结肠肿瘤;rko细胞系;p物质;受体,神经激肽;免疫细胞化学
【摘要】
目的 探讨p物质及其受体神经激肽1(nk?1)在体外培养的结肠癌细胞系rko 中的表达及免疫细胞化学定位。方法 将rko细胞接种于提前放入盖玻片的6 孔板进行细胞培养,细胞融合30％时将盖玻片取出进行免疫细胞化学染色。结果 在rko 细胞系中p物质和nk?1呈阳性表达，p物质阳性表达多数位于细胞浆；而nk?1阳性表达多数位于细胞浆，少数位于细胞膜。结论 神经内分泌机制可能参与了结肠癌的发病过程。
【关键词】 结肠肿瘤;rko细胞系;p物质;受体,神经激肽;免疫细胞化学
immunocytochemical expressions of substance p and neurokinin?1 in rko cells of colon cancer
］
zhao ling?ling, chen hua, wang ji?gang (qingdao university medical college, qingdao, 266003, china);
［abstract］ objective to investigate the immuno?expressions of substance p and nk?1 in rko cell lines of colon cancer. methods rko cells were inoculated on the cover glass and cultured on 6?well plate. the cover glass was removed from the plate upon 30% of cell fusion, and the expressions of sp and nk?1 of the cultured cells were checked via immunocytochemical staining. results positive expressions of substance p and nk?1 were mainly found within the cytoplasm of the rko cells, while a few of nk?1 noted on the membrane. conclusion the neuroendocrine mechanism might involve in the process of morbidity of colon cancer.
［key words］ colonic neoplasms; rko cell line; substance p; receptors, neurokinin?1; immunocytochemistry
p物质属于速激肽家族,由ppt?a基因编码, 11 个氨基酸组成[1]。它能够特异性结合并激活其受体神经激肽1 (nk?1),后者属于7 次跨膜g蛋白耦联受体[2]。nk?1 受体激活后,以g 蛋白作为第二信使活化pkc 和mapk/erk 通路[2?3]。近年来研究显示,g蛋白耦联受体介导的信号转导通路参与了某些恶性肿瘤的发病过程。赵双罗等[4]研究显示，从溃疡性结肠炎到癌前病变，再到结肠癌病人血浆中的p物质水平逐级增高。但目前还没有p物质在结肠组织及细胞中表达的报道。nk?1在结肠癌组织及细胞可表达[5]。目前对p物质和nk?1在结肠 rko 细胞系中表达情况及定位尚不清楚。本文采用免疫细胞化学染色技术，研究p物质和nk?1 在体外培养的rko 细胞系中的表达情况及免疫细胞化学定位。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
兔抗人p物质多克隆抗体（1∶200，工作液），购自北京中杉金桥生物公司；兔抗人nk?1多克隆抗体(1∶200)购自millipore公司；正常山羊封闭血清、elivisiontm试剂盒、dab显色剂等均购自福州迈新公司；dmem(低糖)、胰酶(含有0.5 g/l胰酶和0.53 mol/l edta)购自gibco公司；胎牛血清购自paa公司。人结肠癌rko细胞系由浙江大学来茂德教授馈赠。
1.2 细胞培养
rko 细胞培养于含有体积分数0.05 胎牛血清的培养液中,隔天换液。在细胞90%融合时将其接种于预先置入盖玻片的6 孔板中,每孔细胞数约5×105个,置于37 ℃含体积分数0.05的co2培养箱(美国shel lab公司)中继续培养。在种板第2天,贴壁细胞融合30％将盖玻片取出,置40 g/l甲醛中固定15 min。
1.3 免疫细胞化学染色
采用elivision 两步反应系统免疫细胞化学染色,所有染色过程在室温下进行。细胞固定标本经pbs 冲洗后先用体积分数0.30 h2o2 孵育15 min,然后滴加非免疫山羊血清30 min 封闭非特异性结合位点。一抗孵育1 h 后,pbs冲洗，后滴加试剂a (增强剂)作用30 min和试剂b (辣根过氧化物酶聚合物)作用20 min,用dab 显色3 min。最后，苏木精复染，盐酸乙醇分化，氨水返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以正常山羊封闭血清代替一抗做阴性对照。采用乳癌冷冻组织切片作为阳性对照。1.4 结果判定
所有染色标本采用olympus bx?51 显微镜观察,阳性判断标准参照文献[6]：以低倍镜下见到染色呈明显棕黄色的细胞为阳性。每个标本在高倍镜下(400倍) 随机选取10个视野计数阳性细胞数。
1.5 统计学分析
采用spss 16.0及ppms 1.5[7]软件进行数据处理，结果以±s表示,组间比较采用t检验。
2 结果
rko细胞贴壁良好,约30%融合,在盖玻片上呈树枝状,细胞呈多角形,界限清晰。经免疫细胞化学染色后,绝大多数细胞中p物质均呈阳性反应,棕黄色颗粒位于细胞浆。nk?1在rko细胞系中定位于细胞浆,少数表达在细胞膜，绝大多数rko细胞呈强阳性表达。阴性对照未见阳性着色。每高倍视野rko细胞系中p物质和nk?1阳性细胞数分别为(80.17±9.70)、(77.33±8.52)个，二者比较，差异无显著性(t=0.537,p>0.05)。
3 讨论
nk?1广泛分布于神经组织和非神经组织[7],参与了包括肿瘤在内的许多疾病过程。各种肿瘤细胞表达的nk?1能够高度依赖于p物质的刺激,从而使细胞持续增殖。nk?1能引起ca2+动员,pkc以及mapk/erk的活化。nk?1活化后以g蛋白为第二信使激活下游信号转导通路,其β和γ亚单位能够活化raf?1和erk1/2而引起细胞的转化,不同条件下这条途径既可引起细胞增殖也可促进细胞的凋亡[7?8]。本研究显示,p物质和nk?1在体外培养的结肠癌细胞系rko中均呈阳性表达，提示两者可能参与了结肠癌的发生。nk?1受体在结肠癌细胞高表达与rosso等[5]的研究结果相一致。由于p物质及nk?1与神经内分泌系统密切相关,提示神经内分泌机制可能参与了结肠癌的发病过程。p物质能够上调nk?1的表达水平[10],rko细胞系中p物质阳性表达也提示nk?1高水平表达。singh等[11]认为,p物质刺激部分癌细胞的生长作用可能是通过它和一些细胞因子(il?21、il?26和scf等)的共同作用而引起的。本文研究结果表明,rko结肠癌细胞本身存在p物质的高表达,这提示p物质以自分泌方式刺激肿瘤细胞的生长。另外,petel等[12]报道在细胞培养上清液中存在p物质,这表明p物质也可能通过旁分泌方式上调并激活细胞膜上nk?1受体,从而激活下游信号转导通路引起肿瘤细胞的增殖。考虑到两种方式同时参与了p物质对结肠癌生长的影响过程,我们认为阻断其中任何一种方式都可能起到抑制肿瘤生长的作用。
免疫化学方法简单实用,用该法标记特定类型的肿瘤标志物一直是重要的辅助诊断手段[13?14]。本研究免疫细胞化学染色结果证明p物质和nk?1两种神经内分泌指标在rko细胞系高表达,这为临床上具有该细胞系特点的结肠癌提供了一种新的简单可靠的诊断指标。
综上所述,本研究结果不但提供了结肠癌rko细胞系的一种新特性,也为新的抗肿瘤药物研究提供了理论基础。进一步研究p物质及其受体nk?1与rko细胞系的关系,以阐明二者在该类型结肠癌中的作用,对研究结肠癌的发生机制有着新的意义，并可能为结肠癌的临床诊断提供新的指标。
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细胞学范文4
1 材料与方法
1.1 外周血造血干细胞 APBSC采集自经环磷酰胺（CTX）＋重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）动员后的实体瘤患者（淋巴瘤、乳腺癌），采集使用 CS3000- Plus血细胞分离机（Baxter公司，美国）。
1.2 CD34+细胞的标记 对10份 APBSC分别进行2种不同再处理与CD34标记。
1.2.1 溶血法 APBSC与CD34-PE荧光单克隆抗体（Immunotec，法国）室温暗处反应15 min，然后用细胞裂解液溶解红细胞，待测。
1.2.2 分离单个核细胞法 经Ficoll（相对密度1.007）梯度离心，收集界面层单个核细胞，与CD34-PE标记的单抗室温孵育15 min，待测。
1.3 FACS检测CD34+细胞 上述标记细胞悬液分为2管，其中一管 6 h内使用流式细胞仪（EPICS ELITE ESP， COULTER公司）测定CD34+细胞占单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的百分率，另一管经 1％多聚甲醛固定， 4℃冰箱保存72 h后， FACS测定CD34+ 细胞数。
1.4 荧光标记的CD34单克隆抗体 33份 APBSC同时分别用表达第2类抗原表位QBEnd 10（ClassⅡ,Immunotec）和表达第3类抗原表位 8G12（ HPCA2，classⅢ，Becton Dickinson）的单抗进行标记，比较2组 CD34+细胞百分率之间的差异。
1.5 双标记CD34/CD45 APBSC中同时加入抗CD45-FITC（J33）和抗CD34-PE（HPCA2），用溶血法处理细胞， FACS测定CD34+细胞。
1.6 统计学处理 用 t检验。
2 结果
2.1 溶血法与单个核细胞标记法测得CD34+ 细胞百分率无显著性差异（P＞0.50）。
2.2 同一样品经 1％多聚甲醛固定72 h后的测定值与 6 h内的测定值相比，CD34+细胞荧光强度降低，非特异吸附增加，变异系数范围在 9.9％～49.5％之间，平均CV值为 32.2％。
2.3 APBSC标本分别用2种CD34单体标记，CD34+细胞百分率无显著性差异（P＞0.05）。
2.4 CD34-PE／CD45-FITC双标记测定 APBSC中CD34+细胞的百分率为 4.5％，而同一组样品进行CD34+细胞单色标记为5.3％。
3 讨论
FACS虽然对CD34+细胞的检测具有决定性意义，但早期造血干细胞表面CD34抗原表达弱且少，标本保存（冷冻）、不同标记方法及固定剂的使用均会影响CD34+细胞结果［1］。本研究对样品固定前、后测定，CV值明显大于批内变异，应在 1％～ 6％，批间变异＜20％的国际质控标准［2］。样品的2种不同处理方法间虽无显著性差异，但溶血法较分离单个核细胞法简单，避免了细胞损伤，使细胞回收率提高［2］，更适于临床应用。CD34抗原表位可分为3类，其抗原表达亦有差异，应用针对不同表位的抗体测定CD 34+细胞，结果是否有差异，则报道不一［3,4］。本研究的结果表明无显著性差异。
各实验室对CD34+细胞标记与测定目前尚无统一的标准方法，必然会产生较大的室间差异，Lowdell 等对28份 APBSC在15个实验室进行室间分析，结果差异很大，CD34+细胞为∶ 0.08％～19.31％，CV值为100.1％～136.6％［1］。1995年初，国际血液治疗与移植工程协会（ISHAGE）成立了干细胞计数委员会，建立了一种简单、快速、灵敏的计数CD34+细胞的方法［5］，建议双标记CD34-PE／CD45-FITC计数CD45+细胞中CD34+细胞的百分率，因为白细胞共同抗原CD45在造血干／祖细胞上的表达明显减弱，CD45和侧向散射光（SSC）一起可以较好地把CD34+细胞和淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、死细胞、细胞碎片、血小板团块及有核细胞区分开［4］。此外还可以同时结合第3种荧光抗体，测定CD34+细胞亚群［5］。
应用 FACS测定CD34+细胞应遵循以下原则∶选用特异性及敏感性高的单体，CD34单抗结合PE效果要强于 FITC［6］；由于CD34+细胞表达很少，应计数尽可能多的细胞，以提高结果的准确性［7］；标本应新鲜测定；同时标记CD45，可提高检测CD34+细胞的准确性。
参考文献：
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［5］Sutherland D R , Anderson L , Keeney M et al. The ISHAGE for CD34+ cell deterination by flow cytometry . J Hematotherapy , 1996 ; 5(3) : 213
细胞学范文5
学生主体性教学原则，注重与现实生活的联系的课程理念，构建发现式学习方法（苏霍姆林斯基的《给教师的建议》《和教师的谈话》）。特色：与现实紧密联系，与生活息息相关，操作性强，易引起学生兴趣。
教学分析
一、教材分析：地位和作用， 本节内容主要是在学生学习了关于组成细胞的分子、细胞的结构和功能以及正常细胞的生命历程基础上，比较详细的讲述了癌细胞的特征、致癌因子、致癌机理等内容，是细胞部分知识的延续和补充。通过本节内容的学习，使学生更加深入理解正常细胞与癌细胞的不同，致癌机理以及建立科学健康生活方式对防癌、抑癌的重要意义，指导学生理论联系实际的理念的建立，从而在日常生活中注重科学知识的应用。
二、 学情分析 学生在学习了关于细胞的成分、细胞的结构和功能及正常细胞的生命历程基础上，已经具备一定的知识基础。针对学生的情况，实施相应的教学方法改革和学生学习方式的变革，使学生从“学会”变为“会学”。要充分体现“主体性教学原则”和“以人为本、全面发展”的教育观念，为其终身学习奠定坚实的基础。
重点：（1）癌细胞的主要特征 （2）致癌因子
难点：原癌基因和抑癌基因的区别这些就是我们向学生着重要讲清的问题，可能也是今后考试的重点。
三、教学条件：利用多媒体和网络手段，报刊杂志，挂图等多项结合。
教学目标
（1）知识目标：
说出癌细胞的主要特征和致癌因子；讨论恶性肿瘤的防治，选择健康的生活方式。
（2）能力目标：
培养学生搜集资料、整理分析资料、归纳总结的能力
（3）情感目标：
鼓励学生确立积极的生活态度和健康的生活方式；学生在分小组完成资料收集分析时，培养学生分工合作的团结的团队精神
教学策略与手段
本节课以讨论为主，在充分准备课以及各种相关资料的情况下，利用多媒体来组织和引导学生观察、分析、讨论、归纳和总结，充分调动学生学习的积极性和主动性，发挥主体的作用。倡导自主学习、合作学习、探究学习，让学生通过观察、调查、资料分析等，培养学生的科学探究能力，学生以小组为单位，进行合作学习，唤醒学生的学习意识、挖掘学生的潜能，调动其积极性和主动性，培养学生自主学习的精神。逻辑思维教学法：分析资料
构建发现式学习方法：联系现实生活发现问题，通过学习解决问题提升生活质量。识记法：识记相关概念和基础知识。
教学过程
教学步骤：
课前预习（提前一月）、一癌细胞的主要特征、二致癌因子和细胞癌变的机理、三细胞的癌变、四 癌细胞的预防、诊断和治疗
教学内容：
1.布置学生在课前通过上网、查报纸杂志、看电视、去医院调查等途径收集与癌症有关的资料。2. 展示图片和相关信息（癌细胞的主要特征）。3. 论结合教材和学生收集的资料总结出致癌因子的相关知识引导学生讨论癌症是否遗传。从而分析细胞癌变的原因，引出原癌基因和抑癌基因的概念。4. 分析，总结，明确癌细胞的概念。
教师组织和引导：
1.“讨论健康的生活方式与癌症防治的关系” “选择健康的生活方式” 。2. 引导学生解决课本125页问题探讨，并提出问题你认为人人都有可能得癌症吗？人类能否征服癌症？。3. 展示图片引导学生比较分析癌细胞和正常细胞的区别，分析总结癌细胞的特征。提问（引起细胞癌变的原因）。4. 通过图解，突破教学难点。致癌因子为什么会导致细胞癌变？展示细胞癌变机理的病例分析，引导学生分析细胞癌变的原因，引出原癌基因、抑癌基因的概念。解决前面提问你认为人人都有可能得癌症吗？5. 引导分析，总结细胞的癌变，明确癌细胞的概念。（媒体呈现，提问，讲授）
学生活动：
按教学内容分组合作，根据已经收集整理的资料分析讨论，派代表总结，比较分析癌细胞和正常细胞的区别学生自主学习分析致癌因子。完成128页随堂演练。引导学生讨论癌症是否遗传。从而分析细胞癌变的原因，引出原癌基因和抑癌基因。小组交流讨、教师组织和引导。
教学意图：
培养学生分工合作的团结的团队精神和分析；整理资料的能力分析合作；表达交流的 能力；逻辑思维和 综合比较的能力；自主学习，提出问题解决问题的能力；了解医学发展与癌症治疗的 相关进展。
预期效果：经过学生各抒己见，最后明确人人都有患癌的可能性，致癌因子就在我们身边，与我们地日常生活习惯、所从事的职业、人的道德标准等有密切的关系，只有远离战争，注意保护环境，养成良好的生活习惯，积极向上，保持身体健康，我们才能预防癌症。随着科技的不断发展生物学研究不断深入，癌症终究会被人类所征服。
板书设计：
第四节细胞的癌变
一、癌细胞的主要特征
1、在适宜的条件下，癌细胞能够无限增殖2．癌细胞的形态结构发生显著变化3．癌细胞的表面也发生了变化。
二、致癌因子和细胞癌变的机理
1、物理致癌因子2、化学致癌因子3、病毒致癌因子4、细胞癌变的机理
三、癌细胞的概念
细胞学范文6
细胞因子具有非常广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢等。
一、免疫细胞的调节剂
免疫细胞之间存在错综复杂的调节关系，细胞因子是传递这种调节信号必不可少的信息分子。例如在t-b细胞之间，t细胞产生il-2、4、5、6、10、13，干扰素γ等细胞因子刺激b细胞的分化、增殖和抗体产生；而b细胞又可产生il-12调节th1细胞活性和tc细胞活性。在单核巨噬细胞与淋巴细胞之间，前者产生il-1、6、8、10，干扰素α，tnf-α等细胞因子促进或抑制t、b、nk细胞功能；而淋巴细胞又产生il-2、6、10，干扰素γ，gm-csf，巨噬细胞移动抑制因子（mif）等细胞因子调节单核巨噬细胞的功能。许多免疫细胞还可通过分泌细胞因子产生自身调节单核巨噬细胞的功能。许多免疫细胞还可通过分泌细胞因子产生自身调节作用。例如t细胞产生的il-2可刺激t细胞的il-2受体表达和进一步的il-2分泌，th1细胞通过产生干扰素γ抑th2细胞的细胞因子产生。而th2细胞又通过il-10、il-4和il-13抑制th1细胞的细胞因子产生。通过研究细胞因子的免疫网络调节，可以更好地理解完整的免疫系统调节机制，并且有助于指导细胞因子做为生物应答调节剂(biologicalresponsemodifier’brm)应用于临床治疗免疫性疾病。图4-1 细胞因子与th1、th2的相互关系（略）
二、免疫效应分子
在免疫细胞针对抗原（特别是细胞性抗原）行使免疫效应功能时，细胞因子是其中重要效应分子之一。例如tnfα和tnfβ可直接造成肿瘤细胞的凋零(apoptosis)’使瘤细胞dna断裂’细胞萎缩死亡;干扰素α、β、γ可干扰各种病毒在细胞内的复制，从而防止病毒扩散；lif可直接作用于某些髓性白血病细胞，使其分化为单核细胞，丧失恶性增殖特性。另有一些细胞因子通过激活效应细胞而发挥其功能，如il-2和il-12刺激nk细胞与tc细胞的杀肿瘤细胞活性。与抗体和补体等其它免疫效应分子相比，细胞因子的免疫效应功能，因而在抗肿瘤、抗细胞内寄生感染、移植排斥等功能中起重要作用。
三、造血细胞刺激剂
从多能造血干细胞到成熟免疫细胞的分化发育漫长道路中，几乎每一阶段都需要有细胞因子的参与。最初研究造血干细胞是从软琼脂的半固体培养基开始的，在这种培养基中，造血干细胞分化增殖产生的大量子代细胞由于不能扩散而形成细胞簇，称之为集落，而一些刺激造血干细胞的细胞因子可明显刺激这些集落的数量和大小因而命名为集落刺激因子（csf）。根据它们刺激的造血细胞种类不同有不同的命名，如gm-csf、g-csf、m-csf、multi-csf(il-3)等。
目前的研究表明，csf和il-3是作用于粒细胞系造血细胞，m-csf作用于单核系造血细胞，此外epo作用于红系造血细胞，il-7作用于淋巴系造血细胞，il-6、il-11作用于巨核造血细胞等等。由此构成了细胞因子对造血系统的庞大控制网络。某种细胞因子缺陷就可能导致相应细胞的缺陷，如肾性贫血病人的发病就是肾产生epo的缺陷所致，正因如此，应用epo治疗这一疾病收到非常好的效果。目前多种刺激造血的细胞因子已成功地用于临床血液病，有非常好的发展前景。
四、炎症反应的促进剂
炎症是机体对外来刺激产生的一种病理反应过程，症状表现为局部的红肿热痛，病理检查可发现有大量炎症细胞如粒细胞、巨噬细胞的局部浸润和组织坏死，在这一过程中，一些细胞因子起到重要的促进作用，如il-1、il-6、il-8、tnfα等可促进炎症细胞的聚集、活化和炎症介质的释放’可直接刺激发热中枢引起全身发烧’il-8同时还可趋化中性粒细胞到炎症部位’加重炎症症状.在许多炎症性疾病中都可检测到上述细胞因子的水平升高.用某些细胞因子给动物注射’可直接诱导某些炎症现象’这些实验充分证明细胞因子在炎症过程中的重要作用.基于上述理论研究结果’目前已开始利用细胞因子抑制剂治疗炎症性疾病’例如利用il-1的受体拮抗剂(il-1receptor antagonist’il-lra)和抗tnfα抗体治疗败血性休克、类风湿关节炎等，已收到初步疗效。
