细胞核范文1
细胞核是真核细胞内最大、最重要的细胞结构，是细胞遗传与代谢的调控中心，是真核细胞区别于原核细胞最显著的标志之一。它主要由核膜、染色质、核仁、核基质等组成。
细胞核的主要构造为核膜，是一种将细胞核完全包覆的双层膜，可使膜内物质与细胞质、以及具有细胞骨架功能的网状结构核纤层分隔开来。由于多数分子无法直接穿透核膜，因此需要核孔作为物质的进出通道。这些孔洞可让小分子与离子自由通透；而如蛋白质般较大的分子，则需要载体蛋白的帮助才能通过。
核运输是细胞中最重要的功能；基因表现与染色体的保存，皆有赖于核孔上所进行的输送作用。
细胞核范文2
1、肝细胞：肝脏是由肝细胞组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微镜才能看到，人肝约有25亿个肝细胞；
2、软骨细胞：幼稚的软骨细胞位于软骨组织的表层，单个分布，体积较小，呈椭圆形，长轴与软骨表面平行，越向深层的软骨细胞体积之间增大呈圆形，细胞核圆形或卵圆形，染色浅；
3、肌细胞：亦称肌肉细胞，是动物体内能动的、收缩性的细胞的总称，肌细胞细而长，又称肌纤维，但不同于结缔组织中的纤维，肌细胞能缩能舒，不同于其它所有组织，是机体器官运动的动力源泉。
（来源：文章屋网 ）
细胞核范文3
关键词:早产儿;极早产儿;白细胞计数;中性粒细胞
资料与方法
一般资料
2009年8月～2010年4月,我科收治的极早产儿共27例,,入选标准为胎龄≤32w,无遗传代谢病、无血液病家族史、无免疫抑制性疾病,诊断标准参照《实用新生儿学》。其中男21例,女6例,平均出生体重1284±41 g,平均胎龄29±7w,入院平均年龄2.9±1.4h。患儿出生时情况:新生儿肺透明膜病(RDS)的共24例,占88.8%;宫内感染、新生儿肺炎22例,占81.4%;颅内出血3例,占11.1%,肺出血2例,占7.4%;新生儿窒息16例占59.2%,其中重度窒息5例,占18.5%,轻度窒息11例,40.7%。另以一般早产儿(胎龄>32w,体重2.0kg以上)及足月儿各20例作对照。
2.方法
以上病例患儿在入院后1小时内立即采集静脉血1ml至于干EDTA管内,均匀摇动,采集前均无发热、寒战等现象,血培养均阴性,未曾使用呼吸机、抗生素、止血敏等干预治疗。标本采集后在常温下1小时内送实验室检查。
结果
表1 3组患儿白细胞计数、中性粒细胞比例、单核细胞比例的比较
表2 极早产儿与早产儿白细胞计数、中性粒细胞比例、
上述表格提示三组患儿白细胞计数、中性粒细胞比例、单核细胞比例均有明显差异存在。而早产儿与极早产儿白细胞计数、中性粒细胞比例、单核细胞比例相比也存在明显差异存在。
讨论
本文研究表明极早产儿的白细胞计数、中性粒细胞比例、单核细胞比例与一般早产儿及足月儿均明显低下,而极早产儿与早产儿间也存在明显差异,而这三者均为免疫系统的重要组成部分,可见三者间免疫功能的差异,这与临床上极早产儿较一般早产儿及足月儿容易出现感染相对应。
足月儿和早产儿的白细胞计数、中性粒细胞比例、单核细胞比例差异,考虑与多因素有关:①目前认为新生儿免疫系统功能低下考虑与生后未接触抗原,尚未建立免疫应答有关,而早产儿免疫系统发育较足月儿差,细胞免疫、抗原提呈细胞功能等均较足月儿差,故而由于反应性低下,中性粒细胞、单核细胞等免疫系统的重要组成部分均低于足月儿[1]。②人的免疫系统功能的活化、作用等过程均需各项细胞因子的协助,如白细胞介素、肿瘤坏死因子等,而早产儿的炎症相关因子分泌水平低于正常新生儿,即使是在病原体刺激的情况下也不能很快的做出反应。③早产儿的娩出多为各种感染、发育欠佳因素引起,且常合并窒息、出血等各种围产期因素影响,这些因素均可导致患儿免疫系统的激活,但因早产儿炎性反应低下,常出现不反应或白细胞计数下降等表现,但不一定出现临床症状。
对于极早产儿,免疫功能更为低下。Kulwant等通过发现患儿B淋巴细胞的TACI, BCMA, and BAFF-R等表达量明显低于足月儿及一般的早产儿,因此极早产儿的肿瘤细胞因子功能也明显低下[3];另Nupponen I等对发生肺透明薄膜病(RDS)的极早产儿研究还发现RDS尚可下调免疫细胞的受体密度,并可椅子单核细胞的活化,使肺部免疫功能下降甚至是全身免疫系统的功能,从而严重影响患儿的预后[4]。由此可见患儿的免疫系统的功能低下与各种治病因素均可导致患儿免疫系统的功能低下。
综上所述,临床上行血常规检测时应注意胎龄与检测结果间的关系,白细胞计数、中性粒细胞比例、单核细胞比例不能按照一般早产儿的标准而行相关诊断。否则容易引起误诊漏诊等。目前研究尚有欠缺,如上述各项指标在患儿治疗过程中的变化情况、治疗后的变化等尚未解决,这将在进一步研究中探讨。
参考文献
[1]金汉珍,黄德珉,官希吉.实用新生儿学[M].第3版.北京:人民卫生出版社,2004,681~688
[2]焦路阳,唐成和.窒息新生儿外周血白细胞计数与血小板参数的动态变化分析[J].陕西医学杂志,2005,34(1):104~106
细胞核范文4
【摘要】
目的: 观察CRLF3蛋白在293T细胞中的表达及亚细胞定位， 并在大肠杆菌中表达和纯化了重组CRLF3蛋白。方法: 将真核表达载体pCMVmycCRLF3瞬时转染293T细胞， 转染24 h和48 h后免疫荧光染色， 共聚焦显微镜观察蛋白表达及定位; 构建原核表达质粒pGEX4T1CRLF3， 实现插入基因的融合表达， 经GST亲合层析纯化蛋白。结果: CRLF3蛋白在293T细胞中高效表达， 主要分布在细胞质和细胞膜; 成功构建了表达CRLF3融合蛋白的原核表达载体， 并在大肠杆菌内高效表达， 纯化后得到Mr 约为74000的融合蛋白。结论: 在真核细胞中过表达的CRLF3蛋白主要定位在细胞质和细胞膜; 获得了重组GSTCRLF3融合蛋白，为进一步探讨CRLF3的功能奠定基础。
【关键词】 人细胞因子受体样因子3 真核表达 原核表达 蛋白纯化
[Abstract]AIM: Cytokine receptorlike factor 3 (CRLF3) is a novel gene cloned from K562 cell line. The aim of the current study is to observe CRLF3 expression and subcellular localization in 293T cells and to express and purify the CRLF3 fusion protein in E.coli. METHODS: The plasmid pCMVmycCRLF3 was transiently transfected into 293T cell. The expression and localization of CRLF3 protein was observed by immunostaining approach. CRLF3 was also cloned into pGEX4T1 vector. The GSTCRLF3 fusion protein was expressed in E.coli and purified by GST affinity chromatography． RESULTS: CRLF3 protein was highly expressed in transfected 293T cells. CRLF3 protein was distributed in both cytoplasm and cell membrane. The GSTCRLF3 fusion protein was expressed as a Mr 74 000 protein and then successfully purified from E.coli cells. CONCLUSION: Overexpressed CRLF3 is a cytoplasmic protein that distributes in both cytoplasm and cell membrane in mammalian cells. The recombinant GSTCRLF3 fusion protein had been isolated and could be used for further antibody production and functional characterization.
[Keywords]CRLF3; eukaryotic expression; prokaryotic expression; protein purification
人细胞因子受体样因子3（cytokine receptorlike factor 3， CRLF3）是一个具有I类细胞因子受体保守功能域的新基因。本实验室从K562细胞中克隆出CRLF3[1]， 并提交NCBI GenBank（DQ298450）。CRLF3基因编码区全长1317 bp， 编码一个438个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析CRLF3定位在17q11.2， 具有一个重要的结构域——FN3功能域， 这一结构域的C末端， 有一个RGD基序和I类细胞因子受体特有的WSXWS基序， CRLF3基因保守存在于多种生物中。对CRLF3的功能研究表明CRLF3 的过表达可以抑制细胞周期， 使细胞停滞在G0/G1期， 减少了进入S期的细胞， 其作用机制尚不明确。CRLF3可能是一种交通信号分子。本研究中， 我们将CRLF3基因在真核细胞中表达， 观察了CRLF3在真核细胞中的定位， 并在原核细胞中表达和纯化了其融合蛋白， 为进一步研究CRLF3的功能奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 真核表达质粒pCMVmycCRLF3、 人胚肾293T细胞、 融合表达载体pGEX4T1、 E.coli DH5α、 E.coli BL21(DE3)均由本室保存; MEM、 胎牛血清购自Gibco公司; T4连接酶、 BamH I、 Xho I限制性内切酶、 λEcoT14I digest DNA marker、 蛋白maker均购自TaKaRa公司; 磷酸钙转染试剂购自碧云天生物技术公司; cMyc抗体购自Santa Cruz公司; FITC标记山羊抗小鼠IgG购自中杉金桥公司; GSTTag抗体购自Proteintech公司; Glutathione Sepharose 4B购自GE Healthcare公司; PCR引物由上海英俊生物技术公司合成; 其他均为国产分析纯生化试剂。
1.2 方法
1.2.1 293T细胞的培养和pCMVmycCRLF3的转染 将生长状态良好的293T细胞按1×105 cells/孔的密度转移到放玻片的6孔板中， 在含100 mL/L胎牛血清的MEM培养基中培养24 h。转染前30 min， 换新鲜的培养液2 mL， 分别取5 μg空载体质粒和pCMVmycCRLF3与磷酸钙转染试剂混匀， 室温孵育20 min， 均匀滴加到6孔板内， 在50 mL/LCO2， 37℃培养箱内培养24 h和48 h。
1.2.2 免疫荧光染色 转染24 h和48 h后， 弃去培养液， 多聚甲醛固定20 min， 5 mL/L TritonX100去膜10 min。含100 mL/L胎牛血清的PBS封闭1 h， 加入抗cmyc抗体（1∶100）室温孵育1 h， PBST充分洗涤。加入FITC标记山羊抗小鼠IgG（1∶100）室温孵育1～2 h， PBST充分洗涤。最后加入0.5 g/L DAPI(联眯基苯吲哚酸盐)标记细胞核15min， 洗涤后500mL/L甘油封片， 共聚焦显微镜观察结果。
1.2.3 pGEX4T1CRLF3融合表达载体的构建 以本室构建的pCMVmycCRLF3质粒为模板， 根据已测得的CRLF3的全长序列设计引物， 进行PCR扩增。上游引物序列为5′TATA GGATCC ATG GAG CTG GAG CCT GAG CT3′， 其中导人BamH I酶切位点; 下游引物序列为5′TATA CTCGAG CTA AAA CAC TAA CAC TTT CC3′， 其中导人Xho I酶切位点。PCR产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳回收， BamH I和Xho I酶切pGEX4T1载体和PCR产物， T4连接酶连接， 转化DH5α感受态细胞。挑取单个克隆于5 mL LB(Amp+)培养液中培养过夜， 提取重组质粒， BamH I/Xho I酶切鉴定， 阳性克隆提交上海英俊生物技术公司进行测序分析。
1.2.4 GSTCRLF3融合蛋白的诱导表达和纯化 将序列正确的重组表达质粒pGEX4T1CRLF3转化宿主菌BL21（DE3）， 挑选5个单个菌落分别接种到5 mL LB（Amp＋）管中， 与37℃剧烈摇动培养过夜。每个菌落的培养物按1/100的比例接种到2个新鲜LB（Amp＋）管中， 37℃剧烈摇动培养4 h， A550达到0.6～0.8后， 向其中一管中加入终浓度为1 mmol/L IPTG， 另一管为未诱导的对照菌， 30℃继续培养3～4 h。离心收集培养液各1 mL， 菌体沉淀以100 μL PBS重悬， 取10 μL样品进行120 g/L SDSPAGE电泳， 考马斯亮蓝染色。以空载体转化的大肠杆菌BL21(DE3)作为阴性对照， 检测蛋白表达情况， 选出蛋白表达量高的菌落做种子。
1.2.5 融合蛋白的大量表达和纯化 选取融合蛋白表达量高的种子菌， 以终浓度为1 mmol/L IPTG大量诱导菌液500 mL， 离心收集菌体， 1×PBS(pH7.4)悬浮菌体， 冰浴条件下超声破裂菌体， 4℃、 120000 r/min离心30 min， 取少量上清和沉淀， 进行SDSPAGE检测， 分析蛋白质在胞内表达形式。确定目的蛋白以可溶性形式存在后， 取超声上清过装有500 μL Glutathione Sepharose 4B凝胶的纯化柱， 以1 L的PBS淋洗， 去除杂蛋白， 最后用1倍柱体积的GST洗脱缓冲液 (50 mmol/L TrisHC1 pH8.0， 10 mmol/L还原型谷胱甘肽)洗脱目的蛋白。
1.2.6 Western blot鉴定融合蛋白 取纯化的蛋白进行120 g/L丙烯酰胺凝胶电泳， 电转移至硝酸纤维素膜上， 50 g/L脱脂奶粉4℃封闭过夜。加入GST抗体（1∶2500）室温孵育2 h， TBST充分洗涤， 加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1∶5000）， 室温孵育1 h， TBST充分洗涤， ECL显影。
2 结果
2.1 共聚焦显微镜观察结果 采用共聚焦显微镜观察CRLF3蛋白在293T细胞中的表达及分布。以转染pCMVmyc空载体的293T细胞为本底对照， 40倍物镜下观察可见CRLF3在真核细胞中高效表达。油镜下观察可见瞬时转染24h后的CRLF3均匀分布在胞质中; 瞬时转染48 h后的CRLF3分布在细胞质和细胞膜上（图1）。
图1 转染24 h和48 h后免疫荧光染色（略）
Fig 1 Immunostaining of CRLF3 on 293T cell transfecting pCMVmycCRLF3 after 24 h and 48 h(×1000)
A: Antimyc after 24 h; B: DAPI; C: Merged; D: Antimyc after 48 h; E: DAPI; F: Merged.
2.2 重组质粒的构建和鉴定 以pCMVmycCRLF3质粒为模板扩增的产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳， 得到一条特异条带， 与目的片段1318 bp的大小位置相符（图2）。重组质粒pGEX4T1CRLF3采用BamH I/Xho I酶切鉴定（图3）， DNA测序分析， 证明插入序列是目的序列， 且与融合表达载体的读码框相符。
图2 CRLF3 PCR扩增产物（略）
Fig 2 CRLF3 product of PCR
1: CRLF3 PCR product; 2: λEcoT14I digest DNA marker.
图3 重组质粒pGEX4T1CRLF3的酶切鉴定（略）
Fig 3 Restriction analysis of recombinant plasmid pGEX4T1CRLF3
1: λEcoT14I digest DNA marker; 2: pGEX4T1CRLF3 digested by BamH I and Xho I.
2.3 重组蛋白在大肠杆菌BL21中的表达和纯化 SDSPAGE结果显示， 转化空载体的对照组BL21 IPTG诱导后， 在Mr 26000的位置上出现1条浓集带; 转化pGEX4T1CRLF3重组质粒的BL21 IPTG诱导后， 在Mr约为74000的位置上出现1条较浓集而且表达量受IPTG诱导的蛋白条带， 说明插人的融合基因已经在大肠杆菌中表达， 但在这一位点上也有内源性基因的表达。超声破碎菌体并离心后， 分别取上清和沉淀进行SDSPAGE电泳检测， 显示目的蛋白主要在上清液中， 它在菌体内主要以可溶性形式存在; 利用Glutathione Sepharose 4B亲和纯化目的蛋白， SDSPAGE分析得到1条Mr为74000的单一条带。灰度扫描分析， 纯度达到85%（图4）。
图4 SDSPAGE分析融合蛋白的表达及纯化（略）
Fig 4 SDSPAGE analysis of expression and purification of fusion protein
1: Protein maker; 2: pGEX4T1 transformed BL21（IPTG-）; 3: pGEX4T1 transformed BL21（IPTG＋）; 4: pGEX4T1CRLF3 transformed BL21（IPTG-）; 5: pGEX4T1CRLF3 transformed BL21（IPTG＋）; 6: Supernatant; 7: Sediment; 8: Purified fusion protein.
2.4 Western blot检测 用抗GSTtag多克隆抗体对纯化的GSTCRLF3融合蛋白进行Western blot检测。抗GST的抗体可以检测到Mr为74000的CRLF3融合蛋白条带， 提示纯化后的蛋白为所需要的GST融合蛋白。
3 讨论
CRLF3基因定位在17q11.2， 邻近NF1 (neurofibromatosis type 1)基因， 在神经纤维瘤患者中， CRLF3基因常与NF1一起缺失。神经纤维瘤的遗传学致病机制是由于NF1基因的微缺失， 其缺失的范围至少包括11个基因， CRLF3为其中之一[2， 3]。NF1基因是一种抑癌基因[4]， 而缺失基因簇中的其他基因功能尚不清楚。对CRLF3的生物信息学预测， 它不具有跨膜结构域， 没有核定位信号与细胞器定位信号， 是一种胞质蛋白质。本研究中通过在真核细胞中表达CRLF3， 可见CRLF3转染24 h后主要定位在细胞质， 转染48 h后， 则在细胞质和细胞膜上均有分布， 提示在真核细胞中过表达的CRLF3是一种胞质蛋白质， 充分表达后向细胞膜迁移。CRLF3含有FN3功能域和RGD基序， 含有这样结构域的分子大部分具有介导细胞间黏附和相互作用的功能， 而且主要以受体和分泌形式存在[5]。具有RGD基序的胞质蛋白CRLF3是否也具有介导细胞间黏附和相互作用的功能， 或在细胞质中发挥通讯分子的作用，有待进一步探讨。
本研究中， 我们利用可诱导表达的大肠杆菌表达系统， 以原核表达质粒pGEX4T1为载体表达出GSTCRLF3的融合蛋白， 进一步应用GST亲和层析法有效分离得到纯化的目的基因CRLF3的融合蛋白[6]， 为下一步制备抗CRLF3的多克隆抗体， 更好的研究CRLF3的功能创造条件。
参考文献
[1] Yang F， Zhang Y， Cao YL， et al. Establishment and utilization of a tetracyclinecontrolled inducible RNA interfering system to repress gene expression in chronic myelogenous leukemia cells[J]. Acta Biochim Biophys Sin， 2005， 37(12): 851-856.
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细胞核范文5
【摘要】 目的 系统分析123例血液病患者骨髓涂片中巨核细胞的数量及病态巨核细胞检出率。方法 对123例确诊为血液病患者及10例健康者抽取骨髓进行涂片，做形态学检查，计数1000个非红系细胞，计算出病态巨核细胞检出率及淋巴样小巨核细胞的检出率。结果 特发性血小板减少性紫癜(ITP)组巨核细胞数高于正常组和其他组(P
【关键词】 血液病;巨核细胞;淋巴样小巨核细胞
巨核细胞在骨髓造血细胞中所占比值甚少，但巨核细胞的数量和形态异常在部分血液病的诊断和鉴别诊断中起着重要的作用[1]。本文通过研究123例血液病患者及10例健康者的骨髓涂片，对巨核细胞的数量、病态巨核细胞检百分率淋巴样小巨核细胞百分率等做了系统的分析，现报道如下。
资料和方法
1.研究对象 收集2000～2009年湖北省中山医院检验科123例已明确诊断的血液病骨髓涂片。其中特发性血小板减少性紫癜(ITP)20例，再生障碍性贫血(AA)10例，溶血性贫血(HA)10例，缺铁性贫血(IDA)20例，慢性粒细胞性白血病(CML)20例，骨髓异常增生综合征(MDS)20例，真性红细胞增多症(PV)2例，原发性血小板增多症(ET)5例，急性非淋巴细胞白血病(ANLL)M1M6型10例和恶性肿瘤无骨转移者6例。另选择10例健康者作为健康对照组。
2.方法 骨髓片常规瑞氏染色，对每例骨髓涂片在低倍镜下计数巨核细胞数量，然后对每例骨髓涂片计数1000个非红细胞，计算病态巨核细胞的百分率;对淋巴样小巨核细胞计数，计算出其占巨核细胞的百分率。
3.统计学处理 鉴于统计数据呈现明显的偏态分布，应用SPSS 11.0医学统计软件进行多个样本两两比较的秩和检验。
结 果
1.正常组及各种血液病病态巨核细胞的类型及计数结果 特发性血小板减少性紫癜(ITP)组巨核细胞数明显高于正常对照组(P
2.淋巴样小巨核细胞的分布规律 淋巴样小巨核细胞以MDS组最多见(P
讨 论
巨核细胞生成受诸多因素影响，一些血液病伴发巨核细胞形态改变。淋巴样小巨核细胞是一种不能发育成熟的病态巨核细胞，见于一些恶性疾病患者的骨髓涂片中[2]。本文通过对123例血液病骨髓片的研究发现：病态巨核细胞在MDS患者中明显增多，是MDS重要的特征，其多少标志着巨核细胞病态造血严重的程度。MDS患者随病情进展，小巨核细胞尤其是淋巴样小巨核细胞显著增加，研究发现，原始细胞增多的难治性贫血出现淋巴样小巨核细胞者愈后不良，并在变为ANLL之前出现较多的病态小巨核细胞[3]。AA患者有巨核细胞生成受抑的表现，未见淋巴小巨核细胞，可认为是与MDS的重要区别点。CML患者小巨核细胞有时会成丛出现，周边附有大量的血小板，并常有大的畸形血小板。ET患者骨髓可见各类小巨核细胞，但易见裸核，对ET诊断有意义。ITP的血小板减少是由于免疫作用使之破坏增多而促进巨核细胞增生，故未见淋巴样的小巨核细胞。而HA因溶血时红系代偿增生，溶血也有刺激巨核细胞增生之作用。IDA则是由于慢性失血，使巨核细胞增生。而一些恶性血液病，包括多种骨髓增生性疾病，MDS不仅巨核细胞数目增多，同时可见淋巴样小巨核细胞。
由此可见，巨核细胞数的改变在不同血液病诊断中具有重要意义。对于MDS和其他骨髓恶性增生性疾病，不仅巨核细胞数增多，并可见病态造血，以淋巴样小巨核细胞尤其突出，可作为良恶性血液病鉴别诊断的依据之一。
参考文献
[1]叶任高.内科学[M].第5版.北京:人民卫生出版社，2001：622.
细胞核范文6
【关键词】 基因，bcl2;癌，小细胞；放射疗法，适形;寡核苷酸类，反义
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the effect of bcl2 antisense oligodexynucleotides on radiosensitivity of the cell line NCIH69 of human smallcell lung cancer.MethodsCultured NCIH69 cells were pided into antisense oligodexynucleotides (ASODN)， sense oligodexynucleotides (SODN)， nonsense oligodexynucleotides (NSODN) and blank groups. The different Bcl2 oligodexynucleotides were transfected into corresponding cells using Oligofectamine. Expression of Bcl2 was examined by WesternBlot. The different group cells were irradiated by different dose of Xray (0，2，4，6，8， and 10 Gy) via 6MV linearity accelerator， the apoptotic cells were then detected by flow cytometry and cell growth assessed by MTT test.ResultsThe Bcl2 expression in ASODN group was significantly inhibited compared with other groups (F=7.24-15.31，q=5.03-7.80，P
［KEY WORDS］Genes， bcl2; Carcinoma， small cell; Radiotherapy， computerassisted; Oligonucleotides， antisense
小细胞肺癌被认为是放、化疗敏感肿瘤，但治疗效果不佳，多数小细胞肺癌最终表现为化疗耐药、放疗抗拒。如何提高对放疗抗拒的小细胞肺癌的放射敏感性是肺癌研究的一个重要课题。bcl2基因是近年来发现的一种细胞凋亡调控基因，它在小细胞肺癌中有较高的表达[1～3]。已有研究表明，凋亡控制基因与放疗敏感性有关[4]。本研究将bcl2反义寡核苷酸作用于小细胞肺癌细胞NCIH69，探讨其对小细胞肺癌放疗敏感性的影响及其机制。
1 材料和方法
1.1 细胞系
小细胞肺癌细胞株NCIH69，购于上海午立生物技术有限公司，在含体积分数0.10的胎牛血清的RPMI 1640中培养，于37 ℃体积分数0.05的CO2温箱中孵育。
1.2 bcl2寡核苷酸序列
参考文献[4]合成反义寡核苷酸序列为：5′AATCCTCCCCCAGTTCACCC3′，针对bcl2基因第141～147个密码子合成正义寡核苷酸序列为：5′GGGTGAACTGGGGGAGGATT3′，无义寡核苷酸序列为：5′TCCCACCTCACCTACATCCG3′，以上皆经全链硫代修饰，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 脂质体介导转染寡核苷酸
脂质体Oligofectamine Reagent购于Invitrogen Life Technologies公司。细胞分4组：空白对照组，仅转染脂质体；正义寡核苷酸组，脂质体介导转染正义寡核苷酸；无义寡核苷酸组，脂质体介导转染无义寡核苷酸；反义寡核苷酸组，脂质体介导转染反义寡核苷酸。置于6孔板上培养，每孔细胞浓度2×108/L，24 h后清除细胞培养基，无血清培养基OptiMEM清洗2次，每孔重新加入OptiMEM 800 μL，轻轻混匀。取出20 μmol/L的寡核苷酸10 μL、脂质体5 μL分别稀释于175、10 μL的OptiMEM无血清培养基中，将稀释后的寡核苷酸和脂质体混匀，室温下孵育20 min。 每孔加入200 μL寡核苷酸脂质体混合物，置于孵箱内孵育4 h。最后，换用体积分数0.20胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养72 h。
1.4 Western Blot免疫印迹法检测Bcl2蛋白
将转染后的细胞于RIPA裂解液中裂解，12 g/L SDSPAGE电泳，电转至NC膜上，bcl2鼠抗人单抗为一抗（工作液1∶10稀释），HRP羊抗鼠IgG（工作液1∶10稀释）作为二抗，DAB显色。
1.5 X线照射
收集转染72 h后的4组细胞，即正义、反义、无义寡核苷酸组和空白组，分别转移至6孔板中，调整细胞数为2×109/L，板上加1 cm厚组织补偿，室温下X线照射（6MV加速器X线，源皮距90 cm）0、2、4、6、8、10 Gy，照射后置于孵箱中，48 h后测定细胞凋亡率。
1.6 细胞凋亡率的检测
收集照射后48 h的4组细胞，调整细胞数为5×108/mL，以1 000 r/min离心5 min， 弃上清， 冷PBS洗2次，加入50 mg/L PI低渗液（含NP40、RNA酶）200 μL，混匀，4 ℃避光染色30 min，400目筛网过滤。FACS管上样检测DNA含量，激发波长488 nm，CV值
1.7 MTT测定存活分数
收集照射后的4组细胞，调整细胞数为5×107/L。取96孔板，每孔加入200 μL稀释好的细胞，每组设4个复孔，孵箱中培养72 h。每孔加入5 mg/L的MTT各10 μL，继续培养4 h，离心去上清，每孔加入200 μL二甲基亚砜，混匀，用酶标仪检测492 nm波长处的吸光度值，计算存活分数（SF）。SF=实验组的平均吸光值/空白对照组的平均吸光值×100%。每组重复试验3次，取平均值。
1.8 统计学处理
实验数据以±s表示，用SPSS 11.5软件对结果进行单因素方差分析。
2 结果
2.1 Bcl2蛋白表达结果
WesternBlot杂交结果表明，Bcl2蛋白在空白对照组、正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组细胞中高表达，在相对分子质量26万处显示清晰的蛋白条带，在反义寡核苷酸组细胞中不表达，在相应位置则未见蛋白条带（图1）。
2.2 各组细胞凋亡率比较
反义寡核苷酸组在受到不同剂量X线照射后的凋亡率均高于空白组，差异有显著性（F=7.24～15.31，q=5.03～7.80，P
2.3 各组细胞存活分数比较
反义寡核苷酸组在未照射和照射不同剂量后的存活分数均低于空白对照组，差异有显著统计学意义(F=11.04～45.56，q=5.10～14.75，P
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3 讨 论
在肺癌中，小细胞肺癌约占20%左右。小细胞肺癌具有特异的生物学行为，如恶性度高、生长快、倍增时间短、分裂指数高、早期出现广泛转移、自然生存期短等，临床治疗效果差。放射疗法是治疗恶性肿瘤的主要手段之一。小细胞肺癌对放射治疗较敏感，但很多病人在治疗中出现放射抗拒性。如何进一步提高小细胞肺癌的放射敏感性，从而提高局部控制率和病人生存率，是目前肺癌研究一个重要课题。bcl2是近年发现的细胞凋亡调控基因， 其异常表达与许多肿瘤的发生有关，与小细胞肺癌的关系尤为密切。有研究显示，60%～80%的小细胞肺癌存在Bcl2蛋白过度表达[1～3]。bcl2作为细胞凋亡的重要调控基因，其过量表达可能是导致肿瘤形成和放化疗耐受的主要原因之一。基于bcl2基因的反义治疗可以抑制Bcl2蛋白的表达，诱导细胞凋亡，恢复耐药细胞对化疗药物的敏感性[6]，通过反义技术来封闭bcl2凋亡抑制基因的表达是肿瘤治疗的新思路。本研究采用脂质体转染的方法，将bcl2 反义寡核苷酸导入小细胞肺癌细胞NCIH69中，WesternBlot免疫印迹显示，转染后bcl2 反义寡核苷酸成功封闭了bcl2基因的表达。
bcl2基因可导致肿瘤细胞放射抗拒。PILLAI等[7]对宫颈癌研究后发现，bcl2是通过抗氧化途径防止细胞凋亡，认为放疗是通过产生氧自由基造成DNA损害后引起细胞凋亡的， bcl2表达增加可引起肿瘤对放疗的敏感性降低。SIRZEN 等[8]选用U1285、 U1906和U1810等3种放射敏感性不同的肺癌细胞株，检测3种细胞辐射后产生凋亡的不同。结果表明，放射抗拒的U1810细胞株较放射敏感的U1285和U1906细胞株 bcl2/Bax明显增高，提示高表达Bcl2蛋白易产生辐射耐受。本研究采用bcl2 反义寡核苷酸封闭小细胞肺癌细胞Bcl2蛋白表达，经不同剂量X线照射后，细胞存活率明显下降，提高了小细胞肺癌细胞的放疗敏感性。
研究表明，肿瘤受单一剂量照射后凋亡指数与放射敏感性呈正相关[4]。日本学者报道，在其实验的5种肿瘤细胞中，放射最敏感的室管膜母细胞瘤细胞辐射诱导的凋亡率最高，最不敏感的恶性胶质瘤细胞凋亡率最低[9，10]。上述资料提示凋亡与放射敏感性密切相关。本研究采用流式细胞仪测定细胞凋亡率，结果接受不同剂量X线照射后，经bcl2 反义寡核苷酸转染的小细胞肺癌细胞凋亡率明显高于其他细胞组。提示促进细胞凋亡是bcl2 反义寡核苷酸产生放疗增敏效应的机制之一。
总之，本研究显示bcl2 反义寡核苷酸应用与放疗结合，提高了小细胞肺癌的放疗敏感性，为小细胞肺癌的反义基因治疗与放疗提供了实验基础。
【参考文献】
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[8]SIRZEN F， ZHIVOTOVSKY B， NILSSON A， et al. Spontaneous and radiationinduced apoptosis in lung carcinoma cells with different intrinsic radiosensitivities[J]. Anticancer Res， 1998，18(2A):695699.
