不同微生物菌落特征范文1
P键词：富有机硒菌；菌种鉴定；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
中图分类号：Q939.99 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6389-06
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.24.018
硒是人体必需的微量元素之一，必须通过饮食获取，硒广泛分布于机体的各组织器官、体液中，在肾中浓度最高。硒在人体内总量为14～20 mg，具有抗氧化作用（抗辐射、抗炎、抗衰老）、提高免疫功能（抗病毒）、抗癌、维持甲状腺正常功能、促进生殖作用、拮抗重金属、抗糖尿病、抗高血压、保护肝脏、参与蛋白质和酶及辅酶的合成等功效，可预防克山病、大骨节病、心血管病、癌症、糖尿病等40多种疾病[1-5]，与人体健康息息相关，。
由于硒不能在人体长期储存，面对人体内硒的不断流失和摄入不足，机体必须不断从饮食中获得足量的硒，才能维持硒在身体内的平衡。硒浓度的平衡对许多器官、组织的生理功能有着重要的保护和促进作用。目前许多对疾病的化学干预试验已证明硒蛋白在一些重大疾病防治中具有重要作用[6]。
全世界有40多个国家和地区属于缺硒地区。中国存在一条从东北三省斜穿至云贵高原的低硒带，导致占国土面积72%的地区属低硒地区，其中缺硒区占43%，严重缺硒地区占29%，粮食等天然食物硒含量较低，通过使用这些食物不能满足人体对硒的需求[7]。中国近2/3的人缺硒或处于缺硒边缘[8]。中国营养学会推荐硒的日摄入量不能低于60 μg，正常成人日摄入硒的安全和合适范围为60～250 μg，且膳食硒日最高安全摄入量为400 μg[9-11]。
自然界中存在的硒元素分为无机硒和有机硒两种。无机硒一般指亚硒酸钠和硒酸钠等；有机硒是通过生物转化使硒与生物体内有机物质结合而成，一般以硒蛋白、硒氨基酸、硒多糖、硒核酸[12-14]等形式存在。二者都可以被动物吸收利用，但与无机硒相比，有机硒具有使用较安全、吸收利用率高、营养价值高等优点。微生物富硒发酵是利用生物资源对硒开发的一项重要课题，具有广阔的前景。硒多糖、硒蛋白、硒核酸都是易于被动植物吸收的优良补硒剂，具有良好的药理及保健作用。
目前有机硒的获得包括微生物转化法、植物转化法和动物转化法等[15]，微生物转化法中较多的是利用酵母[16]和乳酸菌[17]。在富硒区，仅仅依靠土壤中的硒很难使农产品的硒含量达到标准，必须依靠外源补硒，即通过生物转化来获得有机硒含量较高的农产品，但目前生产上多用亚硒酸钠根外喷施来获得富硒农产品，硒的利用率不高，且转化为有机硒的效率不高，使富硒农产品中有机硒的含量很低。因此，本研究致力于通过微生物提高有机硒转化率，进而为提高农产品中有机硒含量提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器与设备 智能发酵罐（镇江东方生物工程设备技术公司）、超净工作台（苏州隆意达净化科技有限公司）、恒温摇床（武汉科学仪器厂）、试管、培养皿、接种环、酒精灯、250和500 mL三角瓶、光学显微镜。
1.1.2 菌种 分离得到具有高无机硒转化为有机硒能力的Ⅲ号菌种。
1.1.3 培养基 葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、琼脂15～20 g、NaCl 5 g、去离子水1 000 mL，pH 7.2～7.4；明胶培养基：NaCl 5 g、蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、明胶120 g，加去离子水至1 000 mL，调节pH 7.2～7.4；糖代谢检测培养基：（NH4）2HPO4 1.0 g、KCl 0.2 g、MgSO4・7H2O 0.2 g、酵母膏0.2 g、琼脂15 g、溴甲酚紫0.008 g、葡萄糖5 g（可用核糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇代替），加去离子水1 000 mL。
1.2 方法
1.2.1 菌种的分离筛选 采样与样品处理：采集湖北恩施市白杨坪的富硒烟草废弃物，称取1 g样品置于盛有99 mL无菌水的三角瓶中，充分振荡。
分离：采用梯度稀释分离法稀释10-2～10-8倍，从10-6～10-8稀释液中各取0.1 mL均匀涂抹于葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每个浓度设3个重复，30 ℃恒温培养24 h后进行观察，挑取不同形态的单一菌落，转接至葡萄糖牛肉膏蛋白胨平板培养基继续培养，挑取分离到的菌落形态不同的5个菌株，并编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，进一步纯化。
筛选：将进一步纯化得到的5个菌株进行耐硒性检测，在葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基中加入Na2SeO3（以Se计，下同）300～700 mg/L进行培养，其中Ⅲ号菌株长势良好。
纯化：将Ⅲ号菌株采用平板划线法分离纯化，涂葡萄糖牛肉膏蛋白胨平板检验直至不出现杂菌为止。
1.2.2 菌种的扩大培养 在无菌环境中，挑取两环Ⅲ号菌株的纯化菌种于葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基中扩大培养，30 ℃ 150 r/min培养6～9 h。
1.2.3 发酵培养 于10 L不锈钢自控发酵罐中进行，葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基装料体积为发酵罐容积的70%，0.12 MPa灭菌25 min，待培养基温度下降至35 ℃，接入10% Ⅲ号菌株扩大培养的种子液中，并加入Na2SeO3 300～700 mg/L。
培养条件：设定罐压0.04～0.05 MPa，罐温（30±5） ℃，pH 6.0，溶氧60%～100%，搅拌速度190 r/min，发酵18～24 min得发酵培养液6.5 L。
1.2.4 无机硒转化为有机硒效果研究 将发酵液样品送至湖北航天化学技术研究所分析检测中心依据GB/T 5009.93-2003、GB/T 5009.11-2003进行硒、总砷和无机砷的测定，依据GB/T23942-2009化学试剂 电感耦合等离子体原子发射光谱法通则，采用等离子体原子发射光谱仪检测分析发酵液有机硒含量，参照杭州市农业标准规范DB3301消解无机硒的方法处理样品，测定无机硒。总硒和无机硒的差值为有机硒含量，若未检出无机硒，则总硒即为有机硒。
1.2.5 Ⅲ号菌株的初步鉴定 以《伯杰氏细菌鉴定手册》为指导，参考《一般细菌常用鉴定方法》、《中华人民共和国药典》2015版四部9204微生物鉴定指导原则，对微生物的生理生化性质进行分析，判定出该微生物的种属关系。
1）细胞形态学观察：取纯化的试管斜面，用10 mL无菌水冲洗斜面，获得菌种悬液。吸取稀释后的菌液，进行革兰氏染色、镜检，观察细胞形态。
2）菌落观察：取纯化的试管斜面，用10 mL无菌水冲洗斜面，获得菌种悬液。用浓度梯度稀释法，将菌悬液稀释后涂布到平板培养基上，30 ℃培养24 h形成单菌落，对菌落进行观察。
3）硝酸盐还原性检测：将分离纯化的Ⅲ号菌株接种于硝酸盐培养基中，30 ℃培养1～4 d。将甲（氨基苯磺酸0.8 g，5 mol/L醋酸100 mL）、乙（α-萘胺0.5 g，5 mol/L醋酸100 mL）等量混合液（用时混合）0.1 mL加于试管内，以一支未接种细菌的培养基作为对照。出现红色反应则为阳性，否则为阴性；若对照管为阴性，试验管为阳性，则检测结果阳性；若对照管和试验管均为阳性，则检测结果假阳性。
4）运动性检查：用解剖针穿刺接种分离纯化得到的微生物于葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基内。30 ℃，恒温培养48 h，将培养后的培养皿对透射光目测。微生物只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表示该菌种无运动性；若生长物不仅生长在穿刺线上且向四周呈云雾状扩散，或穿刺线上生长物很少，从穿刺线表面向下渗入有生长物，则表示该菌种有运动性。
5）接触酶检测：用解剖针挑取培养好的单菌落，涂抹于滴有一滴3%过氧化氢的载玻片上，如果气泡产生则为阳性，若没有气泡产生则为阴性。
6）明胶液化检测：挑取生长良好、大小适中的菌落针刺接种于明胶培养基，另取两支空白培养基试管斜面，用无菌解剖针穿刺。22 ℃培养箱中培养，每隔1 d观察试管斜面菌落生长状况和明胶液化程度。若有明显菌落生长且培养基无明显凹陷或液化，则为阴性；若无菌落生长，明胶凝块部分或全部变为可流动的液体，则为假阳性；若有菌落生长，且明胶有明显液化或凹陷，则为阳性。
7）糖代谢检测和产酸检测：将分离纯化的试管菌种分别接种到加有不同糖类的糖代谢培养基中，观察微生物生长状况和指示剂颜色反应。若微生物正常生长且指示剂变色，则可以判定该微生物颗粒利用此种糖类，且该微生物产酸。
8）Ⅲ号菌种的16S rRNA序列同源性及系统进化树分析：将Ⅲ号纯化试管菌种送往中国典型培养物保藏中心（CCTCC）测序，并将核酸序列检测结果通过NCBI进行BLAST-nucleotide分析，并进行16S rRNA序列同源性比对，选取与其同源性较高的基因序列，构建系统发育树，确定其种属关系。
1.2.6 水稻中有机硒含量的测定 将富硒发酵液梯度稀释后对水稻根外喷施，对水稻植株及大米中硒含量进行检测，分析水稻植株对硒的利用率及大米中的有机硒含量。
2 结果与分析
2.1 菌株SE201412形态学特征
通过观察，革兰氏染色为紫色，即阳性菌，菌株形态特征为杆状，芽孢直径小于1 μm，且菌体不膨大，鞭毛侧生，符合芽孢杆菌形态特征（图1）。通过菌株平板菌落形态观察，该菌落表面粗糙不透明，污白色（图2）。
2.2 生理生化特征
Ⅲ号菌生理生化特征的检测项目及结果如表1所示，具体分析如下。
2.2.1 硝酸盐还原性检测 在试验管中加入混合液3 min后颜色开始变化，8 min后红色变化明显为阳性，对照管颜色始K无变化，为阴性，故检测结果为阳性。即该菌种可以将硝酸盐还原成亚硝酸盐。表明该微生物具有硝酸盐代谢途径，符合枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）生化特点。
2.2.2 运动性检查 培养48 h后对培养皿进行透射光目测。发现微生物不仅生长在穿刺线上，穿刺线边缘不清晰，穿刺线四周也有明显菌落生长。部分穿刺线周围出现雾状菌落，有沿着穿刺线表面向下生长的状况。表明该菌种有运动性，符合枯草芽孢杆菌特性。
2.2.3 接触酶检测 用解剖针挑取培养24 h的单菌落，涂抹于滴有一滴3%过氧化氢的载玻片上，有少许气泡产生，接触酶检测呈阳性。
2.2.4 明胶液化检测 该菌株在22 ℃培养箱中培养，第二天开始出现明显菌落。第三天菌落处出现培养基凹陷。培养观察7 d后，培养基液化达到1 cm，明胶液化呈阳性。表明该微生物具有蛋白酶活性，具有枯草芽孢杆菌明胶液化代谢特点。
不同微生物菌落特征范文2
方法：对我单位疾控系统实验室间盲样进行对比性检测。
结果：依据上级CDC传达的反馈信息，本次考核，我疾病预防控制中心取得了满意的成绩。
结论：对比性检测结果证明我疾病预防控制中心的检测能力和总体检测水平具有很明显的进步。
关键词：疾病预防控制中心 卫生微生物 分析 检验质控
【中图分类号】R9 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2013）06-0405-01
作为疾病预防控制中心进行疾病与控制工作和执行卫生行政执法的基本手段和基础，实验室内对卫生微生物进行检验是卫生防病工作和卫生监督工作的基本技术支持[1]。承担盲样的分离鉴定工作、积极开展实验室间能力验证和对比活动、定期进行实验室质控能够有效的促进各实验室处理各种样品过程中的技术操作能力和分析鉴定能力的提高[2]。文章根据我疾病控制预防中心质控考核结果对卫生微生物检验质控技术进行了分析与探讨，结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料。
1.1.1 诊断血清。由我省生物制品研究所生产而且处于有效期内的0157∶H7诊断血清以及致病性大肠埃希菌诊断血清。
1.1.2 培养基。此次卫生微生物检验质控选用由杭州天和微生物试剂有限责任公司制造的细菌生化鉴定系统，采用我省疾病预防控制中心微生物试剂厂生产培养基进行检验质控。培养基皆处于有效期内。
1.1.3 质控样品。此次卫生微生物检验质控选用的质控样品冻干盲样菌种两份（编号为1号和2号），均由我省CDC下发。
1.2 检验质控方法。严格按照GB/T4789.1～4789.31-2003食品卫生微生物检验质控国标进行。
2 实验室检验
2.1 增菌步骤。在无菌环境中向开启后的真空冻干菌种管添加1.0ml无菌生理盐水进行菌种溶解；在分离培养和接种增菌过程中，选用两2支营养肉汤做增菌（复苏）培养；转中增菌液和分离平板时间为4.5至6.5小时，再次分离时间差是18.5至24.5小时。观察显示各增菌基具体生长情况如下表：
2.1.1 取生长情况浑浊的营养肉汤、8%NaC1肉汤各1环，分别接种于血琼脂平板和普通营养琼脂平板上，培养温度设为37℃，培养时间为24.5小时；将从生长情况浑浊的的营养肉汤液、TTB中取出的各1环分别接种于EMB、WS、SS平板上，温度设为37℃，培养时间24.5小时。分别观察每个平板上菌落的生长情况。
2.1.2 在乳糖发酵管、普通营养琼脂平板、血琼脂平板、EMB、WS、SS平板上分别接种一环样液，温度设为37℃，培养时间24.5小时。
2.2 分离培养。
2.2.1 增菌后分离培养。普通营养琼脂平板上菌落呈浅黄色，涂片镜检后发现呈葡萄状，格兰阳性球菌；血琼脂平板上菌落有溶血环，呈钱金黄色。两者菌落皆来自1号样。
EMB平板上菌落具有金属光泽，颜色为深紫色，将菌落进行涂片镜检后发现无芽孢、格兰阴性杆菌；SS、WW平板上菌落大小中等，不透明，菌落颜色为粉红色。其中菌落皆来自2号样。
2.2.2 直接分离。1号样菌：血琼脂平板上无溶血环，菌落颜色为浅黄色；普通琼脂平板上菌落呈浅黄色，两者乳糖发酵不产气，产酸。2号样菌：EMB平板上菌落具有金属光泽，颜色呈深紫色；SS、WS平板上菌落不透明、大小中等、颜色呈粉红色、形状为圆形，三者乳糖发酵产气，产酸。
2.2.3 经肉汤增菌后1号和2号原样中，菌落生长特征与以上描述一致。
2.2.4 其他增菌液情况。接种于普通营养琼脂平板、血琼脂平板、EMB、SS、WS平板中生长结果为澄清的增菌液中无细菌生长。
2.3 生化试验。
2.3.1 进行血浆凝固酶试验，试验材料为从分离培养生长为1号样菌落的平板上取出的呈浅金黄色、G+球菌可疑菌落，实验结果为阳性反应。取出适量可疑菌落进行生化试验，实验结果如表2。
2.3.2 从分离培养生长为2号的菌落平板上取出至少6个G-杆菌可疑菌落。并将选出的可疑菌落接种于KI琼脂斜面，温度设为37℃，培养时间为24.5小时。根据可疑菌落生长情况，可以确定实验中可疑菌落在KI琼脂斜面上反应结果与大肠埃希菌反应特征相吻合，具体生长情况见表3。
根据实验结果和菌落基本特征，判断1号菌为金黄色葡萄球菌，判断2号菌为出血性大肠埃希菌0157H7。我省CDC反馈信息证明质控结果正确无误。
3 讨论
疾病预防控制中心对微生物检验质控的准确性对于整个地区卫生检验工作具有非常重要的意义。对于检验质控工作，最基本的偏差消除有效手段就是实验室间能力验证和相互比对[3]，找出正确答案，同时又能够促进实验室检验质控水平的提升。本次试验室卫生微生物检验质控结果准确，证明我疾病预防控制中心检验能力合格。
参考文献
[1] 李丽颖，高芳群.卫生微生物检验质控结果的分析[J].当代医学，2013，19（7）：94-95
不同微生物菌落特征范文3
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1试验材料
煎饼发酵糊采自本溪寨香生态农业有限公司煎饼生产车间的以大米、大豆、玉米、小米为原料的杂粮发酵煎饼。分离纯化培养基：YPD培养基(酵母浸出粉-蛋白胨-葡萄糖-琼脂培养基)、麦芽糖培养基、玉米粉琼脂培养基、PDA培养基。理化鉴定培养基：糖发酵培养基、碳源同化培养基、氮源同化培养基、无维生素培养基、产类淀粉培养基、高葡萄糖培养基、尿素分解培养基。
1.1.2试验仪器
HG303-恒温培养箱、Gl01-1A型电热鼓风干燥箱：南京实验仪器厂；立式高压蒸气灭菌锅；数显恒温水浴箱：北京市光明医疗仪器厂；PHS-3C型精密pH计：上海雷磁仪器厂；OLYMPUS显微镜；DL-CJ2v单面净化工作台；720型分光光度计：尤尼柯仪器有限公司。
1.2试验方法
1.2.1酵母采集和扩大培养
将无菌操作采集的样品ZX-2010，浸入灭好菌的YPD液体培养基中，于25℃进行72h扩大培养[7]。
1.2.2酵母菌分离纯化
利用梯度划线法在YPD固体培养基上进行划线分离，分离纯化3代。再改用稀释梯度分离法，用0.9g/100mL生理盐水进行稀释，稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66个梯度，然后在YPD平板上用玻璃推子将菌液推平，每种涂3个平板，28℃培养72h。从平板中挑取单个菌落进行平板划线分离，28℃培养72h，镜检后，挑取形态不同的单菌落转接5次，所得菌种接于斜面试管培养基于4℃冰箱保藏。
1.2.3酵母菌形态学观察
采用美兰染色法，观察菌落大小，菌落质地、菌落颜色、菌落表面特征、菌落边缘、隆起度等特征[8]；子囊孢子形态观察[9]、掷孢子的形成观察、假菌丝的观察、无丝状营养细胞的显微镜观察[8]。
1.2.4碳源同化试验
液体试管法：每管加无碳基础培养基5mL，加被测试的碳源(蔗糖、麦芽糖、乳糖、乙醇、可溶性淀粉、D-木糖、半乳糖、甘油、柠檬酸、乳酸、肌醇、海藻糖)。接入新鲜菌液1mL，25℃培养1周后，观察。
1.2.5氮源同化试验
将测试酵母进行饥饿培养，以消耗细胞内多余的氮源，防止出现假阳性结果。将活化好的菌株接种在无菌碳基础培养基上，加入被测氮源(亚硝酸钠、硝酸钾、赖氨酸)，25℃培养5d。
1.2.6糖发酵试验
将葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、海藻糖、纤维二糖等6种糖，分别用酵母发酵，25℃培养2周，观测其发酵结果。
1.2.7其他生理生化试验
无维生素培养试验，高糖培养试验，产类淀粉试验，尿素分解试验[8]。
1.2.8酵母菌耐酸能力测定
将YPD液体培养基调节pH值为3、4、5、6、7分别接种分离酵母菌，28℃培养72h，以未接种的各酸度培养基作空白，于波长560nm处测定A值[10]。
1.2.9酵母菌糖化能力的测定
将分离到的菌株，分别制成质量分数为5%的酵母浸出溶液后，用DNS法测糖化酶活力[11]。分别取1mg/mL葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8mL加入DNS试剂2mL，沸水浴加热2min，冷却，在540nm波长下测定吸光度A值，制成葡萄糖标准曲线。用1%淀粉液、缓冲液、蒸馏水、酵母浸出液稀释后加入DNS试剂混合，沸水加热2min，在540nm波长下测定吸光度A值。从标准曲线查出葡萄糖浓度数，求出糖含量。
2结果与讨论
2.1结果
2.1.1菌株的形态学鉴定
煎饼糊经过自然发酵，采用YPD培养基从样品中共分离纯化出5种优势酵母菌株，分别标记为1#、2#、3#、4#、5#，观察分离菌株的菌落及菌体形态特征，结果见表1。酵母菌的菌落形态均为圆形，表面大多光滑湿润有光泽、边缘整齐、菌落均呈乳白色、不透明，菌体多为圆形或椭圆形。各菌株均有芽殖现象，且均有假菌丝，均不产生掷孢子。
2.1.2酵母菌的生理生化鉴定
样本ZX-2010分离纯化菌株的糖发酵试验见表2，碳源同化试验见表3，氮源同化试验见表4，其他生理生化试验见表5。其中3#、5#半乳糖同化阳性、硝酸盐同化反应阴性、无维生素不生长、不分解尿素等特征符合假丝酵母属的特征；1#号赖氨酸同化阴性、硝酸盐同化反应阴性、尿素水解阴性等特征符合酿酒酵母特征；2#葡萄糖发酵阴性、淀粉生长阳性符合褶皱酵母特征；4#无维生素生长阴性符合发酵毕赤酵母特征；3#淀粉生长阳性、0.01%放射菌酮生长阳性等符合热带假丝酵母特征。根据上述菌落和菌体的形态学鉴定以及生理生化试验结果，对照《酵母菌的特征与鉴定手册》[8]对酵母菌进行鉴定，结果为1#菌为酿酒酵母，2#菌为褶皱假丝酵母，3#菌为热带假丝酵母，4#菌为发酵毕赤氏酵母，5#菌为滑假丝酵母。
2.1.3酵母菌耐酸能力的测定
在煎饼发酵过程中，酵母菌往往需要耐受杂菌所造成的酸性环境，通常发酵煎饼糊的最终pH值可降到4。因此试验测定酵母菌在不同pH值下生长情况，可以更好地了解其对酸性环境的耐受能力结果见图1。如图1可见，酵母菌在pH值为3时均不生长，最适条件都在pH值为5~6。其中1#、2#、3#菌株长势较好，而其他菌株都受到不同程度的影响。因此选择1#、2#、3#适合作为发酵煎饼发酵菌。2.1.4酵母菌糖化活力的测定煎饼经发酵后产生的糖的含量直接影响煎饼的风味和口感，因此酵母菌的糖化能力是鉴定酵母菌株的重要指标，酵母菌糖化所得到的葡萄糖含量见表6。如表6所示，1#、2#、4#产糖量分别为0.854、0.639、0.716mg/mL，产糖能力明显高于其他菌株。
2.2讨论
自然发酵属于多菌种混合发酵，含有多种酵母菌，发酵过程中多种微生物共同作用产生丰富的风味物质[12]。发酵煎饼中的主要微生物所产生的代谢产物具有类脂酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等酶活性。酵母菌的脂肪酶和蛋白酶能分解原料中的脂肪和蛋白质，有利于煎饼摊制成型的形成。其中酿酒酵母的数量最多，酿酒酵母也广泛存在于传统发酵食品中[13-14]，如面包、香肠等面食及肉食品中，酵母菌有利于改善谷物发酵制品的风味和口感，去除发酵制品的不良风味，而且能改善产品的风味和延长保质期。发酵煎饼中的酵母菌也有类似的作用，酵母菌等含有丰富的α-淀粉酶和糖化酶，发酵过程中酵母菌产生的酶将淀粉分解成各种糖类物质，发酵过程降解淀粉产生醇、酸、酯、醛、酮等多种风味物质[15-16]，使发酵煎饼经摊制后有自然的发酵香味，同时发酵过程产生的淀粉酶使一部分淀粉分解成葡萄糖，在煎饼摊制过程中与蛋白质发生美拉德反应也使煎饼的色泽更加诱人。这就是发酵煎饼品质优于不发酵煎饼的原因之一。
酵母菌除了对风味有明显的影响外，在加工性质及保藏品质方面也有积极的影响[17]。发酵过程可以一定程度上降低煎饼糊的黏度，使其在加工时减少搅拌阻力，有利于煎饼摊制成型。淀粉经过发酵，一部分淀粉粒分解成小分子的多糖和单糖，降低了淀粉的糊化温度[18]，在煎饼摊制的过程中减少加热时间。在保藏中可延长产品保质期，延缓产品老化。通过对分离结果分析表明，煎饼自然发酵糊中的主要微生物为酵母菌，因此发酵温度保持在28~30℃，酵母菌的生长最旺盛，发酵效果最好，也能有效地控制杂菌的生长，防止发酵煎饼糊酸度过大抑制酵母菌的生长，从而减少杂菌对煎饼的风味和口感的影响[19]。
不同微生物菌落特征范文4
关键词：重金属污染；土壤微生物；微生物多样性；研究方法
中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）13-0036-03
Study on Soil Microbial Diversity in Heavy Metal Contaminated Soil
Li Yan1 et al.
（1Anhui Huajing Resources and Environment Technology Co.，Ltd.，Hefei 230094，China）
Abstract：In this paper，the research methods of microbial diversity of heavy metal contaminated soils in recent years are summarized，and their advantages and disadvantages and their application are analyzed. The research methods of microbes are also discussed.
Key words：Heavy metal pollution；Soil microbes；Microbial diversity；Research methods
近年来，由于农药、化肥的大量使用，以及冶金、采矿业的迅猛发展，土壤重金属污染日趋严重[1]。重金属污染不仅会严重影响农产品以及农作物的品质，而且会通过食物链进入人体，危害人体健康。土壤是微生物栖息的最重要环境之一，提供了微生物生长所必要的营养物质。土壤微生物种类十分丰富，主要分为细菌、真菌、古菌以及放线菌等。土壤微生物是土壤有机质以及土壤养分C、N、P、S等循环转化的动力，参与土壤中有机质的分解、腐殖质的形成、土壤养分的转化循环等[2]。土壤微生物在土壤生态系统中扮演者十分重要的角色[3]，对环境的变化反应灵敏[4]，其群落多样性和相对组成，是评价环境质量的重要参数[5]。一旦土壤生态系统受到污染，土壤微生物就会发生相应的变化[6]。有研究报告指出，土壤重金属污染能明显影响土壤微生物的活性及结构[7]，李晶等[8]研究也表明，土壤微生物对重金属胁迫特别敏感，可通过微生物群落结构的变化来反映土壤质量和健康状况[9]。因此，研究土壤微生物具有十分重要的意义。本文对研究微生物传统以及各种新型研究方法进行了分类介绍，并对各种方法的优缺点以及适用场合进行说明。
1 土壤微生物研究方法
1.1 传统的分离纯培养和稀释平板计数 在固体琼脂培养基上接种培养微生物，可利用微生物的表面特征差异，在固体培养基上对微生物进行分离纯化，也可利用该方法对微生物在平板上进行简单的计数[10]。同时可以通过配制不同成分的培养基对微生物进行筛选驯化，从而得到我们需要的菌种。此种方法的优点是成本低，便于对微生物的状况做出初步的判断。缺点是由于自然界中存在大量的不可培养的微生物，且存在很多对温度要求苛刻并微生物，如嗜低温菌和嗜高温菌，传统的固体培养基的培养温度并不能满足这些微生物的生存所需温度。
1.2 Biolog微平板法 Biolog微平板原理是基于测定微生物对单一碳源利用程度的差异来表征微生物的生理特性[11]。Biolog微平板由对照孔和95种不同单一碳源孔组成并在其中添加染料，当接种纯培养的菌液时，其中一些孔的营养物质被利用，使各孔呈现出不同的颜色，从而形成微生物特有的代谢指纹，可通过与标准菌种的数据库做对比，从而可鉴定出被测菌种。与传统培养方法相比，此方法可以估算微生物群落代谢多样性和功能多样性。同时可根据各孔的颜色差异来反映出微生物群落的均匀度，从而可以反映出群落的稳定性[12]。该方法的缺点是当环境差异不大时，这些指数并不能较敏感地区分菌群之间的差异[13]。同时由于不同的生长和竞争的结果，菌种之间会相互影响导致种群发生变化，影响测定结果[14]。
1.3 磷酸脂肪酸分析法（PLFA） 磷酸脂肪酸存在于活细胞的细胞膜中，具有属的特异性，不同属的微生物通过不同生化途径而形成不同的磷酸脂肪酸（PLFAs）[15]。因此，土壤中的PLFAs组成和含量变化在一定程度上可反映土壤中微生物量和群落的动态变化。通过对微生物的磷酸脂肪酸进行提取，并依据其中的特征脂肪酸指示的微生物种类[16]，可对土壤中微生物群落特征进行表征。此种方法具有对试验条件要求低、无需对微生物进行培养、测试功能多和稳定性好等优点[17]。但PLFA法也具有一定的局限性。该方法只能鉴定到属，PLFA图谱并不能给出一个实际的微生物种类组成，仅能反映微生物群落的概图[18]；另外，该方法容易受微生物生理状态影响[19-20]；古菌不能使用PLFA图谱进行分析，因为它的极性脂质是以醚而不是以酯键的形式出现[21]。同时由于目前尚未建立土样中所有微生物的特征脂肪酸，并且在很多情况下，还无法确定土样中某些脂肪酸与特定微生物或微生物群落的对应关系[22]。
1.4 变性梯度凝胶电泳技术（PCR-DGGE） 该技术是以复杂的环境样品如土壤为研究对象，直接提取微生物DNA，利用通用引物进一步对提取的DNA进行PCR扩增。将扩增产物开展DGGE凝胶电泳分析[23]。DGGE不是将分子量不同的DNA分开，而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同的DNA分开[24]。该方法的原理是根据DNA的解链特性，不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所需要的变性剂浓度不同。在普通的聚丙烯酰胺凝胶基础上加入变性剂，根据其迁移行为决定于其分子大小和电荷的原理能够将长度相同但序列不同的DN段区分开[25]。该方法具有可靠性高、重现性强、方便快捷、分辨率高等优点[26]，但同时也存在一定的局限性。DGGE还不能全面分析土壤中全部微生物，该方法只能检测出土壤中相对丰度大于1%的微生物[27]；同时DGGE对实验要求较高，凝胶浓度、温度、电压等电泳条件选择不当时，就会发生共迁现象[26]，即同一条带不止包含一种微生物，微生物的种类被低估。
1.5 高通量测序技术 高通量测序技术也称“下一代”测序技术，1次并行能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。以Illumina公司的Solexa，ABI公司的SOLiD，和Roche公司的454技术为代表[28-29]。该技术对于研究土壤微生物具有极大的意义。该技术极大地降低了微生物测序成本，实验了大规模土壤微生物直接测序[30]；同时该方法极大地提高了测序通量，丰富了研究的信息量，便于研究者更加深入地了解所研究课题。但同时该方法也存在一定的局限性，主要局限性如下：海量数据分析难的问题，该测序方法所测数据之深，所获信息之大，都极大地加大了实验研究者分析数据的难度；数据去伪存真难的问题，在土壤微生物高通量测序中，存在物种丰富度被高估的情况[30]，对高通量测序结果去伪存真，探索新的统计学方法成为研究者面临的一大难题[31]。
1.6 基因芯片技术（GeoChip） 基因芯片（GeoChip）是研究土壤微生物非常有效的技术手段，作为新一代的核酸杂交技术，可用于检测环境微生物参与物质循环、污染物降解等过程中参与的功能基因[32]。该方法是在芯片上含有编码各种与生态学和生物功能过程或生物降解作用有关酶的基因[33]。由此可见，功能基因芯片为土壤微生物研究提供了全新有力的技术分析工具，有利于更加有效地利用微生物对污染土壤进行修复[34]。基因芯片技术具有高密度、高灵敏度、自动化和低背景水平等显著优点[35]。但是任何技术都存在一定的局限性，基因芯片技术也不例外。该技术虽能检测出微生物在生物学过程中所发挥作用的功能基因，但是却不能直接表征微生物的群落多样性组成和丰富度。应结合DNA与mRNA测序，可以更加真实全面地反映土壤微生物群落结构信息及其生理活动[34]。同时该方法在取样、标记、杂交条件、图像处理、数据归一化以及所得数据的质量评估等都会带来很多误差[36]。
2 不同方法在重金属污染土壤中的应用
刘云国等[37]在湖南临乡桃林矿区土壤中采用稀释涂布法在马丁固体培养基上筛选出一株高抗铜、锌菌株；张秀等[38]利用Biolog微平板法来分析生物质炭对镉污染土壤微生物多样性的影响；孙婷婷等[39]利用磷酸脂肪酸分析法来分析羟基磷灰石-植物联合修复对Cu/Cd污染植物根际土壤微生物群落的影响；郑涵等[40]利用PCR-DGGE分析方法对锌胁迫对土壤中微生物群落变化的影响进行了评价分析；江玉梅等[41]利用Illumina平台高通量测序技术分析重金属污染对鄱阳湖底泥微生物群落结构的影响；路桃香对植物非根际土壤微生物进行454高通量测序。
目前对于微生物研究方法有很多种，有最先进的技术，也有传统的实验方法，每种方法都各有优缺点，因此，在研究土壤微生物时，应结合土壤特征以及研究目的合理选择研究方法。如条件允许的情况下，可以结合多种技术方法同时使用，可以更好地研究土壤微生物的群落特征。
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不同微生物菌落特征范文5
[关键词] 宫颈；微生物感染；细菌；分类；诊断
[中图分类号] R711 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2013）08（c）-0181-02
目前在临床上比较常见的微生物感染包括有：霉菌、细菌、放线菌、滴虫以及病毒等病原菌诱发的宫颈特异性感染。在临床上宫颈微生物感染属于妇科常见病，近几年膜式液基超薄细胞学检测技术在微生物学领域获得了良好的发展，使得对宫颈病变的诊断准确性和检出率得以提高，能够实现对宫颈感染诱发的细胞形态改变的观察，进而为今后的临床诊治工作提供了可靠的参考依据[1]。该研究中出于对宫颈微生物感染细菌的分类观察以及其诊断价值进行分析探讨的目的，对搜集得到的宫颈感染细胞标本展开了镜下观察，现结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
该研究中实验标本为该院搜集到的宫颈特异性感染细胞标本，抽取其中的45份作为研究对象，包括细菌感染18份，霉菌感染17份，放线菌感染2份，滴虫感染5份，人瘤病毒（HPV）感染2份，单纯疱疹病毒（HSV）感染1份。
1.2 方法
1.2.1 研究方法 将以上统计研究对象进行整理，对其在光镜下进行观察，而后对观察结果进行统计分析。
1.2.2 观察方法 所用仪器为该院现有的光学显微镜以及新柏氏THINPREP 2000系统，在制片结束后对标本采取浓度为95%的酒精进行固定，而后行常规HE染色，部分标本行巴氏染色，并以TBS诊断标准为依据做出细胞病理学诊断分级[2]。
2 结果
2.1 细菌感染
该组45份标本中包括有细菌感染18份，占40.00%。经观察发现，细菌感染主要为阴道球杆菌感染，求杆菌嗜碱性，经三维观察，可发现诸多的球杆菌在鳞状上皮细胞表面进行覆盖，比较像一个绒球；而经二维观察发现，细菌呈现出颗粒状短小杆菌，形似一层沙或者是模糊的薄膜在细胞表面覆盖。
2.2 霉菌感染
该试验中共检出霉菌感染17份，占37.78%。霉菌感染多数为白色念珠菌感染，经镜下观察发现，白色念珠菌假菌丝嗜曙红色，在发生退变后会呈灰褐色，竹节状，存在明显的锐角分支，一般会表现出“发芽树枝”或者是“麻辣串”状，在上皮细胞中穿插。除以上特点外镜下还可观察到孢子或者是芽孢，孢子呈现典型的“葵瓜子”形，一头尖锐、一头圆顿，多成对出现，存在显著的折光性；而芽孢则呈现出圆形或者是椭圆形，存在一层相对较薄的包膜，有芽生现象；上皮细胞各层均有脱落现象发生；胞质多嗜曙红色，在染色后颜色相对鲜艳，可呈现出大小不一的空泡。
2.3 放线菌感染
该实验中检出放线菌感染2份，占4.44%。放线菌具有明显的锐角分支，嗜碱性，排列呈现为纷乱团状，并且在大多数情况下呈现为细丝向外放射。中性粒细胞在菌落上粘附，表现出明显的硫磺颗粒状；上皮细胞表现出非特异性轻中度的炎性反应改变，核形相对规则，染色质分布较为均匀，胞质相对丰富。
2.4 滴虫感染
该实验中共检出滴虫感染5份，占11.11%。镜下观察发现，滴虫大小不一，虫体一般在8～30 um之间，呈现出明显的梨形，头部较为圆顿，尾部尖细，并且存在细长的鞭毛，然而鞭毛容易发生脱落，一般无法观察到。经染色后虫体呈现淡淡的灰紫色，在虫体内能够观察到偏位梭形核，呈现出明显的蓝紫色，两端较为尖锐，比较类似滴虫的脊梁。一般情况下滴虫排列在上皮细胞边缘或者是爬在上皮细胞上，也可以成团片状或者是散在出现。上皮细胞一般会表现出重度的炎症反应改变，鳞状上皮细胞各层均会发生脱落现象；细胞核一般会出现明显的增大，甚至会达到CIN水平，然其大小不一，染色质发生增粗现象，能够观察到双核、核固缩以及碎裂等现象，核周存在明显的空晕；细胞质嗜曙红色，染色后颜色变淡，细胞界相对模糊，能够观察到大小不一的空泡。
2.5 HPV感染
该实验中共检出HPV感染2份，占4.44%。经镜下观察发现，HPV感染诱发的细胞改变表现为：① 挖空细胞。鳞状上皮细胞呈现出明显增大现象，并且表现为单核或者是双核，也可发现3～4个核，核膜相对粗糙；核周围的胞质呈现出穴样挖空，在挖空内能够观察导致弥漫性淡红色的微小颗粒，挖空边缘相对隆起，厚度不均，胞质呈现嗜曙红色；② 角化不良细胞。表层的鳞状上皮细胞呈现单个散在或者是成片出现状态，染色后胞质呈现红色，细胞核稍增大呈现固缩状；③ 湿疣外底层细胞。外底层的鳞状上皮细胞表现出细胞核正常或增大，染色质相对浑浊，在核周能够观察导致窄空晕。
2.6 HSV感染
该研究中共检出HSV感染1份，占2.22%。镜下观察发现，上皮细胞显著增大，且大小不一。细胞呈现单核或者是多核状态，多核细胞呈现出核拥挤镶嵌排列，但是未出现重叠；染色质发生退变，呈现为明显的胶质状，外观与毛玻璃相近；核膜呈现出明显的不规则增厚现象，在核内能够观察到大小不一的嗜酸性包涵体，体态不规则，周围存在空晕或者是透亮的窄区。
3 讨论
研究证实[3]，采取宫颈脱落细胞学检查对宫颈微生物感染进行检测时具有操作简单、结果可靠等优势，其能够对感染病原体以及病原体诱发的特征性细胞改变进行准确的观察，这对于临床诊断和治疗方案的选择均具有重要的意义。该研究中对宫颈特异性微生物感染的细胞标本进行光镜下观察，结果发现，在45份标本中检出了细菌感染18份，霉菌感染17份，放线菌感染2份，滴虫感染5份，HPV感染2份，HSV感染1份。镜下观察可发现细胞改变的特征性。
细菌感染多位阴道球杆菌感染，细胞改变主要为爬满上皮细胞，呈现出线索细胞状态，为对细菌性阴道疾病进行诊断的一个特征性依据[4]。目前对于霉菌感染、放线菌感染以及滴虫感染的诊断相对较为容易，找到病原体为唯一的诊断依据。然而在了解上皮细胞的改变后能够为正确判断病理诊断提供可靠的参考依据[5]。对于HPV与HSV感染而言，因病原体在光镜下观察十分困难，因此该类感染的细胞学诊断一般以特征性细胞改变为依据。经研究发现，HPV感染科导致挖空细胞的出现，而HSV感染也会导致生殖器疱疹[6]。
综上所述，宫颈微生物感染的临床诊断中，依照病原体细胞改变可作出准确的诊断，使诊断率得以提高，为临床治疗提供了可靠的参考依据，值得关注。
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不同微生物菌落特征范文6
【关键词】 红曲菌；分离；纯化；鉴定
Abstract：［Objective］To isolate，purify and identify Monascus strains from red furu.［Method］Based on eosinophilic and ethanol tolerant characteristics of Monascus，stains were isolated from red furu by culturing on malt juice medium containing alcohol and rice medium containing lactic acid.Strains were purified using logarithmic plate dilution method，and then determined genera according to their micro-morphological characteristics.By culturing on malt extract agar medium with temperature of 25 degrees Celsius，strains were identified to species based on the morphological characteristics of colonies.［Result］M-1strain isolated from red furu was identified as Monascus pilosus and M-2 Monascus anka.［Conclusion］Strains isolated from red furn are Monascus fungi.
Key words：Monascus；isolation；purification；identification
红曲菌隶属真菌界（Eumycophyta）子囊菌门（Ascomycota）真子囊菌纲（Euascomycetes）散子囊菌目（Eurotiales）红曲菌科（Monascaceae）红曲属（Monascus）［1］，具有防腐，解毒；消食活血、健脾燥胃之功效［2］。我们根据红曲菌嗜酸、耐乙醇的生长特性［1］，对市售红腐乳中的红曲菌进行分离纯化，并对它们进行了形态学鉴定，为进一步发掘红曲菌生物资源做了有益探索。
1 材料和方法
1.1 实验材料
(1)原料：市售红腐乳、大米、琼脂粉、乙醇、乳酸，麦芽浸出粉（malt extract）。(2)麦芽汁：麦芽浸出粉3g，蒸馏水100ml，PH3.54.0，分装5ml/管，每管加95%乙醇2滴。(3)大米培养基大米10g，蒸馏水15ml，1%乳酸40ul。(4)麦芽汁培养基麦芽浸出粉6g，琼脂粉4g，蒸馏水200ml，PH5.0～6.0。(5)麦芽提取物琼脂（malt extract agar，MEA）培养基麦芽浸出粉2g，蛋白胨0.1g，葡萄糖2g，琼脂粉1.5g，蒸馏水100ml，PH6.0。
1.2 方法
1.2.1 分离
无菌条件下，红腐乳汁经2层纱布过滤，取0.1ml滤液于5ml麦芽汁，一式3管，空白对照1管。32℃培养，观察。挑取麦芽汁上长出的红色菌体少许，置于大米培养基中，一式3皿，空白对照1皿。32℃培养，观察。
1.2.2 纯化
从大米培养基上挑取红色菌体少许于1ml无菌生理盐水（NS）中，用对数稀释平板法［3，4］获得纯培养。
1.2.3 鉴定
取纯化后的红曲菌种，点种到MEA培养基32℃培养成熟。在载玻片上滴加一滴蒸馏水，用解剖针挑取少许菌丝，用50％乙醇浸润，再用蒸馏水清洗一下，然后放入载玻片上的液滴中，仔细地用解剖针将菌丝分散开来，盖上盖玻片(勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片)，制成水浸标本片，用显微镜观察。取纯化后的红曲菌种，点种到MEA培养基25℃培养，观察红曲菌落大小、形态、色泽，气生菌丝的产生情况。
2 结果
2.1 分离
接种红腐乳汁的麦芽汁在3～4d后可见白色团状菌丝，7d后菌丝转为红色，培养液亦呈红色，而CK管中始终无菌体生长。3d后，接种分离菌的大米培养基上有微量无色菌体生长，6d后菌落明显，呈白色，7d后菌落长大，粉红色，8d后菌落更大，红色。
2.2 纯化
将来自大米培养基的真菌稀释液涂布于麦芽汁平板培养后发现菌体生长良好、无杂菌，并出现明显的单菌落，编号为M-1～M-3……。
2.3 形态学鉴定
显微镜观察所分离的菌丝具不规则分枝，多核，有横隔，含油滴，透亮或有深浅不一的红、褐色色素，分生孢子着生在菌丝及其分枝的顶端，孢子单生或链状，闭囊壳球形，有柄（图1）。
纯化后的M-1菌株点种到MEA培养基，25℃培养，初期为圆形白色小菌落，7d后菌落圆形，直径28mm，米色，气生菌丝丛毛状，菌落背面红色，有放射状条纹（图2）。
纯化后的M-3菌株接种到MEA培养基，25℃培养，菌落初期为圆形，白色，7d后菌落直径8mm，铁锈色，中间裂开，边缘较整齐，质地致密；25d后，菌落直径22mm，深锈色，中间隆起，裂开，边缘有缺刻，无气生菌丝，菌落背面深赭色，有放射状条纹（图2）。
3 结论
红腐乳汁接种到含乙醇的麦芽汁中长出的菌产红色色素、菌丝致密、成团生长，初步判断为红曲菌，再用含乳酸的大米培养基筛选祛除杂菌。这与红曲菌的生态习性有关，同时也证实了在PH2.5和高达10%乙醇的培养条件下一般只有红曲菌才能生长。将分离菌株的显微形态特征与红曲菌(Monascus)的属征［1］相对比，两者基本吻合，进一步证实我们所分离的纯培养M-1、M-3确为红曲属真菌。将纯化后的分离菌株点种到MEA培养基，25℃培养，观察其菌落生长形态特征，对照李钟庆等的红曲菌属分类检索表［1］，将M-1菌株鉴定为丛毛红曲菌（Monascus.pilosus），M-3菌株鉴定为红曲红曲菌（Monascus.anka）。这不仅丰富了红曲菌种库，而且为进一步发掘红曲菌生物资源奠定基础。
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