细胞遗传学检验范文1
关键词：彗星实验；叠氮钠；小麦（triticum aestivum linn.）；遗传损伤
中图分类号：x173；s512.1 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）07-1502-03
目前，致突变物的检测是环境监测的重要内容之一。过去大量采用微核试验、染色体断裂和ames实验，但是这些方法都是在大量烦琐试验的基础上建立起来的，且花费高，不利于广泛采用[1]。彗星实验（comet assay）又称为单细胞凝胶电泳（single cellgel elelectrophoresis，scge），最早由ostling等[2]提出。彗星实验可以定量检测真核细胞中的多种dna损伤，如单、双链断裂，碱性不稳定位点，不完全切除修复位点和dna交联等[3]。在之前的研究中，彗星实验多是利用动物细胞dna的损伤检测环境污染物质的致突变性和基因毒性，直到1996年koppen等[4]第一次报道了利用植物为材料进行彗星实验检测环境污染物质对基因的损伤。此后不断有人利用植物彗星实验进行环境致突变物的检测[5]，表明植物彗星实验和动物细胞彗星实验一样可靠，提供了环境污染检测的一种手段，但是对叠氮钠遗传损伤研究以微核居多，尚未有文献应用叠氮钠进行彗星实验研究其毒性。本研究以小麦（triticum aestivum linn.）为材料，应用植物彗星实验技术初步研究了叠氮钠对小麦叶片细胞dna的损伤，以期为慧星实验进一步应用于植物基因毒性检测提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料 小麦品种由南阳师范学院生命科学与技术学院遗传学实验室提供。
1.1.2 药品 叠氮钠（nan3）、无水乙醇、氯化钠（nacl）、氢氧化钠（naoh）、乙二胺四乙酸二钠（na2-edta）、重铬酸钾（k2cr2o7）、溴化乙锭（eb）、三羟甲基氨基甲烷（tris）、二甲基亚砜（dmso）、正常熔点琼脂糖（nma）、低熔点琼脂糖（lma）、trtionx-100、纤维素酶、果胶酶、去离子水等。
1.1.3 主要仪器 nikon荧光显微镜（中英昆虫生物学联合实验室提供）、dyy-8c电泳仪、单面磨砂载玻片、盖玻片（24 mm×50 mm）、移液枪及枪头（各种规格）、离心管（各种规格）、恒温水浴锅、恒温培养箱、手动计数器、玻璃培养皿、烧杯、锥形瓶、玻璃棒、容量瓶、剪刀、纱布、滤纸、冰箱、吹风机等。
1.2 方法
1.2.1 小麦叶片的处理和细胞核分离 采用去离子水无污染基质培养的小麦叶片，将其下端浸入浓度0（ck，用0.1 mol/l、ph 6.8的磷酸缓冲液浸泡）、100、500、1 000、2 000 mg/ml的nan3溶液，于黑暗中25 ℃下处理4 h或过夜。处理结束后，取出叶片置于已在冰上预冷的无菌玻璃培养皿中。为避免光线对结果的影响，所有操作均在暗光或红光灯下进行。叶片冷冻10 min后采用机械分离的方法获得细胞核[6，7]，向培养皿加入一定体积的磷酸缓冲液，用无菌刀片在该缓冲液中轻轻将小麦叶片顺叶脉切开并轻轻转动培养皿，收集冲洗液于无菌的1.5 ml离心管中，加入2%纤维素酶和果胶酶溶液在55～65 ℃下反应约5 min，使叶片细胞核进入缓冲液获得细胞核悬液[8]。
1.2.2 电泳胶板制作 大多数实验常用“三明治”型3层凝胶结构，但有文献指出3层凝胶结构容易脱落[9]，经多次预实验，本实验采用2层凝胶结构。第一层为正常熔点的琼脂糖，第二层是低熔点琼脂糖和细胞核悬浮液的混合层。先制备第一层琼脂糖，将用95%乙醇浸泡过夜的单面磨砂载玻片干燥后水平放于滤纸上，用移液枪及预热至85 ℃的无菌枪头取预热至65～75 ℃的浓度为0.65%的正常熔点琼脂糖100 μl于载玻片上，迅速盖上洁净的盖玻片使其凝固，以获得黏附力强、均匀一致的琼脂糖层[10]。第一层琼脂糖准备好以后，将其放入4 ℃冰箱中预冷，待其凝固后取下盖玻片。取小麦叶片细胞核的悬浮液与预热至37 ℃的1%低熔点琼脂糖按1∶3（v/v，总体积为100 μl）混合均匀，滴在上述准备好的载玻片上，迅速盖上洁净的盖玻片，再放置到4 ℃下使其凝固。
1.2.3 细胞裂解 小心移去盖玻片，用吹风机小心垂直轻吹胶板平面，使残余
水分蒸发除去，以免裂解时胶面脱落。将载玻片置于无菌平皿中，轻轻加入预冷的新配制的细胞裂解混合液（ph>13）浸没玻片，在常温下裂解1 h或过夜[11]。小心取出载玻片，用去离子水轻轻漂洗2～3次，动作要求轻柔，以免胶面脱落。
1.2.4 dna解旋 将载玻片置于水平电泳槽阳极端，并列放置，不留空隙。倒入新配制碱性电泳缓冲液覆过载玻片0.25 cm，放置20 min，使dna变性解旋和产生，使dna断链在电场中易于迁移。
1.2.5 电泳 变性结束后在稳压35 v、200 ma下电泳30 min。
1.2.6 中和 电泳结束后取出玻片用去离子水冲洗3次，并用滤纸吸去多余的水分，放入无菌小玻璃培养皿，沿皿壁加入tris-hcl（ph 7.5）缓冲液，将载玻片淹没15 min，再将tris-hcl吸去，用滤纸将皿内液体吸干再缓缓加入无水乙醇，将载玻片浸埋1 h，吸去乙醇，晾干或室温下过夜。
1.2.7 染色与观察分析 每个载玻片加入30 mg/ml的溴化乙锭溶液50 μl染色20 min后，用nikon 荧光显微镜在绿激发光下观察，用随机软件在自动曝光条件下用冷ccd拍照并获取彗星图像[12]，每张载玻片观察25个细胞，一个处理做4张玻片，一个处理共计观察100个细胞，计下拖尾细胞数，求出细胞拖尾率，以x2检验其显著性，同时用casp软件分析各组平均尾长和标准差，以t检验检测其显著性，分析评价dna的损伤程度。 2 结果与分析
2.1 不同浓度叠氮钠溶液处理的小麦叶片彗星图
不同浓度叠氮钠溶液对小麦叶片dna损伤结果如图1所示。图1a为对照，叶片细胞dna基本上未发生损伤，在荧光显微镜下观察，只有一个圆形的荧光头，没有拖尾；图1b至图1e为不同浓度叠氮钠溶液处理后的彗星图，发生了不同程度的拖尾，但因放大倍数过小图像不甚清晰。从图1可以看出，随着叠氮钠溶液的浓度逐渐增大，dna受损也愈重，产生的断链或断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的dna量愈多，迁移的距离愈长，表现为彗星尾长增加和彗星尾部荧光强度增强。
2.2 不同浓度叠氮钠溶液处理的小麦叶片细胞dna迁移效应
casp软件分析测定结果见表1。由表1可知，浓度为100～2 000 mg/ml的叠氮钠溶液处理的细胞出现较多拖尾，拖尾率高，各处理与对照相比差异达极显著水平。对照有7.3%细胞有拖尾现象，在理想条件下，对照细胞不发生拖尾现象，但细胞本身的状态，以及操作中的一些细微损伤都可造成部分细胞发生拖尾，只要对照组细胞和处理组细胞其他处理条件相同，这些误差可忽略不计，即对照细胞发生拖尾在彗星实验允许范围之内[13]。彗星尾长随叠氮钠溶液浓度的增大明显增长，说明叠氮钠溶液剂量越大对叶片细胞dna的损伤越严重，各处理与阴性对照差异均达极显著水平（表1）。进一步对叠氮钠浓度（x）与彗星尾长（y）的关系进行分析，数据经计算机曲线拟合，二者符合有截距的线性模型（图2）：y=0.168 5x+152.8，r2=0.780 8，说明叠氮钠对叶片细胞dna损伤存在明显的剂量效应关系。
3 讨论
以上结果表明，叠氮钠毒性与小麦细胞dna损伤存在线性关系，具有明显的遗传损伤毒性，彗星实验可以利用植物细胞快速检测环境中对遗传物质有毒性的物质，是一种快速、简单、直接检测dna损伤的手段。
林爱军等[5]利用彗星实验研究镉对小麦叶片的dna伤害，初步建立了植物彗星实验系统，得到了较好的结果。本研究利用叠氮钠建立植物彗星实验系统，由于实验条件的差异，彗星实验对各种条件的变化比较敏感，各种处理条件的变化直接影响实验最终结果，因此本实验参数有待进一步优化。
采用的材料小麦是世界上总产量第二的粮食作物，也是我国主要的粮食作物之一，其质量和产量对农业生产具有重大意义，小麦的良种选育也是当前农业生产的重要问题。在遗传良种引种工作中，对引种环境的风险评估是一项很重要的工作，环境条件直接限制良种遗传性状的表达，而彗星实验对环境细微dna损伤比较敏感，为我们进行环境检测评估提供了一种可靠而简便快速的方法。
植物细胞检测系统的结果外推于人类时，由于植物细胞与人类细胞在结构和生化代谢各方面差距甚远，诱变剂进入靶分子的方式及作用机理不甚相同，因此实验研究还有待于结合相应的病理学调查。但是彗星实验技术具有特殊优点有着广泛的应用前景，并且实验所用材料属于真核生物，更能直接推测诱变物质对人类或其他高等生物
的遗传危害，是一种比较理想的遗传毒理学检测方法。
参考文献：
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细胞遗传学检验范文2
人类的免疫系统极其复杂，各种白细胞和传递信号的蛋白质在血管中巡逻，时刻准备对抗可能的外来侵略者。每个人的免疫系统都是由数百种细胞和蛋白质以某种独特的比例组成，不同人之间的这一比例均存在细微的差别。尽管科学家们早已发现免疫系统能够通过自我调节适应环境，但它同时也会受到基因的影响。
斯坦福大学免疫学家马克・戴维斯（Mark Davis）带领的团队采用了双胞胎实验法来研究先天因素和后天因素对免疫系统的影响。他们征集了210对年龄在8岁到82岁之间的同卵和异卵双胞胎，采集了他们的血样并检测了200多个免疫系统相关指标，其中包括95种免疫细胞和51种蛋白质。由于同卵双胞胎的基因基本一致，而异卵双胞胎只有一半基因相同，如果某种特质具有遗传性，同卵双胞胎遗传这种特质的概率将大于异卵双胞胎。
戴维斯团队于1月15日在《细胞》杂志网站上发表报告称，研究显示，同卵双胞胎的免疫系统存在显著差异，这是基因决定论无法解释的：在四分之三的检测指标中，环境因素的影响要大于遗传因素，并且一半的检测指标没有显示出遗传因素在其中起作用。此外，年龄较小的双胞胎之间的相似性大于年龄较大的双胞胎，这说明当双胞胎年龄渐长，接触到不同外界环境后，其免疫系统的差异日趋增大。
研究人员还对双胞胎进行了流感疫苗实验，以了解基因在其中的作用。一些人对疫苗的反应比别人更强烈，能制造出更多抗体。如果这一特质具有遗传性，那么同卵双胞胎应当有相似的反应。但实际上，这种反应的差异完全由环境造成，据推测这与双胞胎接触过的流感病毒株种类有关。
此外，科学家们也研究了巨细胞病毒对免疫系统的影响，这种病毒广泛潜伏在大部分人体内，但很少引发症状。当一对同卵双胞胎中的一个感染了病毒，而另一个没有感染的时候，他们免疫系统的差异性大于均未感染病毒的双胞胎。巨细胞病毒几乎对60%的检测指标都有所影响。戴维斯说，这是环境影响免疫系统的有力证据。
并未参与该研究的纽约洛克菲勒大学免疫学家让-劳伦・卡萨诺瓦（Jean-Laurent Casanova）认为这项研究成果是该领域的突破性进展。
细胞遗传学检验范文3
实验方案包括实验题目、实验的理论依据、实验的基础要求、详细的实验步骤、可能遇到的困难及解决方案、预期的实验结果、老师的评审意见。实验方案经老师讨论批准后，学生按实验方案所需的材料、试剂和仪器等用品申请单，主管教学老师审批签字后，交实验带教老师购买，领取实验用品后按照实验方案开始实施实验，对实验过程中存在的问题及时调整，小组内讨论，必要时请老师帮助解决。认真做好原始数据的记录，对实验结果进行统计分析，最后完成实验报告。
在专业课的自主设计性实验中，我们综合细胞生物学、遗传学、生物化学等系统理论基础，利用组织细胞培养技术、形态学技术、生物化学检验技术、分子生物学技术，结合临床检验基础、临床血液学检验、临床免疫学检验及临床微生物学检验等其他医学检验专业课的知识，设计实验方案，遵循“科学性、自主创新性、可行性、实用性”的原则，设计了一系列实验，如人外周血淋巴细胞的培养及染色体G－显带制备方法、成纤维细胞生长因子21影响因素、烯霉毒素诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究、新生豆芽中酶含量的测定、洗涤剂中磷含量的测定、维生素C及抗生素对血液及尿液生化物质测定的干扰、竹纤维物品抑菌作用、林蛙油对肝纤维化的影响的组化免疫，这些自主设计性实验无论是在临床检验工作中还是在医学科学研究中都是一些基础实验，同时也贴近生活，富有意义。自主设计实验不仅激发了我们主动参与实验的热情，培养创新意识，提高动手操作和独立思考的能力，把所学的知识运用到实践中，融会贯通，而且通过小组内成员的团结协作、相互配合，培养了团队意识，增强了医学检验专业学生的责任感和主人翁意识，在整个实验过程中，小组内的每个成员都努力完成自己的任务，这一点对于我们今后的学习工作有着重要的意义。
在自主设计性试验中，我们充分利用已掌握的知识和技能对自己感兴趣的题目自主设计，亲自动手，从平时被动地按照实验指导机械地完成实验操作转变为主动设计实施实验，最终得到实验结果，分享实验成功的喜悦。同时我们将实验结果发论文形式报告并向杂志投稿，有的一个实验小组发表了4篇文章。我们小组在自主设计性实验中，选择了“人外周血淋巴细胞的培养及染色体G－显带制备方法”这个题目，确定了实验题目后，我们通过查阅文献资料，初步拟定了实验方案，经指导老师的审阅和修改后，进一步完善实验方案。这个实验主要利用细胞培养技术和形态学技术，而且所需的实验器材与试剂、仪器设备实验室都能够提供。染色体显带技术在临床中对于遗传性疾病和恶性血液病的诊断举足轻重，临床上已用于疾病的诊断、分型、治疗方案的选择，在预后判断和微小残留病灶的检测方面发挥着越来越重要的作用，然而在遗传学和临床血液学检验实验课中却没有安排这一实验，所以我们选择本实验来补充我们检验专业的基础技能实验。在充分完成实验准备(包括试剂的配制、器材的清洗和高压灭菌)后，分别采集小组成员的静脉血加入植物凝集素在体外培养，72h后加入秋水仙碱应用液后经离心、低渗处理、固定、Giemsa染色后在显微镜下观察淋巴细胞有丝分裂中期的染色体。当小组成员在显微镜下看到自己的染色体时，兴奋、自豪和喜悦的心情无以言表。
21世纪是生命科学的世纪，而分子生物学是当今生命科学研究领域的前沿与核心，在分子水平上揭示生命现象的本质有力地推动了生命科学向前发展。分子生物学研究的基础就是染色体中的遗传物质，之前的许多课程都已经接触到了染色体，但一直都停留在感性认识，通过这次实验我们有了切身的体会:一条小小的染色体竞包含了庞大的遗传信息，控制着复杂而精细的生命活动，生命的奥秘如此神奇。在这一实验中，我们没有采用先经过淋巴细胞分离后再进行培养这一步骤，大胆创新，直接将静脉全血在体外培养以获得有丝分裂中期的细胞，考虑到淋巴细胞占外周血的比例非常少，而且分离步骤繁琐，尚需要分离液，分离效果不佳，容易丢失，最终导致实验失败。通过简化实验步骤，节约了实验成本，取得了预期的实验结果。自主设计性实验以学生为主体，在老师的指导下，设计并实施自己的实验方案。通过自主设计性试验，丰富了我们专业实验课程，充分调动了我们学习的积极性和主动性，培养创新思维，提高我们的综合素质和团队协作精神，使我们初步具备了科研能力和科学素养，让每一个同学都获益匪浅。
作者：霍毅 明盛金 李俊 尹彬彬 郝峰 王杰 李艳 单位：吉林医药学院检验学院
细胞遗传学检验范文4
【摘要】 目的 采用小鼠淋巴瘤细胞试验(MLA)和小鼠骨髓微核试验(MNT)研究麦冬水煎剂的遗传毒性。方法 在MLA中，3.36、6.73、13.45、26.90 mg(原药材)/mL 4个浓度组在非代谢活化(-S9)和代谢活化(+S9)条件下与L5178Y细胞作用3 h，表达2 d，制备突变频率平板并培养12 d，计数大、小细胞集落的孔数，计算总突变率(MF)和小集落突变百分率(SC%)；在MNT中，每组10只ICR小鼠，雌雄各半，13.35、6.68、3.34 g(原药材)/kg 3个剂量组间隔24 h灌胃给药2次，制作骨髓涂片，计数每只小鼠2 000个嗜多染红细胞中含微核的嗜多染红细胞数，计算每组动物嗜多染红细胞微核率的平均值。结果 MLA4个浓度组在+/-S9条件下诱发的MF呈现剂量相关性增加，与阴性对照组比较有统计学意义(P＜0.01)，SC%与阴性对照组相仿；MNT各剂量组未显示骨髓抑制作用，诱发的微核率与阴性对照组比较未见明显增加。结论 麦冬水煎剂在+/-S9条件下均可诱发L5178Y细胞tk位点突变，提示其可能存在诱变物质；但该供试品对小鼠骨髓细胞染色体无损伤，经体内代谢活化后未显示遗传毒性作用。
【关键词】 麦冬水煎剂；淋巴瘤细胞试验；骨髓微核试验；遗传毒性；小鼠
Abstract：Objective To investigate genotoxicity of Radix Ophiopogonis decoction by Mouse Lymphoma Assay (MLA) and Mouse Bone Marrow Micronucleus Test (MNT). Methods In MLA， four dose levels of 3.36， 6.73， 13.45， 26.90 mg (crude drug)/mL was exposed with L5178Y cells for 3 hours with and without metabolic activation (+/-S9)， then expressed for 2 days. The mutation frequency plates were prepared and incubated for 12 days. Colony size in each plate was scored， and the total mutation frequency and the percentage of small colony mutants were calculated and analyzed. In MNT， contained three groups of 3.34， 6.68， 13.35 g (crude drug)/kg and 10 ICR mice (5 males/5 females) in each group， the mice were given every 24 hours by oral gavage twice and sacrificed after 24 hours of the last dosing， both femur bones were collected to prepare the smear. For each mouse， the number of micronucleated polychromatic erythrocytes (MNPCE) in 2 000 polychromatic erythrocytes was counted， and the mean rate of MNPCE in each group was calculated. Results In MLA， the total mutation frequency of dose levels showed a dose-dependent increase， there was statistical significant (P＜0.01) compared with negative control， and the percentage of small colony mutants was similar with negative control in the absence and the presence S9. In MNT， the decoction did not show inhibitory effect for bone marrow， and the rate of MNPCE induced in each group did not show significant increase comparing with negative control. Conclusion Radix Ophiopogonis decoction can induce tk gene mutation in L5178Y cells with and without metabolic activation， it hints that the test article may have potential genotoxicity for human bodies. Radix Ophiopogonis decoction did not show chromosome damage of bone marrow cells in ICR mice， it has no genotoxicity in vivo with metabolic activation.
Key words：Radix Ophiopogonis decoction；lymphoma assay；bone marrow micronucleus test；genotoxicity；mice
麦冬具有养阴生津、润肺清心的功效，用于肺燥干咳、虚劳咳嗽、津伤口渴、心烦失眠、内热消渴、肠燥便秘及咽炎等多种疾病的治疗。为使麦冬列入法国药典，进入法国销售市场，笔者受中法草药工作组之托、按照合作项目要求，在GLP管理体制下[1]，采用国内外遗传毒性试验指导原则[2-3]推荐的标准组合中的小鼠淋巴瘤细胞试验(MLA)[4]及小鼠骨髓微核试验(MNT)[5]对麦冬水煎剂进行了遗传毒性研究。
1 材料
1.1 供试品
麦冬原药材由中国药品生物制品检定所中药室采购，水煎剂由北京同仁堂科技发展股份有限公司制备。麦冬水煎剂为棕色液体，试验前于4 ℃冰箱、避光保存。MLA检测用原液浓度为2.69 g(原药材)/mL；MNT检测用原液浓度为2.67 g(原药材)/mL。
1.2 阴性(溶媒)对照品
MLA使用本中心PWU-400超纯水机生产的超纯水，121 ℃、15 min高压灭菌，4 ℃冰箱保存；MNT使用市售氯化钠注射液，批号07070641，购自天津药业焦作有限公司。
1.3 阳性对照品
MLA的非代谢活化(-S9)试验使用甲基甲烷磺酸酯(MMS，批号12K3671)；代谢活化(+S9)试验及MNT使用环磷酰胺(CP，批号91K1176)；均购自Sigma公司。
1.4 细胞
小鼠淋巴瘤细胞L5178Y tk+/--3.7.2C，引自日本国立医药品食品卫生研究所，液氮保存；细胞复苏后进行了支原体检查及自发突变细胞清除和自发突变率检测，合格细胞传代5次以内使用。
1.5 动物
ICR小鼠50只，雌雄各半；微生物级别：VAF；北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK(京)2007-0001。动物购入时周龄：7～8 周；体重：雌21.8～26.4 g，雄27.1～31.5 g；动物购入后于本中心动物管理室检疫驯化5 d。
1.6 培养基、试剂与染液
小鼠MLA使用：①完全培养基由RPMI 1640培养基(GIBCO)、0.2% w/v NaHCO3(北京化学试剂公司)、1%青链霉素混合液(KeyGEN)、丙酮酸钠(Amresco，终浓度200 μg/mL)配制而成，根据用途不同分为含10%马血清(传代培养)、含20%马血清(96孔板培养)和不含马血清(清洗、稀释)的培养液。②突变选择剂三氟胸苷(TFT，终浓度3 μg/mL)，批号41K1144，购自Sigma公司。③代谢活化剂S9(由苯巴比妥钠与β-萘黄酮联合诱导处理大鼠肝而获得，本中心自制)，实验当日与180 mg/mL的Glucose-6-Phosphate、25 mg/mL的NADP、0.15 mol/L的KCl等辅助因子溶液，按2︰1︰1︰1(mL)的比例配制成S9混合液，1 h内使用。S9在处理液中的终浓度为2%。
小鼠MNT使用：①胎牛血清(天津市川贝生化制品有限公司)；②甲醇(北京化工厂)；③Giemsa Stain (Sigma)，临染色前用1/15 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.8) 配制3% Giemsa应用液；④吖啶橙(Fluka)，临染色时将0.1%吖啶橙染液与1/15 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.8)按1∶15的比例配制成应用液。
转贴于 2 方法
2.1 小鼠淋巴瘤细胞试验
参考文献[5，7-8]方法，以供试品原液浓度，即终浓度26.9 mg(原药材)/mL作为最高测试浓度，再设13.45、6.73、3.36 mg(原药材)/mL共4个浓度组，同时设阴性对照组(1%超纯水)和阳性对照组(-S9：MMS，终浓度10 μg/mL；+S9：CP，终浓度2 μg/mL)，每组平行2支处理管，每管20 mL处理液在-S9、+S9条件下检测。各组处理液与对数生长期的细胞于37℃振荡培养箱中作用3 h，然后置37 ℃、5%CO2孵箱培养表达2 d，期间每日进行细胞计数及密度、增殖率(DCG1、DCG2)的计算，进而求算相对悬浮生长率(RSG)；表达d0、d2，各组制备检测平板效率PE0、PE2的96孔平板各2块(阴性对照组4块)，置37 ℃、5%CO2孵箱培养11～12 d，培养结束计数含细胞集落的孔数，计算PE0和PE2、细胞相对存活率(RS0和RS2)、总相对生长率(RTG)；表达d2各组制备检测突变频率的96孔平板各4块(阴性对照组8块)，置37 ℃、5%CO2孵箱培养12 d，培养结束分别计数含大集落(LC)、小集落(SC)和大小集落(LC/SC)并存的孔数，计算总突变率(MF)及小集落突变百分率(SC%)；采用“Poisson分布两样本均数的比较”对组间微核率进行统计学分析以协助对结果的判断。
2.2 小鼠骨髓微核试验
参考文献[5，8]方法，以供试品的最大技术给药浓度13.35 g(原药材)/kg为高剂量组，6.68、3.34 g(原药材)/kg分别为中、低剂量组，剂量分别是《中华人民共和国药典》(一部)[9]推荐的每日最大人用量的66.75、33.38和16.69倍，同时设立氯化钠注射液阴性对照组和CP(40 mg/kg)阳性对照组；给药体积均为10 mL/kg。给药首日采用分层随机化分组法分组，每组10只小鼠，雌、雄各半，首次给药时动物体重：雌25.2～28.7 g，雄32.4～36.4 g。各剂量组及阴性对照组间隔24 h灌胃给药2次，末次给药24 h后处死动物；阳性对照组单次腹腔注射给药，24 h后处死动物。采用CO2吸入法将动物处死后即取双侧股骨，用胎牛血清将骨髓冲下，涂片，甲醇固定，Giemsa、吖啶橙分别染色；采用盲法制、阅片。显微镜下计数每只动物的Giemsa染色标本中200个总红细胞(ERY)所含的嗜多染红细胞(PCE)数，计算每组动物PCE/ERY比例的平均值与标准差，求算给药组PCE/ERY的比例与阴性对照组的比率；荧光显微镜下计数每只动物的吖啶橙染色标本中2 000个PCE中含有微核的PCE数，计算每组动物的嗜多染红细胞微核率(MNPCE‰)的平均值与标准差，采用“Poisson分布两样本均数的比较”对组间微核率进行统计学分析，以协助对结果的判断。
3 结果
小鼠淋巴瘤细胞试验结果见表1、表2。表1、表2示：+/-S9条件下各浓度组的细胞生存率均在40%以上；4个浓度组诱发的MF呈现剂量相关性增加，与阴性对照组比较有统计学意义(P＜0.01)；SC%与阴性对照组相仿；阴性对照组的PE0、PE2、MF均在本试验室的背景数据范围内(PE0：50%～150%；PE2：90%～200%；MF：150×10-6～300×10-6)；阳性对照组诱发的MF与阴性对照组比较有统计学意义(P＜0.01)，并以小集落突变体为主。表1 -S9条件下麦冬水煎剂小鼠淋巴瘤细胞试验结果（略）注：RSG%＝(DCG1×DCG2)treatment/(DCG1×DCG2)N.C ；DCG1＝细胞密度d1/细胞密度d0；DCG2＝细胞密度d2/细胞密度d1；PE0(2)＝-ln(EW/TW)/1.6，EW：empty well；TW：total well；RS0(2)＝(PEtreatment/PEN.C)×100%；RTG＝RS2×RSG×100%；MF(×10-6)＝-ln(EW/TW)/2000/PE2；SC%＝(SC+SC/LC)/ (LC+SC+SC/LC)×100%；与阴性对照组比较，*P＜0.01(下同)表2 +S9条件下麦冬水煎剂小鼠淋巴瘤细胞试验结果（略）
小鼠骨髓微核试验结果见表3。表3 麦冬水煎剂小鼠骨髓微核试验结果（略）
4 讨论
MLA是一种具有高灵敏度、能够检测tk基因突变和染色体畸变两类终点的体外致突变试验，在国际上受到广泛应用。一般认为，大集落突变体的基因损伤多局限于胸苷激酶tk+/-位点，即小范围的点突变；小集落突变体是由较大范围的染色体改变(染色体断裂、缺失、重组或分离异常等)所致。本试验结果表明，麦冬水煎剂在+/-S9条件下均可诱发L5178Y细胞tk+/-位点突变，但活化后的致突能力有所减弱。提示麦冬内可能存在诱变物质。MNT显示，麦冬水煎剂对ICR小鼠骨髓细胞染色体无损伤效应，表明其经体内代谢后无明显遗传毒作用。MNT是传统而经典的检测染色体断裂剂、纺锤体毒物及非整倍体诱导剂的体内致突变试验。体内试验具备与人体应用相关的吸收、分布、代谢、排泄等，其中体内代谢相对于体外试验中的代谢系统与人体更具有相关性。
对于麦冬水煎剂，本研究得到体内试验阴性而体外试验阳性的结果，这种差异可能来自体内外试验生物系统、代谢途径等差异：体外形成的代谢产物未必在体内形成；活性代谢产物可能在体内迅速被解毒而体外则不能；受试物在体内可迅速、有效地被排泄等[4]。
笔者还曾采用Ames试验在+/-S9条件下检测麦冬水煎剂的致突变性，得到在非抑菌浓度167 mg/mL以下对4株标准菌株TA97a、TA98、TA100和TA102全部诱变阴性的结果(资料未发表)。对于麦冬的遗传毒性，尚需进一步研究和探讨。
参考文献
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细胞遗传学检验范文5
1生物分析原理
将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放入样品管，在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动，流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品在喷嘴附近组成一个圆柱流束自喷嘴的圆形孔喷出，于水平方向的激光束垂直相交，相交点成为测量区。染色的细胞经激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被呈90℃角方向放置的光电倍增管荧光检测器和向前角放置的光电二级管散射光检测器接收，经转换器转换或电子信号后，经模/数转换输入计算机，计算机通过相应的软件储存，计算，分析这些数字化信息，就可得到细胞的大小活性，核酸含量，酶和抗原的性质学物理和生化指标。
2细胞分选原理
在压电晶体上加上频率为30kH2的信号，使之产生同频率的机械振动，流动室也就随之振动，于是通过测量区的液柱断裂成一连串均匀的液滴。由于各类细胞的特性信息在细胞形成或液滴以前在测量区已被测定，并储存在计算机中，因此当某类细胞特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以标定的电荷，而不符合分选条件含细胞悬液滴及不含细胞的空白液滴不被充以特定电荷。带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转和向右偏转。落入指定的搜集器内，不带电的液滴不发生偏转，垂直落入废液槽中被排出，从而达到细胞分类，收集的目的。
3主要性能指标
荧光测量的灵敏度：流式细胞技术均可检测到
分辨率：分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV表示，流式细胞仪最佳状态CV
流式细胞仪的分选速度为：3000个/s～6000个/s。大型仪器可达每秒几万个细胞。
4流式细胞技术的临床应用与分析
流式细胞仪是今年来发展起来的现代细胞学分析技术中的常用仪器。它具备快速，准确量，化学特性。目前已广泛应用于免疫学，细胞生物学，血液学，肿瘤学，病理学，遗传学，临床经验学多领域。
4.1FCM在免疫学中的应用
流式细胞术是在细胞分析和分选的基础上发展起来的一种新的细胞参数计量技术。它以其快速灵活和定量的特点，广泛应用于免疫学理论研究和临床实践：有现代免疫技术基石之一之称。尤其同单克隆抗体的结合应用，在淋巴细胞及其亚群分析，淋巴细胞功能分析，免疫分型，分选，肿瘤细胞的免疫检测，机体免疫状态的监测，免疫细胞系统发生及特性研究等方面都起着相对重要作用。
4.2在血液学中的应用
血液病多为肿瘤性，免疫性和遗传性疾病，恶性血液病约占总数的一半以上，流式细胞仪（FCM）在血液病及淋巴瘤的发病机制，诊断治疗和预后判断学方面都具有重要价值。
白血病患者的异常细胞在分化过程中受外因，内因或突变等因素的影响曾克隆性异常增殖。白血病的免疫分型是选择化疗方案和判断预后的重要依据。FCM结合单克隆抗体的应用对白血病经行免疫分型。可以提高白血病分型诊断的符合率。可为指导治疗和判断预防提供帮助。
4.3流式细胞技术在细胞生物学中的应用
流式细胞技术在细胞生物领域内的应用，是流式细胞仪在基础研究中应用范围最广的领域。目前细胞生物学研究中，应用最频繁也是最普通的是细胞周期分析，包括细胞周期个时期的百分比和细胞周期动力学参数的测定内容。在方法学上除一般的化学染色方法外还有抗溴脱氧脲嘧啶核苷单克隆抗体技术，对同一细胞的参数测定技术则导致了对细胞周期的一些新发现，典型的方法是吖啶橙双染技术，这个技术不仅可以进行细胞周期分析，而且给细胞周期的研究带来了一些新的概念。流式细胞测量术和分选术在染色体，，和精细胞的研究及遗传学，分子遗传学也都有用武之地。
4.4流式细胞术在肿瘤学中的应用
流式细胞仪在肿瘤学研究方面已成为重要手段之一。近年来引起肿瘤研究者的极大关注。对于制定近年来荧光细胞化学技术的发展以及荧光探针标记单克隆抗体为流式细胞技术研究各种肿瘤抗原，肿瘤蛋白，致癌基因开辟了新途径，极大地提高了肿瘤研究水平，并为流式细胞技术在肿瘤学研究中开辟了更广阔的应用前景。
4.5流式细胞技术在AIDS病检测在的分析
流式细胞术用AIDS病免疫功能的检测的重要手段，采用参数荧光标记计数可对T淋巴细胞及亚群经行分析并通过动态监测T细胞亚群可以对HIV感染者或AIDS发病都进行区别。仅为HIV携带者，病毒未复制时，其Th细胞下降不明显。当发展为AIDS时Th细胞水平明显下降，如Th1细胞＜Th2细胞时，HIV在细胞间的传播和感染更敏感，易发生AIDS。同时，当HIV阳性而无症状的患者，其Tc对Tc激活剂不反应者，其体内CD+4Th细胞水平下降迅速。条件致病微生物感染率也同时增加，对Tc激活剂反应敏感者，可维持CD+4Th细胞水平降低较慢或不降低，减少发生AIDS的几率。
4.6流式细胞仪对自身免疫性疾病相关HLA抗原的分析
有些疾病的发病常与一些类型的HLA抗原检出有关，在这些疾病中，某些HLA抗原检出率比正常人群检出率高，最典型疾病是强直性脊柱炎，其外用HLA-B27表达及表达程度与疾病的发生有很高的相关性，利用FCM可以进行HLA-B27/HLA-B7双标记抗体检测HLA-B27阳性细胞，同时又排除交叉反应。通58%～97%的强直性脊柱炎患者可检出这种抗原，而正常人仅为2%～7%检出这种抗原。FCM检测HLA-B27快速，特异，敏感，为强直性脊柱炎的临床诊断提供了有力帮助。
总之，流式细胞技术在血液学，肿瘤，细胞生物学和自身免疫性疾病临床诊断治疗中具有广泛的应用价值。
细胞遗传学检验范文6
【关键词】 间隙连接蛋白；CX26；内质网应激；凋亡
耳聋是引起交流障碍最常见的疾病，新生儿中先天性重度以上耳聋的发病率高达1-3/1000，其中一半是遗传因素所致。遗传性耳聋中约30%是综合征性聋，约70%属于非综合征性聋。在非综合征性聋中，常染色体显性遗传（DFNA）约占15%，常染色体隐性遗传（DFNB）约占80%，X连锁遗传（DFN）约占3%-5%，线粒体基因突变母系遗传约为1%。在DFNB中，约占50%以上患者是由GJB2（Connexin 26，CX26）基因缺陷所致。GJB2基因缺陷还与常染色体显性遗传性聋（DFNA）和综合征性聋有关，是最常见的耳聋基因[1]。在GJB2基因中，已发现100余种突变与耳聋有关（http：//davinci.crg.es/deafness/），该基因的突变具有种族和地域特征。在高加索人种中，约50%的遗传性非综合征性聋是GJB2突变所致，编码区第35位鸟苷酸缺失（35delG）占该基因总突变的50%-86%，犹太人的突变热点是167delT，我国和日本等东亚人中最常见的突变是235delC[2-3]。GJB2基因编码的间隙连接蛋白26（Connexin 26，CX26）是间隙连接蛋白家族中重要的一员，在内耳中是K+和IP3等第二信使分子的通道，对听觉生理和病理，具有重要作用[4]。
我们以往的研究在中国人群中发现的一个新突变，该突变为无义突变（c.465 TA），导致155位脯氨酸变为终止密码子（155Tyrstop）[5]。同时我们的研究也显示截短突变后的Y155X蛋白聚集于内质网，不能正确定位到细胞膜中[5]。我们探讨异常聚集于内质网的Y155X突变体的可能的致病机制，我们在体外对Y155X突变体进行了过表达，检测内质网应激可能导致的细胞活性氧物质（ROS）的改变和对内质网应激诱导剂的敏感性改变情况。
1 材料与方法
1.1 材料 蛋白电泳及转膜设备购自Bio-Rad公司，CO2配养箱购自Forma公司，ECL试剂盒购自GE公司，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，胎牛血清（FBS）购自GIBICO公司，Anti-myc单克隆抗体、Anti-β-actin单克隆抗体均购自sigma公司，Annix-V+PI凋亡检测试剂盒和DCF-DA购自Sigma公司；HRP标记的山羊抗鼠IgG购自KPL公司，HEK293细胞株由医学遗传学国家重点实验室冻存。pCDNA3.1-CX26-Y155X-myc和pCDNA3.1-CX26 WT-myc质粒为我们前期工作中构建。
1.2 方法
1.2.1 质粒转染 按常规方法将HEK293细胞进行培养。HEK293细胞胰酶消化后按每孔2.5×105细胞数接种12孔板孔中，用DMEM+10%FBS培养于37℃，5%CO2培养箱中。待细胞生长至70%-80%汇合时进行转染，细胞转染的具体操作按Lipofectamine2000说明书进行，转染后24小时换液。
1.2.2 免疫印迹 使用2×SDS Sample buffer 裂解细胞10min，超声5s×3次（无需100℃变性）。使用BCA蛋白定量试剂盒进行定量，取20μg总蛋白上样（20μg/孔）。根据分子克隆所示方法制备8%SDS-PAGE分离胶，5%堆积胶，以80V恒压电泳。290mA，转膜2h，封闭液（5%脱脂牛奶/PBS）封闭1小时。5%BSA/PBS稀释的Anti-GFP mouse antibody室温孵育1h（1：5000）。0.1% Triton X-100/PBS洗膜10min×2次。5%BSA/PBS 稀释的Anti-mouse IgG-HRP antibody室温孵育1h。0.1% Triton X-100/PBS洗膜10min×3次，按ECL说明书配制ECL液，孵育膜5min。暗室中显影。
1.2.3 ROS检测 转染24小时后，消化细胞，用培养基重悬，加入20μM DCF-DA（Sigma，D6883）置于37℃静置30分钟。DCF-DA标记后将细胞2000×g离心10分钟（，用培养基重悬，进行流式细胞仪（Beckman-Coulter MoFLo XDP cell sorter）分析。计算平均荧光强度。以空质粒对照组的平均荧光强度作为100%，计算相对值。以3次独立实验的结果进行统计。
1.2.4 流式细胞计数检测细胞凋亡 HEK293细胞进行转染24小时，使用2mg/ml的tunicamycin处理细胞12h，用常规方法将12空板中的每一孔培养细胞（约1×106/ml）重悬于DMEM+10%FBS培养基中；用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集细胞；加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞；加入5μlAnnexin V-FITC混匀后，加入5μl Propidium Iodide，混匀；室温、避光、反应5-15min。1 消失内，进行流式细胞仪的观察和检测。用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488nm，发射波长Em=530nm。Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测；PI红色荧光通过PI通道（FL3）检测。每个实验重复三次取平均值。
1.2.5 统计学分析 利用SPSS14.0统计软件进行分析。均数间的比较采用方差分析、独立样本t检验，数据以均数±标准差（χ±s）表示。P
2 结果
2.1 免疫印迹鉴定CX26野生型和Y155X突变体的表达 由于我们构建的质粒为突变CX26与myc标签融合质粒，因此可以采用myc的抗体来检测突变CX26的表达情况。由图1可见：野生型CX26和Y155X突变体都检测到了条带，且Y155X条带较野生型低，这表明蛋白已截短。
HEK293细胞中转染pCDNA3.1-CX26-Y155X-myc，pCDNA3.1-CX26 WT-myc质粒和空载体。Myc抗体检测CX26的表达。内参为actin。
2.2 CX26-Y155X导致ROS产生增多 为了探讨CX25突变体Y155X可能的致病机制，我们使用2’，7’-Dichlorofluorescin diacetate（DCFH-DA）检测细胞内ROS的水平。过表达Cx26-Y155X的细胞内ROS的水平显著高于过表达野生型Cx26的细胞和空载体细胞（图2）。而过表达野生型CX26与空载体组ROS水平无统计学差异。这表明，过表达突变体Y155X蛋白能导致细胞内ROS水平增加，可能导致细胞死亡。
HEK293细胞中转染pCDNA3.1-CX26-Y155X-myc，pCDNA3.1-CX26 WT-myc质粒和空载体。ROS水平以空载体组进行标化（100%）。CX26 Y155X组与空载体和WT组相比具有统计学差异。**：p
2.3 CX26-Y155X增加细胞对内质网应激诱导剂的敏感性 我们以前的研究结果显示，CX26-Y155X突变体聚集在内质网，可能导致内质网应激从而诱导细胞凋亡，我们在体外检测了加入内质网应激诱导剂tunicamycin后，细胞对药物诱导凋亡的敏感性，使用流式细胞技术方法检测细胞的凋亡改变。结果显示，加入tunicamycin后CX26 Y155X突变体对其敏感性增加，导致细胞凋亡。而野生型组和空载体组在该剂量诱导下，无明显的凋亡改变（图3）。
HEK293细胞中转染pCDNA3.1-CX26-Y155X-myc，pCDNA3.1-CX26 WT-myc质粒和空载体。加入Tunicaymcin处理后，检测细胞凋亡情况。control为溶剂组。CX26 Y155X组与空载体和WT组相比具有统计学差异。**：p
3 讨论
我们以前的研究CX26的某些突变（p.R32H、p.R143W、p.R165W、p.L214P、p.Y155X、p.L214P、c.631-632delGT、c.572delT、c.235delC、35del GT）散在分布于细胞浆中，不能定位到细胞膜形成功能性间隙连接斑。并聚集于内质网，且高尔基体无分布[5]。尤其是我们新报道的突变p.Y155X聚集于内质网，提示这个CX26突变蛋白失去了从内质网被转运的细胞膜的功能，其原因可能与突变导致CX26的蛋白构象发生改变有关，这种改变引起了内质网应激和未折叠蛋白反应，或者是突变蛋白不能与从内质网转运的细胞膜的微管系统结合，最终导致细胞运输障碍，甚至引起细胞死亡。异常突变蛋白的在内质网的聚集能导致未折叠蛋白反应引起内质网应激和引发细胞死亡[6]。
蛋白质在内质网中折叠的过程伴随着活性氧簇（ROS）的产生，细胞通过谷胱甘肽（GSH）来清除这一过程中生成的ROS。当大量突变蛋白合成后，其不能正确的折叠，在分子伴侣的作用下，错误形成的二硫键被打开而再次形成二硫键，此过程会造成过多的ROS生成，这是内质网来源的ROS[7]。另外，内质网应激时，线粒体来源的ROS也会增加，其机制尚未阐明，可能与内质网钙离子释放和线粒体摄取钙有关[8]。在本研究中，我们对内质网应激可能能产生的ROS进行检测，结果显示表达Cx26 Y155X的细胞ROS显著增加，同时也增加了对内质网应激诱导剂的敏感性。这些结果提示，CX26 Y155X突变体由于异常聚集于内质网从而导致内质网应激，诱导ROS产生增多，对环境因素诱导的内质网应激更加敏感，从而增加细胞的凋亡。对遗传性耳聋最重要的致病基因—CX26突变筛查和功能的深入研究，将有助于对可能患有先天性听力损害的胎儿进行产前咨询和产前诊断，对患者和家属给出尽可能多的建议。对CX26的研究也将帮助我们更好的了解其他间隙连接通道的功能，理解其在其他疾病中的发病机制。
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