细胞增殖论文范文1
关键词：胰岛素 前脂肪细胞 增殖 分化
中图分类号：R255.4R587.1文献标识码：B文章编号：1672-1349(2011)05-0545-02
糖尿病的发病率呈现快速增长,胰岛素是糖尿病治疗中不可替代的药物。胰岛素的发展经历了动物胰岛素、基因工程人胰岛素和胰岛素类似物三个阶段。甘精胰岛素和地特胰岛素作为胰岛素类似物出现,已广泛应用于临床［1］。脂肪组织是胰岛素的重要靶器官之一,前脂肪细胞具增殖能力,且能分化为脂肪细胞,作用持续于人的一生,其增殖和分化能力影响脂肪组织的构建。本文拟比较甘精、地特和人胰岛素对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响,从而指导临床选择不同的胰岛素对糖尿病患者进行个体化治疗。
1资料与方法
1.1主要实验用品及化学试剂DMEM-F12培养基、胰蛋白酶购自Gibco-BRL公司；胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司；青霉素、链霉素购自华北制药厂；噻唑兰、二甲基亚砜、人胰岛素、甲状腺素、地塞米松、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤均购自Sigma公司；油红O染料购自Amersco公司；地特胰岛素由诺和诺德公司提供；甘精胰岛素液体和纯品由甘李药业有限公司提供。
1.2试验方法
1.2.13T3-L1前脂肪细胞的复苏准备37 ℃的温水,从液氮罐中取出冻存管,迅速投入温水中。在水中来回晃冻存管1 min左右,观察到冻存液基本融化。将冻存管中液体吸入离心管中,1 000/min离心5 min,吸弃上清,加入新的培养基,吹打均匀,使得细胞分散,以104/mL密度接种,放入CO2培养箱中培养。
1.2.2MTT法观察前脂肪细胞增殖前脂肪细胞以104/mL接种于96孔板,37℃、5%CO2培养24 h后,设对照组(含10%胎牛血清的D-MEM/F-12配制的完全培养液)和四组干预组(含10 nmol/L甘精纯品胰岛素、人纯品胰岛素、甘体胰岛素、地特液体胰岛素的完全培养液)孵育细胞,隔日一次倒置显微镜下观察细胞并作MTT比色法测增殖。
1.2.3前脂肪细胞分化过程观察前脂肪细胞以104/mL接种于96孔板,D-MEM/F-12(1∶1)基础培养基中添加0.25 μmol/L胰岛素、0.25 μmol/L地塞米松、0.2 nmol/L甲状腺素以及0.5 mmol/L IBMX作分化培养基诱导分化,设对照组(不含胰岛素)和四组干预组(含0.25 μmol/L甘精纯品胰岛素、人纯品胰岛素、甘体胰岛素、地特液体胰岛素的分化培养液),3 d后改用不含IBMX的分化培养基诱导直至14 d,隔日一次显微镜观察。用油红O染色和异丙醇抽提的方法进行细胞内脂质含量定量(以OD值表示)。
1.3统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示,用SPSS 13.0统计学软件处理。多组间应用单因素方差分析,两两之间比较采用LSD-t检验。
2结果
2.1不同胰岛素对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响3T3-L1前脂肪细胞在接种16 h左右基本完全贴壁,显微镜下观察形态类似于成纤维细胞,呈棱形、梭形或多角形,细胞核圆形,位于细胞质中央,使用油红O染色完全不能着色。接种后的第4天进入对数增长期,第10天进入增殖平台期。8 d时地特液体胰岛素抑制细胞的增殖(P
人胰岛素为胰腺β细胞合成和分泌的一种多肽激素,由A链和B链组成,A链含有2 1个氨基酸残基,B链含有30个氨基酸残基。甘精胰岛素是合成的人胰岛素类似物,对结构的改进是将人胰岛素A链21位由甘氨酸取代天冬氨酸,B链末端增加2个精氨酸［2］。地特胰岛素是一种中性的、可溶的、长效胰岛素类似物,它是通过去掉胰岛素肽链上B30位的苏氨酸并通过酰化作用在B29位的赖氨酸上结合了一个14碳的脂肪酸(肉豆蔻酸)而形成［3］。
在增殖实验中,到第8天时地特液体胰岛素开始抑制细胞的增殖直到第12天,第10天时甘精胰岛素促进细胞的增殖。Slieker 等［4］实验表明胰岛素B26-B30 分子结构的改变会影响与IGF-IR 的亲和力,最终影响胰岛素促进有丝分裂的能力。甘精胰岛素因为B链分子结构的改变使其促有丝分裂的能力强于其他胰岛素。Ashish等［6］在观察不同胰岛素对MCF7(乳腺癌细胞)增殖的影响时得出结论,在甘精胰岛素浓度为1.5 nmol/L～1.5 mmol/L时能明显促进细胞增殖,而地特胰岛素浓度在15 nmol/L～1.5 mmol/L时促增殖作用弱于人胰岛素。Mayer等［7］实验表明含甘精胰岛素的血清对MCF7促增殖作用是含人胰岛素血清的1.11倍,而含地特胰岛素的血清为含人胰岛素血清的0.99倍,这与本文得出的结论相似。
在观察不同胰岛素对前脂肪细胞分化影响的实验中,可以看到胰岛素为前脂肪细胞分化的必须试剂,在不含胰岛素的培养基中前脂肪细胞基本不分化。此外,人胰岛素促进前脂肪细胞分化的能力最强,甘精胰岛素次之,地特胰岛素最弱。胰岛素促进脂肪细胞分化是通过包含一系列胰岛素受体底物(IRSs)的信号网络实现的。最早发现体外培养前脂肪细胞的分化需要胰岛素,胰岛素可以提高前脂肪细胞的分化率,胰岛素在前脂肪细胞转化中起相当重要的作用［8］。Kristensen等［9］实验表明胰岛素分子结构的改变会影响与胰岛素受体的结合力,从而影响代谢能力。Peter等［5］也得出结论，人胰岛素与受体结合的能力最强,甘精稍弱,地特的结合能力最差,这可能与其促分化能力不同有关。Staiger 等［10］做出的实验表明小剂量的人胰岛素即可促进前脂肪细胞分化,这与本文结论相似。Anja 等［11］得出结论地特胰岛素小剂量和大剂量对前脂肪细胞分化的影响都低于小剂量的人胰岛素,这与本文结论一致；同时,地特胰岛素对前脂肪细胞分化的影响并非由于B29位结合的肉豆蔻酸改变信号转导通路造成的,机制尚不明确。
参考文献:
［1］Jeffrey SF,DO.Insulin Analog Therapy:Improving the match with physiologic Insulin secretion［J］.J Am Osteopath Assoc,2009,109:26-36.
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［3］YaredND,NaveedY,Handrean S.Therole ofinsulindetemir in overweight type 2 diabetes management［J］.Vascular Health and Risk Management,2009,5：553-560.
［4］Slieker LJ,Brooke GS,Dimarchi RD,et al.Modifications in the B10 and B26-30 regions of the B chain of human insulin alter affinity for the human IGF-I receptor more than for the insulin receptor［J］.Diabetologia,1997,40:S54-S61.
［5］Ashish S,Jean G,Volker E,et al.Analysis of signaling pathways related to cell proliferation stimulated by insulin analogs in human mammary epithelial cell lines［J］.Endocrine Related Cancer,2009,16:429-441.
［6］Mayer D,Chantelau E.Treatment with insulin glargine(Lantus) increases the proliferative potency of the serum of patients with type-1 diabetes:A pilot study on MCF-7 breast cancer cells［J］.Arch Physiol Bioche,2010,116(2):73-78.
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［8］The role of PDGF-dependent suppression of apoptosis in differentiating 3T3-L1 preadipocytes［J］.Eur J Cell Biol，1998,77(3):220-227.
细胞增殖论文范文2
目的：探讨尾加压素Ⅱ (urotensin Ⅱ, U?Ⅱ) 促进晶状体上皮细胞（lens epithelial cell, LEC）增殖的细胞信号转导机制。方法：采用U?Ⅱ与体外培养的LEC共同孵育，并用4种细胞信号转导阻断剂H7，PD98059，W7，尼卡地平 (nicardipine) 分别作用于LEC，再用3H –胸腺嘧啶（3H?TdR）掺入法检测LEC增殖的情况。结果：U?Ⅱ组LEC的3H掺入放射活性显著高于对照组(P<0.01)，4种信号转导阻断剂组的放射活性与U?Ⅱ组比较均有不同程度的降低(P<0.01，P<0.01)。PD98059 和H7 的阻断作用强于nicardipine 和W7（F= 13.251，P<0.01）。 结论：尾加压素Ⅱ促进LEC增殖是通过细胞信号转导的机制，该作用可被信号转导阻断剂所阻断。学术
【关键词】 尾加压素Ⅱ；晶状体上皮细胞；增殖；细胞信号转导；后发性白内障
Abstract?AIM：To study the mechanism on signal transduction of proliferation induced by urotensin?Ⅱ(U?Ⅱ)in lens epithelial cell（LEC）. METHODS：U?Ⅱ were incubated with cultured LEC. Meanwhile four blockers of signal transduction, H7, PD98059, W7 and nicardipine, were incubated with LEC separately. Then the proliferations of LEC were detected via 3H?TdR incorporation. RESULTS：The radioactivity of 3H?TdR in U?Ⅱ group was higher than that in control group(P<0.01). The radioactivities of 3H?TdR in groups of four blockers decreased in varying degrees compared with U?Ⅱ group(P<0.01，P<0.01). The blocking effects of PD98059 and H7 were higher than that of nicardipine and W7（F= 13.251，P<0.01）. CONCLUSION：U?Ⅱ induced LEC proliferation by means of signal trasduction which can be blocked by four signal transduction blockers. The result provides a new thinking for prevention and treatment of after cataract.
?
KEYWORS：urotensin Ⅱ; lens epithelial cell; proliferation; signal transduction; after cataract
0 引言
尾加压素Ⅱ（urotensin Ⅱ, U?Ⅱ）是一种具有多种生物学效应的新型生物活性物质。最早由Coulouarn于1998年从人体中克隆出人U?Ⅱ（human urotensin Ⅱ, hU?Ⅱ）[1]。此后的研究表明，体内多种组织中含有U?Ⅱ。U?Ⅱ不仅具有强烈的缩血管作用[2] ，而且具有促进细胞增殖的作用，可使大鼠心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞和血管平滑肌细胞等发生增殖[3]。我们曾发现眼部各组织均含有U? Ⅱ，并发现U?Ⅱ具有促进晶状体上皮细胞（lens epithelial cell, LEC）增殖的作用。后发性白内障 (after cataract)是白内障囊外摘除联合人工晶状体植入术后的主要并发症。其病理生理机制是手术后残留的LEC发生增殖、移行，使晶状体后囊膜发生混浊导致视力再度下降。我们拟探讨U?Ⅱ促进LEC增殖的细胞信号转导机制，为防治后发性白内障寻求新的途径。
1 材料和方法
学术
1.1 材料
无菌操作取健康新鲜小牛眼的晶状体前囊膜，用胰蛋白酶消化法，在37℃，5%CO2培养箱中进行晶状体上皮细胞原代和传代培养，取第3代细胞进行如下实验。hU?Ⅱ，H7，PD98059，W7，尼卡地平(nicardipine)均系美国Sigma公司产品，DMEM培养基为美国GIBCO公司产品， 3H –胸腺嘧啶（3H?TdR）购自上海原子核研究所，2,5?二苯基恶唑（PPO）及1,4?双?（5?苯基恶唑基?2）?苯（POPOP）为中国医药集团上海化学试剂公司产品，胰蛋白酶（trypsin）购自华美生物工程公司，胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，冰醋酸、二甲苯为市售分析纯产品。本研究采用CO2培养箱（美国FORMA 2111）、倒置研究显微镜（日本Olympus IMT?413）、低温冰箱（日本MDF?V5410）、真空泵（美国Nulgene EF006）、微量移液器（法国Gilson）、γ?液闪计数仪（西安FJ2003PS）。
1.2 方法
将实验分成6组，每组8个样本。对照组在LEC中加入胎牛血清和DMEM培养液。U?Ⅱ组在对照组的基础上加入终浓度为10?8mol/L的 U?Ⅱ。H7组、PD98059组、W7组和尼卡地平组分别在U?Ⅱ组的基础上加入4种细胞信号转导阻断剂，终浓度分别为H7 10?5mol/L，PD98059 10?5mol/L，W7 10?6mol/L，Nicardipine 10?5mol/L。取第3代培养的LEC并使细胞生长同步化。在CO2培养箱中继续培养12h后，按照上述实验分组，分别加入hU?Ⅱ和 H7，PD98059，W7和尼卡地平。将LEC在CO2培养箱中继续培养12h后，吸去培养液，每孔分别加入3H?TdR（其放射比活性为每孔 3.7×104个/min），继续培养12h。吸去培养液，消化细胞并用真空泵抽滤，将细胞收集于玻璃纤维膜上。于60℃,30min条件下烘干滤膜，用液闪计数仪测定 3H放射活性。
统计学分析：用SPSS 12.0统计软件分析。所有结果用均数± 标准差（ ±s）表示。各组与对照组间数据比较采用t检验，各组间数据比较采用单因素方差One?Way ANOVA分析。
2 结果
U?Ⅱ组LEC的3H掺入放射活性（个/min）显著高于对照组 (2027.4±109.1 vs 1203.8±107.6，P<0.01)，说明U?Ⅱ使LEC发生明显的增殖。4种信号转导阻断剂组的放射活性与U?Ⅱ组比较均有不同程度的降低 (1819.6±47.2，1759.1±169.0，1557.9±71.9，1442.9±192.4，P<0.01, P<0.01)，显示这4组LEC的增殖减少，表明4种阻断剂均不同程度地阻断了U?Ⅱ促进LEC增殖的信号转导途径。在4种阻断剂中，PD98059组和H7 组的放射活性显著低于W7组和Nicardipine组（F=13.251，P<0.01），表明PD98059组和H7 组对U?Ⅱ促进LEC增殖的细胞信号转导途径的阻断作用更强（表1）。表13H?TdR掺入法检测4种信号转导阻断剂对U?Ⅱ诱导LEC增殖的影响 (略)
3 讨论
U?Ⅱ是一种生长抑素样环型结构的神经肽，最早提取自鱼的尾部下垂体，1998年首次从人体克隆出来。研究表明，U?Ⅱ是具有多种生物学效应的新型生物活性物质，具有较强的促进多种细胞增殖的作用。U?Ⅱ可刺激离体培养的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)发生增殖，呈浓度依赖关系；降钙素基因相关肽、肾上腺髓质素、IL?10等均能抑制由U?Ⅱ诱导的VSMC增殖；U?Ⅱ上调VSMC内皮素基因表达并促进VSMC内皮素的合成释放；肾上腺髓质素可浓度依赖性地抑制U?Ⅱ刺激的VSMC内皮素mRNA水平的增加[4?6]。还有报道U?Ⅱ能促进实验大鼠心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞发生增殖，且在一定的浓度范围内其促增殖作用具有浓度依赖性。有关U?Ⅱ促进细胞增殖作用的细胞信号转导机制已有报道[7]，U?Ⅱ促进细胞增殖的途径与Ca2+介导的信号转导通路有密切关系。另有文献指出[8]，抑制与有丝分裂有关的多种信号蛋白分子，如c?src，PKC(protein kinase C)，CaM?PK，MAPK(mitogen activated protein kinase)，钙调神经磷酸酶(CaN)，均可在不同程度上抑制U?Ⅱ的有丝分裂效应，从而抑制U?Ⅱ刺激细胞增殖的作用。Watanabe等[9] 研究发现，PKCCaMGPCRMAPK的阻断剂可抑制U?Ⅱ对VSMC的增殖作用，从而间接表明U?Ⅱ是通过PKCCaMGPCRMAPK信号转导途径发挥其促增殖的作用。
学术
我们曾发现，眼内各组织中均有一定量的U?Ⅱ，U?Ⅱ能显著促进LEC发生明显的增殖并呈浓度依赖关系。在此基础上，我们采用3H?TdR掺入法检测4种细胞信号转导阻断剂对U?Ⅱ促进LEC增殖的影响，以探讨U?Ⅱ促进LEC 增殖的信号转导机制。这4种信号转导阻断剂中，H7是蛋白激酶C（PKC）抑制剂，PD98059是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制剂，W7是钙调素（CaM）抑制剂，尼卡地平(Nicardipine)是钙通道阻滞剂。研究结果发现，4种信号转导阻断剂均能降低LEC的放射活性、阻断U?Ⅱ促进 LEC增殖的信号转导通路，使U?Ⅱ促进LEC增殖的作用减弱。间接表明U?Ⅱ是通过DG蛋白激酶C途径、受体酪氨酸蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶途径、 Ca2+和钙调蛋白激酶途径等细胞信号转导途径发挥其促进LEC增殖的作用，从而探明了U?Ⅱ促进LEC增殖的细胞信号转导机制。
白内障囊外摘除联合人工晶状体植入手术后残留的LEC发生增殖，并移行至后囊下形成再生的晶状体结构如珍珠样（Elschnig）小体及 Soemmering环，再向成纤维细胞转化、分泌胶原形成纤维膜, 使晶状体后囊膜发生混浊，导致白内障术后视力再度下降。这是后发性白内障的主要病理生理过程。我们的前期研究发现U?Ⅱ能促进LEC增殖，提出其很可能是后发性白内障的一个重要发生机制。我们的研究结果发现，4种细胞信号转导阻断剂均能阻断U?Ⅱ促进LEC增殖的信号转导通路，使U?Ⅱ促进LEC增殖作用减弱。该结果一方面表明U?Ⅱ促进LEC增殖的作用及其细胞信号转导机制，阐明了后发性白内障发生发展的可能机制；另一方面揭示采用信号转导阻断剂可阻断U?Ⅱ促LEC增殖作用，减少白内障手术后的后囊膜混浊，提出这可能是防治后发性白内障的一个新途径。经广泛查阅国内外文献，有关U?Ⅱ促进晶状体上皮细胞等眼内组织细胞增殖的研究尚未见报道，更未见U?Ⅱ促进LEC增殖作用的细胞信号转导机制的研究报道，本研究具有一定的科学意义和应用前景。
【参考文献】
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学术
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细胞增殖论文范文3
摘要：目的：选取合适的培养条件，促进兔纤维环间充质干细胞的增殖，维持其干细胞的特性。方法：从兔纤维环中提取间充质干细胞，进行体外培养扩增。考察丙酮酸钠对干细胞集落形成能力、增殖能力、细胞形貌和分化能力的影响。结果：丙酮酸钠明显增加兔间充质干细胞的集落形成的数目；促进细胞增殖；维持干细胞的干细胞特性；同时不影响干细胞的成脂成脂分化，反而抑制细胞的自发分化。结论：丙酮酸钠可较好地促进体外干细胞增殖和干细胞特性，使在体外快速获得大量良好状态的干细胞。
关键词：干细胞培养 丙酮酸钠 细胞增殖 细胞分化
1.引言
间充质干细胞具有多向分化特性，来源广泛，可从多种组织中提取。近期一系列研究表明，在正常及轻度退变椎间盘的纤维环中都存在具有多向分化特性的细胞，能在体外培养条件下被诱导分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞，具有间充质干细胞的特征，但这些细胞的增殖能力有限1-3。
本研究从兔纤维环组织中分离出具有自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，通过改变细胞培养条件，考察其增殖能力和多向分化潜力，以期获取大量具有良好状态的干细胞。
2.材料与方法
2.1 药品与试剂
5～7月龄的新西兰大白兔由苏州大学南校区动物房获得。
DMEM-LG培养基、胎牛血清FBS、青-链霉素，购自Hyclone公司。
胰酶，购自Gibco公司。
成脂诱导培养基、成骨诱导培养基购自cyagen公司，茜素红、油红O购自Sigma-Aldrich公司。
2.2 兔纤维环间充质干细胞提取
空气栓塞法处死新西兰大白兔后，在无菌状态下快速获取椎间盘组织并将纤维环组织分离出。将组织剪碎，以I型胶原酶消化、过滤。过滤后的细胞液体离心计数后接种于培养瓶中，分别加入2种培养基进行培养。其中一种培养基为含10% FBS的DMEM-LG细胞培养液，另一种为含10% FBS和200 ug/mL丙酮酸钠的DMEM-LG细胞培养液，于37℃、5％的CO2培养箱中培养。每3天换1次液。
2.3 细胞增殖检测
将细胞按1000细胞/孔的密度接种于96孔板中，分别以无丙酮酸钠和含丙酮酸钠的DMEM-LG培养基连续9天检测细胞的增殖情况，每天6个复孔。进行MTT检测。
2.4 诱导分化检测
将两种条件下培养的细胞分别按2×104细胞/孔的密度将细胞接种于24孔板中，待细胞长到80-90%时，进行成脂分化和成骨分化。成脂诱导2周后进行油红染色。成骨诱导3周后茜素红进行染色。
3.结果
3.1 丙酮酸钠促进兔间充质干细胞集落形成
细胞悬液按一定密度接种到100 mm培养皿中后，到第3-4天即可观察到集落的产生，集落逐渐增大，到10天左右即可形成大量集落。对比有丙酮酸钠和没丙酮酸钠的培养基可发现，在相同接种密度的条件下，丙酮酸钠组形成的集落数更多，集落中的细胞数也更多。
3.2 丙酮酸钠促进兔间充质干细胞增殖
MTT增殖检测发现，细胞从第1天开始增殖，第3天开始进入对数期，第6天以较为缓慢的速度继续增殖直至第9天。对比无丙酮酸钠组和丙酮酸钠组，相同条件下，丙酮酸钠组的细胞数明显更多。
3.3 丙酮酸钠维持兔间充质干细胞的状态
在细胞形貌上，无丙酮酸钠组细胞呈现异质性，有些呈梭形，有些呈纤维细胞状；而丙酮酸钠组的细胞则相对较为均匀，均呈现梭形。在传代次数上，无丙酮酸钠组的细胞只能传3-4代，细胞即停止增殖，由原来的梭形以及纤维细胞状转变为扁平无规状细胞。而丙酮酸钠组的细胞则至少可传代到6代以上，同时细胞也仍旧保持梭形的形貌。
3.4 丙酮酸钠抑制兔间充质干细胞的自发分化
将无丙酮酸钠组细胞和非丙酮酸钠组细胞接种到24孔板中，分别进行成脂诱导和成骨诱导。在诱导组分别使用诱导培养基，对照组使用含10% FBS的DMEM-LG培养基。但是在无丙酮酸钠组，对照组的细胞易自发成脂的现象。在培养1周后即自发产生脂滴，随着培养时间的延长，脂滴逐渐增大。油红染色后，亦有明显的染色现象。但是丙酮酸钠组的细胞则自发成脂的现象明显减轻。自发成骨的现象也更弱些。
4.讨论
本研究从兔子的纤维环组织中成功分离出一群具有克隆形成能力的细胞，该细胞较好地维持了原有形态。通过在DMEM-LG培养基中添加丙酮酸钠，发现丙酮酸钠可明显促进兔间充质干细胞的集落形成及增殖速度。此外，丙酮酸钠可维持干细胞的干细胞特性，维持较为均一的梭形形态，可传代6次以上。同时不影响干细胞的成脂成脂分化，反而抑制细胞的自发分化，在组织工程中将有良好的应用前景。
参考文献：
[1]Feng， G.， et al. Multipotential differentiation of human anulus fibrosus cells：an in vitro study. J Bone Joint Surg Am 92， 675-685 （2010）.
细胞增殖论文范文4
关键词：N-乙酰-D-氨基葡糖；淋巴细胞增殖；钙调蛋白；钙调神经磷酸酶；小鼠
中图分类号：R977.6文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)07-0013-03
Effects of N-Acetyl-D-Glucosamine on Lymphocyte Proliferation of Mice in Vitro and Expression of Intracellular CaM and CaN
LI Hui, CAO Xiu-ming, JI Yu-bin, ZHANG Zhen-zhu
(Center of Research on Life Sciences and Environmental Sciences, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)
Abstract：Objective To investigate the effects of N-acetyl-D-glucosamine（N-AcGA）on the lymphocyte proliferation of mice and the expression of intracellular CaM and CaN. Methods The effect of N-AcGA on lymphocyte proliferation was observed by MTT. Flow cytometry was used to detect the expression of intracellular CaM and CaN. Results N-AcGA promoted lymphocyte proliferation of mice when the concentration was 200~50 mg/L in substrate and its effect was especially marked when the concentration was 200 mg/L. N-AcGA could increase the expression of intracellular CaM and CaN. The average positive cells percentage of CaM raised from 61.6% to 72.6% when adding N-AcGA after 72 h, while that of CaN raisedfrom 75.6% to 86.0%. Conclusion N-AcGA can stimulate the lymphocyte proliferation and the expression of intracellular CaM and CaN.
Key words：N-acetyl-D-glucosamine; lymphocyte proliferation; calmodulin; calcineurin; mice
N-乙酰D-氨基葡萄糖(N-Acetyl-D-Glucosamine，N-AcGA)是甲壳素的基本组成单位，具有消炎、抗肿瘤及抗氧化等作用，是治疗骨关节炎及风湿性关节炎的有效药物[1]。钙调蛋白（calmodulin, CaM）是Ca2+信号的主要调节蛋白或受体蛋白。而钙调神经磷酸酶（calcineurin, CaN）是在细胞信号传递中直接受Ca2+调节的关键酶，具有激活体内T淋巴细胞的作用。本研究采用MTT（溴化四唑蓝）法及流式细胞仪观察了N-AcGA对小鼠淋巴细胞的增殖和对淋巴细胞内CaM和CaN表达的影响。
1材料
1.1药品与试剂
N-AcGA（纯度高于98%，由中国海洋大学生命学院海洋活性物质研究室提供）；MTT、甲醛、甲醇、BSA、CaM一抗、CaM二抗（Santa Cruz生物技术公司）；CaN一抗、CaN二抗（Cell Signaling公司），Triton X100、ConA（美国Sigma公司）；RPMI1640培养基（GIBCO公司）。
1.2仪器
LEICA SP2型激光扫描共聚焦显微镜（德国）；EPICS XL型流式细胞仪（Backman Coulter公司）；CO2恒温培养箱（三洋公司）；恒温水浴箱（厦门医疗电子仪器厂）；酶标仪（美国Bio-red）。
1.3实验动物
BALB/c小鼠由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，雌雄兼用，体重18～22 g。
2方法
2.1N-AcGA对小鼠淋巴细胞体外增殖的影响
常规制备脾细胞悬液，台盼蓝染色计数，活细胞大于95％，调整细胞浓度为109/L，加入96孔圆底细胞培养板。刀豆蛋白A（ConA）对照组：100μL细胞悬液与100 μL1640培养液（含ConA终浓度为10 mg/L）的混合液，空白组：100μL细胞悬液与100μL1640培养液的混合液；实验组：100 μL细胞悬液与100 μL含N-AcGA（终浓度分别为200，100，50 mg/L）的1640培养液的混合液，每组设6个复孔，37 ℃，5％CO2细胞培养箱中培养72 h。MTT法[2]测定结果。
2.2N-AcGA对小鼠淋巴细胞内CaM和CaN表达的影响
如上法制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为109/L，加入24孔细胞培养板，实验组N-AcGA终浓度为200 mg/L，并设空白对照组，每组设6个复孔，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养72 h。PBS洗涤2次，用0.1~1 mLPBS重悬细胞，加缓慢加入预冷的细胞中，轻旋使甲醇的终浓度为90 %，冰浴30 min后保存于－20℃。上机前离心弃上清，用培育缓冲液（在100 mLPBS中溶解0.5 g的BSA，4 ℃保存）洗涤2~3次，每管各加100μL培育缓冲液，封闭10 min。分别在实验组加入CaM和CaN一抗，室温培育30-60 min，用培育缓冲液洗涤2次，分别加入二抗，室温培育30 min，培育缓冲液洗涤2次，重悬于1 mLPBS，流式细胞仪收集10 000个细胞，分别用阳性细胞百分率进行定量分析，重复3次。
2.3统计学处理
用SPSS11.5软件对实验数据进行方差分析。
3结果
3.1N-AcGA对小鼠淋巴细胞体外增殖的影响
结果见表1。表明N-AcGA对小鼠淋巴细胞增殖有显著的促进作用，从200~50mg/L都有显著作用，其中浓度为200 mg/L时作用极显著。
表 1N-AcGA对小鼠淋巴细胞增殖的诱导作用
*P＜0.05，**p
3.2对小鼠淋巴细胞内CaM和CaN表达的影响
结果见图1、图2。由图1、2可见，N-AcGA可以影响小鼠淋巴细胞内CaM和CaN的表达。加入N-AcGA 72 h后CaM的平均阳性细胞百分率由61.6 %上升到72.6 %，CaN的平均阳性细胞百分率由75.6 %上升到86.0 %。表明N-AcGA有诱导小鼠淋巴细胞内CaM和CaN表达的作用。
A.空白组CaM阳性细胞百分率 B.N-AcGA组CaM阳性细胞百分率
图1N-AcGA对小鼠淋巴细胞内CaM表达的影响
A.空白组CaN阳性细胞百分率B.N-AcGA组CaN阳性细胞百分率
图 2N-AcGA对小鼠淋巴细胞内CaN表达的影响
4讨论
淋巴细胞增殖实验是用于检测机体细胞免疫功能的体外实验，T淋巴细胞在体外培养时，当受到非特异性刺激物如ConA等有丝分裂原后，可刺激T淋巴细胞产生一种细胞生长因子，从而促进淋巴细胞增殖［3］。N-AcGA是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，在甲壳类动物的外骨骼含量最高，对其免疫功能的研究报道甚少。我们采用MTT法观察了N-AcGA对淋巴细胞增殖作用的影响。结果表明，加入N-AcGA组的小鼠淋巴细胞的增殖明显高于空白组，当浓度为200 mg/L时结果极显著。表明N-AcGA可以诱导小鼠脾淋巴细胞转化为淋巴母细胞从而引起淋巴细胞增殖。
Ca2+作为第二信使调控细胞内许多重要的生理和病理过程，包括肌肉收缩、细胞增殖、基因表达等。淋巴细胞内钙离子（Ca2+）作为淋巴细胞激活、增殖过程中的信使分子，在传递抗原等外界分子的刺激，启动相关基因的转录及其后续过程中，起着重要作用[4]。其中Ca2+调节作用主要是通过与CaM形成Ca2+-CaM复合物实现的。CaN是迄今发现的唯一受Ca2+-CaM调节的丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酶，起脱磷酸化作用，是激活体内T淋巴细胞的关键酶[5,6]。因此，我们选择从CaN和CaM入手研究N-AcGA诱导淋巴细胞增殖的机制。由MTT法测得N-AcGA促小鼠淋巴细胞增殖实验的结果，表明浓度为200 mg/L时作用最为显著。所以，我们应用流式细胞仪考察了此浓度的N-AcGA对小鼠淋巴细胞内CaM和CaN表达的影响。实验结果显示，N-AcGA在作用72 h后，CaM和CaN的平均阳性细胞百分率分别由61.6%上升到72.6%和由75.6%上升到86.0%。表明在N-AcGA诱导小鼠淋巴细胞增殖的过程中，CaM和CaN均有不同程度的表达。
综上所述，N-AcGA可以通过Ca2+信号通路中CaM和CaN促进小鼠淋巴细胞转化为淋巴母细胞，并增强淋巴母细胞分裂，达到诱导淋巴细胞增殖的作用，提示N-AcGA有望成为一种良好的免疫增强剂应用于相关领域。
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细胞增殖论文范文5
【关键词】 信号通路；细胞增殖；中西医；肾主生殖
【中图分类号】R339.2+1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）04-0073-02
Abstract：The ovarian granulosa cell proliferation is an important part of the human reproductive capacity. Based on the overview of GPER/EGFR/MAPK can promote protein involved in signaling pathways in granulosa cell proliferation ，we guess preliminarily it play a role its relationship with human reproduction and enrich the theory of "kidney main reproductive"， hoping to provide new research ideas and methods for the ovarian granulosa cell proliferation in the field of Chinese and western medicine treatment .
Keywords：signaling pathways； cell proliferation；traditional Chinese and western medicine ；kidney main reproductive
肾藏精，主生殖。、卵细胞及受精卵都应当列入生殖之精的范围，相关研究发现中医药在卵巢颗粒细胞的增殖中发挥重要作用，可能通过GPER/EGFR/MAPK信号转导通路发挥作用。
1 肾藏精，主生殖
生殖之精是肾精的重要组成部分，是形成子代胚胎的原始物质。《灵枢・经脉》曰“人始生，先成精，精成而脑髓生”，、卵细胞及受精卵都应当列入生殖之精的范围[1]。《女科正宗・广嗣总论》指出“男精壮女经调，有子之道也”，揭示受孕的机理在于男女肾气充盛，天癸成熟，精壮经调，适时和合，而成胎孕。
2 卵巢为奇恒之脏，卵巢藏泻体现“肾主生殖”
现代辅助生殖技术的发展与应用，使得“肾主生殖”理论的研究深入到了分子水平，为“肾主生殖”内涵的不断拓展提供了科学依据。卵巢属于胞脉范畴，形态实质与五脏相似，功能上能生成和排出卵子与六腑类同，可称为奇恒之脏[2]。解剖上通过卵巢固有韧带与子宫相连，藏泻有时，于卵泡期积肾之阴阳，以阴长为主促进卵泡的发育成熟，阴长之极，重阴转阳，于氤氲之时泻出元精，之后，重阴转阳，阴重阳旺，阴阳俱可，为孕育胞胎提供条件。卵巢颗粒细胞为卵泡发育成熟后随之泄出的人之元精，在一定程度上可以反映机体肾阳之盛衰。肾气虚，则冲任虚衰不能摄精成孕；肾阳虚，命门火衰，则生化失期，有碍子宫发育或不能触发氤氲乐育之气以致不能摄精成孕；肾阴虚而致热扰冲任血海，均不能摄精成孕，以致女性生殖功能下降。有研究已经证实补肾中药能够从基因、分子生物学、蛋白质等多个层次影响卵细胞质量，改善人类生殖能力。
3 “生殖之精”之卵巢颗粒细胞增殖机理探讨
基于GPER/EGFR/MAPK信号转到通路探讨“生殖之精”之卵巢颗粒细胞增殖机理。G蛋白偶联雌激素受体（GPER）是上世纪90年代从不同的细胞株中克隆获得的一种蛋白偶联受体家族中的新型雌激素受体[3]，广泛分布于多个系统的组织细胞中，包括神经系统、生殖系统、泌尿系统、免疫系统及循环系统等，卵巢、子宫、胎盘、前列腺、脑、心脏、肝脏、淋巴、乳腺等组织均发现了该受体的分布[4-6]，且发现其在多种癌细胞包括乳腺癌[3]、卵巢癌[7]、子宫内膜癌[8]、甲状腺癌[9]、生殖细胞癌[10]以及前列腺癌[11]中均有表达。其作用方式主要是通过与雌激素受体结合后活化并释放肝素结合性表皮生长因子激活EGFR，进而产生增殖效应以调控细胞增殖。表皮生长因子受体（EGFR）是受体酪氨酸蛋白激酶（RPTK）受体家族中的一员，为单次跨膜受体，其配体表皮生长因子（EGF）与生长、分化、免疫、肿瘤等有密切的关系。近年来有研究发现EGF能够调节卵巢颗粒细胞的增殖与分化。如文献报道[12]，EGF能够通过旁分泌的方式与其受体结合，从而调节卵巢颗粒细胞的增殖和性激素的分泌，从而影响卵泡的生长发育与生殖功能的调节。马会明等[13]通过动物实验证明一定剂量的EGF 对小鼠颗粒细胞增殖效应明显，EGF能够通过活化小鼠卵巢颗粒细胞的PI3K/AKT信号通路，促进颗粒细胞生长、增殖。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是哺乳动物体内广泛存在的一种激酶，主要参与调控细胞的增殖、分化与凋亡。其作用途径主要有三条：第一，细胞外信号调节蛋白激酶（extracellularsignal regulated kinase，ERK）途径；第二，JNK途径；第三，p38MAPK途径。其中ERK途径是细胞增殖分化的重要途径。有报道指出，ERKl/2通路参与了FSH 对卵巢颗粒细胞甾类激素生成的调控过程[14]，是卵巢颗粒细胞增殖的重要信号通路，并主要通过细胞周期蛋白而发挥作用。
细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞在周期时相的变迁中进入增殖、分化、衰老和死亡等生理状态。随着近年来研究的进展，细胞周期蛋白的种类越来越多，CyclinD是1991年由Motokura等[15]在研究甲状旁腺癌时首先分离，它的主要功能是调节细胞周期中G1/S期的过渡，其合成是在G1早期，并到G1后期达高峰，进入S期前降解，随后合成的是cycnilE。CyclinE是哺乳动物的另一种G1 期细胞周期蛋白，与相应的细胞周期蛋白依赖激酶结合，参与细胞进入S期。在卵巢颗粒细胞中，FSH通过cAMP-PKA信号转导通路激活细胞外调节蛋白激酶（ERK），促进细胞周期蛋白cyclinD2 表达，进而推动颗粒细胞增殖[16-17]。
4 GPER/EGFR/MAPK信号通路促进人类生殖能力的研究
张明敏等[18]通过研究补肾安胎方（菟丝子、桑寄生、川断、丹参、黄芪、当归）对胚胎着床障碍小鼠子宫内膜EGFR表达的影响，证实补肾中药能够提高EGFR的表达。许静云等[19]通过研究补肾中药对EGF表达的影响，证实菟丝子提取物可以促进大鼠卵巢颗粒细胞EGF的表达，六味地黄丸、菟丝子黄酮可以促进雷公藤多苷对生殖损伤的恢复。李岚等[20]通过研究补肾化瘀方对PCO大鼠卵巢颗粒细胞表皮生长因子受体表达的影响，证实补肾化瘀中药能够改善PCO大鼠卵巢颗粒细胞EGFR的表达。
5 展望
近年来，由于生活方式的变化、妊娠年龄的推后以及一大批高龄失独家庭的出现，不孕不育患者人数逐年增加，如何改善人类生殖能力，提高人类生育水平成为辅助生殖领域亟待解决的问题。GPER/EGFR/MAPK信号通路可能参与促进颗粒细胞增殖并为“肾主生殖”理论的提供微观化解释。关于此信号转到通路介导细胞增殖的研究目前了解尚少，尚有待于临床与科研的进一步研究和考证。
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细胞增殖论文范文6
关键词: 人乳铁蛋白;癌细胞;细胞增殖
人乳铁蛋白(Human Lactoferrin，hLF) 是主要存在于人乳清中的球蛋白，乳汁中特别是初乳中含量最高，具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用〔1，2〕。国外有学者将其应用于肿瘤患者的治疗〔3〕，但是对其作用机制的研究较少。目前国内较少有关于hLF作用于细胞的报道，我们选用易早期转移的鼻咽癌(NPC)细胞作为研究对象〔4〕，以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人肝脏细胞(L02)作为正常细胞对照，观察hLF在体外是否具有抑制癌细胞生长的作用，探讨hLF抗肿瘤的作用机制，从而为肿瘤的治疗提供研究基础，为临床实验及应用提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 人鼻咽癌细胞(CNE)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人肝脏细胞(L02)均购自中国科学院上海细胞资源中心。重组hLF(Lot:L0520，溶于PBS中，储存浓度5 mg/ml，-20℃储存备用)和噻唑蓝(MTT，Lot:M2128)均购自Sigma公司。RPMI1640、胎牛血清购自HyClone公司。其他试剂均为分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 各细胞系均应用含10%胎牛血清和1%青链霉素的RPMI1640培养基，5%CO2，37℃培养。
1.2.2 MTT法检测细胞增殖 设空白对照组和hLF干预组。待细胞生长至对数生长期，接种于96孔细胞培养板，接种数为5×104/孔。每组细胞设5个平行孔，各组细胞分别加入不同浓度的 hLF (0，1.25×10-3,2.5×10-3，5×10-3，10×10-3，20×10-3，40×10-3 g/L)，每孔均为200 μl。作用24 h后，加入MTT(5 g/L，每孔20 μl)，继续培养4 h，测定A570 nm吸光度。
1.2.3 细胞形态观察 细胞经hLF处理后，倾去上层悬浮死细胞并用PBS洗两遍，加入新鲜培养基。同样处理对照孔细胞，将细胞置于倒置显微镜下，观察细胞形态的变化。
1.3 统计学处理 数据用x±s表示，组间比较用方差分析。
2 结 果
2.1 重组hLF对鼻咽癌细胞CNE、人肝脏细胞L02、中国仓鼠细胞CHO系的增殖能力的影响 对CNE呈现剂量依赖性的抑制作用，而对正常细胞无抑制作用，见表1。表1 人乳铁蛋白对各细胞体外增殖的影响与空白对照比较:1)P<0.05
2.2 细胞形态学观察 显微镜镜下可见，空白对照组癌细胞密集成片生长，如铺路卵石状，细胞膜圆润，透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。hLF处理组癌细胞形态发生明显的改变，随hLF浓度增加，细胞从正常的增殖旺盛的贴壁生长，逐渐表现为生长缓慢，黏附力降低，细胞变圆，细胞胞质粗糙，细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差，细胞形态完整性受损，而正常细胞在 图1 细胞镜检图hLF作用下无显著变化(见图1)。
3 讨 论
hLF多种生物学功能通过免疫系统的激活与调节得以实现〔5〕。Bezaul〔6〕研究发现，乳铁蛋白能抑制鼠实体瘤的生长和转移。肿瘤内注射LF，可以明显的减小实体瘤的体积，且作用效果与LF干预天数相关。研究〔7，8〕发现，乳铁蛋白的抗头颈部肿瘤作用是通过抑制肿瘤细胞增殖实现的。Wolf〔3〕等发现，人乳铁蛋白通过阻断头颈部肿瘤细胞由G0到G1期的转化来抑制肿瘤细胞的增殖。人乳铁蛋白对鼠的SCC细胞系生长的抑制作用，与剂量成正相关;而且人乳铁蛋白抑制头颈部细胞癌的作用是通过直接的细胞毒作用及系统性的免疫调节作用实现的。Varadhachary〔9〕等人做了大量的口服临床试验，证实乳铁蛋白无药物相关的有害作用。鼻咽癌作为头颈部肿瘤之一，其恶性程度较高〔4〕，早期即可出现颈部淋巴结转移，临床上有转移至骨盆、肺、肝等多器官的病例〔10〕。选用鼻咽癌细胞作为研究对象，具有一定的代表意义。
本研究结果显示，人乳铁蛋白可以抑制鼻咽癌细胞增殖，且呈剂量依赖性，对正常细胞的增殖无明显抑制作用。这一结果，为开发乳铁蛋白的抗癌功效提供了理论依据。
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