0引言 酯酶（Esterases，EC3．1．1．X）是一种催化酯键水解和合成的酶的总称，水解时催化酯键产生甘油和脂肪酸；合成时，把酸的羧基与醇的羟基脱水缩合，产物为酯类及其他香味物质．它广泛存在于动物、植物和微生物中．动物胰脏酯酶和微生物酯酶是酯酶的主要来源．1834年Eberle在兔胰脏中首次发现脂肪酶，微生物酯酶则以1935年Kirsh发现产脂肪酶的草酸青霉（PenicilliumOxalicum）为最早．由于微生物资源丰富，同时利用微生物发酵产酶具有便于工业化生产等优点，微生物酯酶得到关注，并且已经广泛应用于农业、食品酿造、医药化学、污水处理和生物修复等领域，又由于酯酶的酶促反应具有较高的底物专一性、区域选择性或者对映选择性，它是合成手性化合物（如手性药物，农药等）的高效生物催化剂，微生物酯酶已成为研究热点． 1微生物酯酶的组成及来源 1．1酯酶的组成 酯酶主要包括脂肪酶（Lipase，triacylglycerolhydrolases，EC3．1．1．3）和羧酸酯酶（carboxylesterases，arboxylesterhydrolases，EC3．1．1．1）［1－2］，两者在生化方面没有本质区别，只是在底物特异性上，羧酸酯酶倾向于水解酰基链长度小的底物（≤10），而脂肪酶倾向于水解酰基链长度大的底物（≥10）［3－4］，在结构上，酯酶属于α／β水解酶超家族，具有Ser－His－Asp构成的催化中心三组合（catalytictriad），其中Ser通常位于具有保守的Gly－Xaa－Ser－Xaa－Gly五肽结构内［1－2］．细菌脂肪酶又包括八大家族：truelipase，GDSL，FamilyIII，thehormone－sensitivelipase（HSL），FamilyV－VIII，其中truelipase又包括7个亚族SubfamilyI．1－I．7［2，5］．阿魏酸酯酶（Ferulicacidesterase，EC．3．1．1．73）又称为肉桂酸酯酶，是最近分离出一种酯酶，它是羧酸酯水解酶的一个亚类，它能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键［6］． 1．2微生物酯酶的来源 在自然界中能产生酯酶的微生物资源是非常丰富的，从分类上看主要是真菌，真菌中主要是青霉、链孢霉、红曲霉、黑曲霉、黄曲霉、根霉、毛霉、酵母菌、犁头霉、须霉、白地霉和核盘菌等12属23种；其次是细菌，在细菌中主要是芽孢杆菌属、假单胞菌属以及伯克霍尔德菌属等；另外，放线菌中的个别种类也能产生一定量的酯酶．2产酯酶微生物的筛选及酶活力的测定一般筛选流程为：样品→富集培养→平板分离→平板初筛（观察透明圈）→摇瓶复筛（测酶活力大小），三油酸甘油酯是产酯酶微生物初筛加入培养基中的常用底物，因为初筛选用平板培养基，而在培养基中存在不互溶的油、水两相，所以要对它们先进行乳化，乳化剂可选用聚乙烯醇或者吐温．溴甲酚紫由于反应后pH变化显色，而RhodamineB由于可以和分解后的物质结合形成显色物质，它们被用作常用指示剂加入培养基内［7］．对于酯酶活力的测定，常见方法有以下几种：酯酶活力比色法，即以对硝基苯酚为底物，分光光度计测定400nm处吸光度值［7］；酯酶活力滴定法，以NaOH滴定三醋酸甘油酯在酯酶作用下释放的醋酸来测定；α－乙酸萘酯比色法，即先绘制α－萘酚标准曲线，然后在pH10的Tris－HCl缓冲液中，以α－乙酸萘酯为底物和粗酶液反应，在595nm处测其吸光度值［8］． 3微生物酯酶与基因克隆 随着分子生物学和宏基因组学的发展，越来越多的研究人员从不同环境样品中筛选产酯酶微生物，克隆酯酶基因，构建高产的基因工程菌为进行后续的工业化生产打下基础．其中的环境样品的主要来源是土壤以及海洋，特别是海洋环境样品，因为海洋环境包括低温、高温、高静水压、强酸、强碱以及营养条件极为贫乏的各种极端环境，微生物要在这样的环境中生存，生理结构、代谢方式等都会发生一系列改变，所以从海洋中筛选到的微生物可能具备某些特殊的代谢产物，另外低温酯酶的研究也十分广泛，近年来已纯化或克隆表达了从南北极、深海、高山冻土中分离到的低温微生物产生的低温脂肪酶，如菌株PseudomonasfragiIFO3458（PFL），Pseudomonassp．KB700A，Pseudomonassp．B11－1，Aeromonassp．LPB4的脂肪酶［9－12］．郑鸿飞等［13］从青岛前海和胶州湾海区样品中分离到1株产酯酶活力和稳定性较高的菌株EB21；邵铁娟等［14］从2000多份渤海海区海泥样品中分离出一株新型脂肪酶高产菌株BohaiSea－9145，经鉴定为适冷性海洋酵母（Yarrowialipolytica）；张金伟等［15］从南极普里兹湾深海沉积物中筛选到一株产低温脂肪酶的菌株7195；林学政等［16］从南大洋普里兹湾的水样中筛选到一株产低温脂肪酶的深海嗜冷菌25101；JeonJH等［17］从南韩江华岛潮汐平原沉淀物宏基因文库中分离到一种耐盐的酯酶基因亚型；一个新的酯酶基因estDL30从冲积土宏基因组文库中被筛出，它由1524个核苷酸组成，编码的蛋白质又507个氨基酸组成，这个酯酶蛋白属于familyVII［18］；一个超表达的阿魏酸酯酶基因estF27从土壤宏基因组文库中被筛出［19］． 4微生物酯酶的应用 4．1在食品加工方面的应用 酯酶主要通过酯交换［20］、水解［21，22］及合成化合物等方式应用于食品加工方面．固定化脂肪酶现在已用于芳香酯的合成，而低分子量芳香酯多呈天然水果味，它们广泛应用于食品、饮料等食品工业，Melo等［23］研究用Rhizopussp．脂肪酶合成香茅醇芳香酯优化条件；利用酯酶使乳制品增香［24］，在酿酒和食用醋的生产中，利用酯酶提高乙酸乙酯、乳酸乙酯等酯类的含量，使口感有明显提高；食用油脂精炼工艺中，借助微生物酯酶在一定条件下能催化脂肪酸与甘油之间的酯化反应，从而把油中的大量游离脂肪酸转变成中性甘油酯，提高了食用油的价值；脂肪酶在面包专用粉中还有面团调理的功能，使面包质地柔软，颜色更白；酯酶催化合成单甘脂［25］是使用量最大的食品乳化剂；阿魏酸是天然抗氧化剂，也是近年来国际认知的防癌物质，广泛应用于食品原料中，目前已使用阿魏酸酯酶与其他酶协同从各种农作物副产品中提取阿魏酸［26］，并且阿魏酸作为合成天然香兰素的前体，利用微生物方法产生香兰素，具有毒性低、安全性高的特点，应用于食品中．#p#分页标题#e# 4．2在精细化工中的应用 表面活性剂在化妆品、洗涤用品中有重要用途，传统的化学生产具有选择性差、需要高温等缺点，酶法克服了这些缺点，酯酶催化糖酯等生物表面活性剂的合成，而糖酯是一种重要的生物表面活性剂；酯酶还有提高表面活性剂的释放［27］的作用；在洗涤剂中添加碱性脂肪酶，可以提高去污力，降低三聚磷酸钠等的用量，减少污染；酯酶的底物特异性及高度立体专一性可合成具有应用价值的精细化工产品，如化妆品的长链脂肪酸酯等． 4．3在手性化合物中的应用 由于酯酶酯化反应具有高底物专一性、区域选择性、对映选择性等优点，因此酯酶是有机合成中重要的生物催化剂，而且催化效率比化学试剂高出很多．手性化合物是指分子量、分子结构相同，但左右排列相反，如实体与镜中的映体的化合物，而医药领域很多药物都是手性化合物，而近年来酶拆分已经成为手性化合物拆分的研究热点，酯酶又是酶拆分中研究最为广泛的一种．WENS等［28］考察了实验室自制的LipaseCAN、LipaseRH两种酯酶对α一苯乙胺的拆分效果，并与几种商品酶做了对照，结果表明Novozyme435这种商品酶的拆分效果最好．GodinhoLF等［29］用酯酶高效的对1，2－O异亚丙基甘油酯进行拆分，其中对映体过量值可达到72％～94％；研究人员改良不同介质中固定化脂肪酶拆分手性化合物，如任梦远等［30］以自制的平均粒径为4．5μm磁性高分子微球为载体，采用离子交换法固定化Candidarugosa脂肪酶，催化（±）－薄荷醇的酯化反应，所制备的固定化脂肪酶在离子液体［bmin］PF6中催化拆分（±）－薄荷醇的效果最佳，与游离酶相比固定化脂肪酶的立体选择性有很大的提高，对映体过量值可达93％，对映体选择值为35．Zheng等［31，32］利用纯化后的重组后酯酶（Escherichiacoli．BL21）对薄荷醇进行转酯化拆分，结果显示，底物／酶质量比S／C≥50条件下，相对于丙烯酸、正丁酸酯化剂，乙酸酯化剂的效果最好（酯酶对乙酸薄荷酯的E＞100），且通过回收，固定化酶重复使用次数达4－5次．戴大章等［33］采用改性Ultrastable－Y分子筛固定化P．expansumPED－03脂肪酶（PEL），利用固定化PEL在微水相中对（R，S）－2－辛醇进行拆分，在以正己烷为溶剂，含水量为0．8％的体系中，于50℃反应24h的转化率（c）可达到理论值的97．68％，对映体过量值（e．e．）可达到98．75％．对于手性药物，是手性化合物中的研究热点，研究人员利用酯酶对其进行拆分，如（R）－氟比洛芬［34］、酮基布洛芬［35］等，使对映体过量值得到提高，提高了药物的有效值． 4．4在环境治理方面的应用 随着农业生产中农药的大量使用，农药污染、残留等问题也日趋严重，而农药中菊酯类杀虫剂广泛应用于果蔬、果树、花卉、林木等，由于其自然条件下难以快速降解，农药残留带来潜在的食品安全和环境污染问题．研究表明，菊酯类杀虫剂具有类固醇结合活性，可能影响人体激素正常水平［36］．研究人员对菊酯类杀虫剂的降解进行了大量研究［37，38］，而利用微生物降解农药是一条重要途径，研究表明从环境样品中筛选出的微生物对拟除虫菊酯［39］，包括氯氰菊酯［40］、丙烯菊酯［41］等有高效降解作用，随着分子生物学技术的发展，许多研究人员已经克隆到酯酶基因［42，43］，而利用基因克隆和酯酶的定向化技术，构建产酯酶的高效基因工程菌也已经成为环境保护的一个发展趋势． 5展望 近年来，随着宏基因组文库、基因工程、定向进化技术、固定化技术的发展，以及界面酶促过程等技术的深入开展，微生物酯酶的研究已经进行到分子层面，高效产酯酶菌株的筛选、诱变育种、基因克隆及其定向进化构建高效基因工程菌的研究取得了长足发展，随着人们生活水平的提高，食品、医药、化妆品等中的添加天然成分将受到广泛关注，特别是天然底物的生物合成和手性化合物的酶拆分，因此，微生物酯酶在食品、医药、精细化工等领域具有广泛的应用前景．由于微生物酯酶广泛的应用前景，本实验室最近从红树林土壤样品中通过宏基因组文库的方法筛选到一新型低温耐碱酯酶基因，已经提交到Genbank，其登录号码为（JQ701700）．实验室成员正在进行深入研究，酯酶的工业化生产及其在各领域的应用将会逐步实现．
