一、资料与方法
1.临床资料
420例回族NSHL患者来自中国西北地区,包括宁夏、甘肃、青海、陕西和新疆五个省份部分地区特殊教育学校的306名聋哑学生和甘肃省回族聚集地的114例散发病例。420例患者均为来自不同家庭的耳聋先证者,无耳聋家系患者,其中先天性聋377例,语后聋43例;男233例,女187例,男女比例为1.26:1,年龄1～73岁(平均19.25±4.92岁)。其中一侧重度聋、另一侧极重度聋患者6例,双侧重度聋4例,中度聋1例,其余均为双侧极重度聋。
1）病史采集
所有研究对象以问卷调查和电话家访的形式进行病史采集,内容包括:①一般情况:姓名、性别、年龄、婚姻状况、出生日期、家庭住址、长期的联系方式;②耳聋特点:发病年龄、有无听力波动、有无伴随眩晕及耳鸣症状、语言发育情况、助听器佩戴情况;③用药史:包括庆大霉素、链霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、小诺霉素及其他自觉用药后对听力有影响的药物、用药剂量和持续时间;④新生儿期高危因素:耳聋家族史、孕期宫内感染、颅面畸形、高胆红素血症、脑膜炎、新生儿期缺氧缺血性脑病史、Usher综合征及Waardenburg综合征;⑤家族史:父母是否近亲结婚、有无耳聋及其他疾病家族遗传史;⑥智力发育情况;⑦母亲分娩史:有无脐带绕颈、难产及产伤。对有家族史的患者绘制相应的家系图谱。
2）体格及听力检查
全身体格检查:对全身各系统、器官及智力和生长发育进行全面的检查,尤其是甲状腺,排除因其他系统异常所致的综合征型聋;②专科查体:排除耳部畸形和化脓性中耳炎等引起的非感音神经性聋;③听力学检查:应用丹麦生产的Madsen520便携式听力仪和美国智听公司SmartEP听觉诱发电位仪对研究对象分别进行纯音测听(puretoneaudiometry,PTA)和／或听性脑干反应(ABR)检查。并根据世界卫生组织(WHO,1997)标准将耳聋程度分为5个等级:正常≤25dBHL;轻度聋26～40dBHL;中度聋41～60dBHL;重度聋61～80dBHL;极重度聋≥81dBHL。
3）血样采集及资料保存
在经研究对象或其监护人签订知情同意书后,抽取患者5～10ml静脉血,注入存有2mlEDTA抗凝剂的试管中,20oС保存。利用王秋菊等[3]建立的遗传性聋资源收集、保存和利用的综合系统对上述内容建立详尽的病案资料。
2.基因检测方法
1）基因组DNA的制备
用盐析法提取全血基因组DNA,TE溶解,1%琼脂糖凝胶电泳定性、定量并利用分光光度计进行浓度和纯度检测。制备50～100ng／μl工作液,4oС保存备用。
2）目的片段的扩增和酶切
利用多聚酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)对GJB2第2外显子、线粒体DNA及SLC26A4第8、19外显子进行扩增并使用A1w26I内切酶对线粒体基因进行酶切反应,将线粒体酶切阳性标本及另外两基因目的片段送生物公司进行测序。
3）测序结果判读
将生物公司反馈的测序结果利用SequenceScannerv1.0和SeqMan与来自NCBI的标准序列(mtDNA:NC＿012920.1;GJB2:NG＿008358.1;SLC26A4:NT＿007933.15)进行对比,确定突变位点。
二、结果
1.mtDNA1555A＞G突变检测结果
420例耳聋患者中,11例为mtDNA1555A＞G均质性突变所致,占检测人数的2.62%(11／420)。其中4例同时伴有其他位点的碱基改变,2例同时伴有1438A＞G+1598G＞A的点突变,另外2例同时伴有1438A＞G+1736A＞G的点突变。11例患者中6例(54.55%,6／11)有明确的氨基糖苷类抗生素用药史。
2.GJB2突变检测结果
420例患者中,41例为GJB2突变所致,包括24例纯合突变和17例复合杂合突变,占所有耳聋患者的9.76%(41／420),是最常见的致聋基因(表1),c.235delC纯合突变致病率最高(46.34%,19／41)。还有31例致病基因携带者,未发现显性致聋基因,GJB2致病等位基因占所有等位基因的13.45%(113／840)。在420例患者中共检测到14种突变形式,包括9种致聋突变(c.235delC,c.176191del16,c.299300delAT,c.35delG,c.109G＞A,c.439G＞A,c.187G＞T,c.310del14,380G＞A)、两种常见多肽(c.79G＞A,c.341A＞G)及三种致病性不明确的突变(c.511G＞T,458G＞A,c.478G＞A,其中前两种是本研究发现),详见表2。c.235delC占所有致病等位基因的51.33%(58／113),是该地区回族NSHL患者的主要突变方式。
3.SLC26A4基因突变检测结果
420例患者中共发现20例(7例为散发患者,13例为特殊教育学校的聋生)为双等位基因改变(纯合和复合杂合),占所有患者的4.76%(20／420)。在840个等位基因中有42个c.9192A＞G单等位基因改变,占5.0%(42／840),包括11例纯合突变、14例杂合突变和6例与其他点突变共存的复合杂合(4例与c.2168A＞G共存、2例分别与c.1001+32A＞G和c.1001+5G＞C共存)。c.9192A＞G点突变在所有SLC26A4突变基因中占的比率最高(68.85%,42／61),是该地区人群的热点突变(表3)。
三、讨论
GJB2、SLC26A4及mtDNA1555A＞G三种常见致聋基因在不同人种、不同地域的耳聋人群中突变频率和突变方式不尽相同。GJB2基因突变中,c.35delG是欧洲NSHL患者中最常见的突变形式,突变频率在15%～55.8%之间[1];c.235delC是蒙古人种最常见的突变方式,在国内NSHL人群中c.235delC突变频率约占GJB2等位基因的70%[4,5];SLC26A4基因突变中,c.2168A＞G(p.H723R)是日本人群中的主要突变方式,占SLC26A4等位基因的53%[6];我国以IVS72A＞G最为常见[4,7],内陆和台湾IVS72A＞G的突变频率分别占64.63%[8]和84%[9];mtDNA1555A＞G的检出率低于青海省(5.76%)[10]和西北地区总体NSHL人群的检出率(5.21%)[11]。本研究通过对三种常见聋病基因的联合筛查明确了本组西北地区回族约17.14%(72／420)NSHL患者的病因。
本研究在420例回族NSHL患者中共发现41例(9.76%,41／420)例GJB2突变致聋病例和31例致病基因携带者,GJB2致病等位基因占所有等位基因的13.45%(113／840),较Dai等[5]报道的2063例中国非综合征型聋患者的检出率略低。c.35delG是高加索人种的主要突变形式,Li[12]和满荣军等[13]报道在新疆维族发现该突变,而在汉族人群未发现该突变,本研究中有6例患者发现c.35delG等位基因突变(2例纯合、2例与c.299300delAT构成复合杂合、2例与c.235delC构成复合杂合)(表1),突变频率较高,占所有致病等位基因的7.08%(8／113),可能与回族的种族起源有关。有研究显示[14],回族人群与高加索人种的混杂度很高。本研究结果说明,GJB2基因突变是西北地区回族NSHL患者的主要致病突变,由于回族婚配的局限性,族内近亲结婚率较高,因此通过婚育指导可在一定程度上降低该地区耳聋的发病率。
SLC26A4是大前庭水管综合征(enlargeves-tibularaqueductsyndrome,EVAS)的主要致病基因,在国内以c.919A＞G和c.2168A＞G为其主要突变方式[15,16]。因此本研究针对上述两个突变位点所在的外显子进行检测分析,结果示c.9192A＞G突变频率为5.0%,介于国内不同地区的发病率之间(0.04%～19.9%)[17]。本组中有114例散发耳聋患者,其中7人为双等位基因改变,占散发患者的6.14%(7／114),高于特殊教育学校聋生的检出率(4.25%,13／306),分析其可能原因为:EVA患者听力有波动性,散发病例中患者耳聋程度不一,有佩戴助听器的患者和语后聋而未能就读于特殊学校的患者;Wang等[15]在对95例EVA患者基因型与表型的研究中发现SLC26A4所致的耳聋表型以重度聋最常见(多数为IVS72A＞G突变所致),中度聋次之,极重度聋较少,而特殊教育学校的学生绝大多数为重度和极重度聋患者,故散发病例中的检出率较特殊教育学校学生中高。目前国内外耳聋研究对象多以聋哑学生为主,而很少以散发耳聋患者作为研究对象,而同一地区、同一民族散发患者与特殊教育学校的患者SLC26A4突变率是否相同,聋哑学生的突变率是否可以反映整个地区的突变率,均有待于进一步研究。
mtDNA1555A＞G突变是氨基糖苷类抗生素相关致聋基因,中国西北地区由于经济落后,该类抗生素使用广泛,明显高于国内其他地区[4,18]。本研究中11例为mtDNA1555A＞G均质性突变所致,占检测人数的2.62%(11／420),与Guo等[4]报道的303例回族患者的检出率相近,与汉族患者无统计学差异。由于线粒体母系遗传的特点,加之种族起源和抗生素在不同地区使用广泛程度不同,使得该基因在不同种族、不同地区的致病率有很大的差异。本组11例mtDNA1555A＞G基因突变患者中,6例有明确的氨基糖苷类抗生素用药史,占病因明确患者的54.55%(6／11),因此,减少该类抗生素的使用对防止药物性聋具有至关重要的作用。
本研究通过对三种常见聋病基因的联合筛查,将为中国西北地区回族NSHL人群在耳聋基因诊断、遗传咨询及用药指导等方面提供分子流行病学依据。由于本研究只针对GJB2、mtDNA155A＞G及SLC26A4基因的热点突变进行了研究,仅明确了17.14%回族NSHL患者的遗传学病因,在此研究的基础上扩大基因筛查范围、完善SLC26A4其余外显子的基因检测,有望为更多的NSHL患者带来福音。（本文表略）
本文作者：马建鹂 徐百成 边盼盼 杨小龙 刘晓雯 李倩 朱一鸣 纵亮 赵亚丽 郭玉芬
