微生物培养的方法范文1
关键词 微生物分离 选择
1 教材分析与课时安排
“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”是人教版高中生物（选修1）专题2“微生物的培养与应用”的第二个课题，学生已学习了有关培养基和无菌技术的基本知识，在掌握使用平板划线法和稀释涂布法、分离和纯化微生物的实验操作的基础上，研究培养基对微生物的选择作用，并测定其数量。其中既有关于特定菌株的选择策略等知识性内容，又有土壤溶液的稀释、菌落数量统计等操作性内容，难度较大、探究性较强，是培养学生设计实验、动手操作等科学探究能力，提高生物科学素养的好素材。
本课题教学实施中的关键在于两点：① 教师要处理好知识性内容与操作性内容的关系，要让学生理解特定菌株的选择策略，并学习有关的实验方法和操作程序;② 处理好课常与课后的关系。本课题的实验操作时间不长，但是操作前要制备培养基、对培养基和其他操作用具进行灭菌，操作后的培养时间和对微生物进行观察则需要较长时间，因此需要教师精心设计教学程序，统筹安排教学时间。
根据这一教材特点，本课题教学可分2个课时进行，2个课时之间应留有2 d左右的间隔，以便进行微生物的培养与观察。
2 教学目标
2.1 知识目标
简述稀释涂布平板法分离微生物和进行微生物计数的实验原理;说出选择性培养基和鉴别性培养基的用途;归纳分离纯化微生物的原理和方法。
2.2 能力目标
学会制备土壤样本稀释液，学会用稀释涂布法将菌样液接种到固体培养基平板;学会用稀释涂布平板法进行微生物数量测定的方法。
2.3 情感、态度与价值观目标
体验科学知识的形成过程，加深对科学本质的理解;体会在实验活动中合作学习的有效性，养成严谨的科学态度。
3 教学准备
3.1 土壤样品的采集以及土壤溶液的配制
为保证实验取得预期效果，应选择经常施用尿素的农田，铲去表土后采集3～8 cm深度范围内的土壤;回实验室后，去除土壤中的植物枯枝败叶及其他杂物，用托盘天平称取样品10 g，加入到盛有90 g无菌水的锥形瓶中，震荡10 min，即制得101土壤溶液;制备完成后可置于冰箱冷藏室内备用（1～2 d）。
3.2 配制培养基并进行高压蒸气灭菌
配制牛肉膏蛋白胨固体培养基（配方：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，加热溶解后，加水定容至1 000 mL。如条件具备可用琼脂糖代替琼脂）， 分装到100 mL 带棉塞的锥形瓶中，每瓶各25 mL。
配制尿素固体培养基（配方：葡萄糖10 g，尿素1 g，KH2PO4 1.4 g，Na2HPO4 2.1g，MgSO4・7H2O 0.2 g，琼脂15 g，加热溶解后定容至1 000 mL），分装到100 mL 带棉塞的锥形瓶中，每瓶各25 mL。
将上述分装好的两种培养基、装有4.5 mL 蒸馏水的带棉塞试管、装有99 mL 蒸馏水的250 mL锥形瓶、包装好的培养皿进行高压蒸气灭菌。
4 教学过程
4.1 导入新课
教师讲解：尿素是动物体内蛋白质代谢终产物，也是农业生产中常用的化肥，但农作物并不能直接吸收利用尿素，而有些土壤微生物能产生并分泌脲酶。通过分解土壤中的尿素为自身和植物生长提供氮元素，由此引出课题：在特定的土壤中可以分解尿素的微生物的数量是多少？如何从土壤中的众多微生物中分离出能分解尿素的微生物？
4.2 分析原理，学生尝试进行实验设计
教师介绍Taq细菌的发现和选择过程，引导学生认识到研究微生物的分离和培养，是研究微生物利用的基础，而要选择出符合需要的特定微生物，则要从微生物的生理和代谢特点出发，创造有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。在此基础上，教师引导学生提出实验的初步设想，以尿素为惟一氮源，配制培养基，阻止不能利用尿素的微生物的生长，从而筛选出分解尿素的微生物。学生以实验小组为单位进行实验设计。由于本实验的综合性强，难度大，学生在设计实验流程时可能存在不少困难。教师一方面要鼓励小组内部开展讨论，逐步修正设计;另一方面也要适时的参与到各组的讨论过程中，提出合理的建议。
4.3 总结设计结果，得出可行的实验流程
让各小组展示设计结果，组织全体学生讨论，教师给予评价，最终得出可行的实验流程（图1），并要求学生明确各步骤的具体目的。根据教师课前所进行的预实验，所取的土壤样品中分解尿素的微生物大约为1.5×108个/g。因此，可选择让学生进行104、105两种土壤稀释液的涂布接种。这样既可保证实验效果，又减少了器材、试剂的用量，节约教学时间，提高教学效率。同时，以牛肉膏蛋白胨固体培养基的培养作为实验对照，以便让学生充分理解和认识选择性培养基的设计策略和选择效果。
4.4 学生分组操作
为节约教学时间，教师可在课前将前期备好的牛肉膏蛋白胨固体培养基和尿素固体培养基，用电磁炉加热融化后，于课前置于80 ℃的水浴中进行保温，保持融化状态，以便学生及时取用。
倒平板：将融化的两种培养基分发给每个实验小组，指导其按规范倒平板，将两种融化的固体培养基倒入已灭菌的培养皿中，每个100 mL锥形瓶中盛有的25 mL培养基，可倒两个平板，每个实验组可制得两种平板共四个。制作完成后，分别编号，置于实验台上等待其冷却凝固。
配制104、105土壤稀释液：将101土壤溶液和经灭菌的装有4.5 mL 蒸馏水的带棉塞试管、装有99 mL 蒸馏水的250 mL锥形瓶分发给各小组，教师指导学生制备104、105两种土壤稀释液。具体的方法可由教师直接给出，也可由各小组自行讨论制定方法，因学生对微量移液器的使用不熟悉，教师应给予指导。
接种菌液，分离尿素分解菌：教师指导学生用微量移液器，各取0.1 mL104、105土壤稀释液，分别加入到装有牛肉膏蛋白胨培养基和尿素固体培养基的培养皿中，使用涂布器，在酒精灯火焰附近打开培养皿，将加入的菌液均匀涂布于整个培养基，盖上培养皿后，倒置于37℃恒温培养箱中培养。
以上为第一课时。在第二课时教学实施前，教师可组织学生定期观察培养情况。
观察对比培养结果并计算：2 d后观察比较牛肉膏蛋白胨培养基和尿素固体培养基中菌落的形态并计数。可以明显地发现，牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落形态多样，数目较多，而且随稀释倍数的增加，菌落的数目减少。而尿素培养基上的菌落形态比较单一，数目也明显少于对应稀释倍数的牛肉膏蛋白胨培养基上菌落。学生根据计数结果，计算出土壤中分解尿素的微生物的数量。例如学生计数在105稀释倍数的培养基上出现的菌落为60个，则每克土壤中尿素分解菌数量为60×5×105×10=3×108个/g。
4.5 小组讨论，促进学生对微生物选择性培养的理解
学生完成分组操作后，教师可设计问题，引导学生巩固有关微生物培养的原理和方法，加深其对微生物选择性培养的理解。具体问题及设计意图如下：
（1） 牛肉膏蛋白胨培养基中，提供碳源和氮源的物质分别是什么？
（2） 尿素固体培养基中，提供碳源和氮源的物质分别是什么？
（3） 你所在的实验小组的培养结果如何？按生长菌落的多少，将4只培养皿排序，从多到少的顺序是什么？为何会出现菌落数量的差异？
（4） 你所在的实验小组，实现了对土壤中分解尿素的微生物的选择性培养吗？为什么？
以上问题串从复习上一课题介绍的微生物培养过程中的碳源、氮源入手，让学生体会不同微生物在生长过程中利用的碳源和氮源是不同的，从而引导其深刻理解微生物的选择性培养的思路，进一步掌握特定微生物的选择和分离的方法。
4.6 设计“意外”，引导课题延伸
教师展示学生的实验结果，从中选择符合实验预期的尿素固体培养基，打开培养皿，使用手持式喷壶，向培养基表面喷入事先配好的质量分数为0.1%的酚红试剂，静置片刻，让学生观察现象。
教师讲解并提问：酚红试剂是一种酸碱指导剂，其变色范围是pH6.8（黄）～8.4（红），观察到的培养基上的颜色有何变化？这说明了什么问题？
学生通过观察可知，在培养基上出现了两种不同类型的菌落，一种菌落周围出现了红色圈，另一种则呈现黄色。这说明这些微生物的种类是不同的，菌落周围变红的说明微生物培养过程中产生了碱性物质，而菌落周围变黄则说明产生了酸性物质。
教师给出如下资料，指导学生阅读：
资料：微生物将含氮有机物分解产生氨的过程被称为氨化作用。能进行氨化作用的细菌统称氨化细菌。有些氨化细菌能分泌脲酶，可将尿素分解生成氨，为微生物提供氮源，如脲芽孢八叠球菌。
硝化细菌可利用氨氧化过程中释放的能量，将无机物转化成有机物而营自养生活，其中能将氨氧化成亚硝酸盐的称为氨氧化细菌，如亚硝化单胞菌;能将亚硝酸盐氧化为硝酸的是亚硝酸氧化细菌，如硝化杆菌等。
教师要求学生根据以上资料，进一步判断培养基上出现的两类菌群，分别是资料所给出的哪一类细菌。
在此基础上，教师提出问题：本实验中使用的尿素固体培养基中的惟一氮源是尿素，其目的在于选择土壤中的分解尿素的微生物，那么为何在培养基中出现了以氨为氮源的氨化细菌？如果想进一步选择分解尿素的微生物应该怎么做？
笔者设计这一问题串的目的在于帮助学生理解选择性培养基和鉴定性培养基的用途。借此问题，教师引导学生认识到，尿素分解菌可将尿素分解为氨，这时培养基中的氮源的种类就发生了变化，由原来的尿素是惟一氮源变成了除尿素外还存在其他的氮源。因此，可在这样的培养基上生长的细菌，有些是可以分解尿素的，有些则是以氨为氮源的杂菌。而要想选择出其中分解尿素的微生物，可在配制尿素固体培养基时加入酚红起到鉴别作用，然后用灭菌后的接种环，挑取菌落周围出现红色区域的微生物进行接种培养。
4.7 总结归纳
在总结归纳阶段，教师可设计一系列问题，引导学生回顾微生物分离纯化的方法和实验设计的思路，具体问题如下：
（1） 分离纯化微生物的方法有哪些？（平板划线法、稀释涂布法、选择培养基分离、鉴别性培养基鉴别后挑取接种）
（2） 本实验中，为何要设计使用牛肉膏蛋白胨培养基培养土壤微生物的步骤？（设置对照，通过比较实验组和对照组培养基上菌落的数量和形态，证明尿素固体培养基的选择效果）
（3） 要想提高土壤中尿素分解微生物计数的准确性，应该怎么做？（设置重复，取均值，减少实验误差）
（4） 请归纳微生物计数的方法。（稀释涂布法、血球计数板、比浊法等）
以上教学过程充分挖掘了该课题的教学价值，使课程标准中“微生物的分离与培养、微生物计数、选择性培养基的选择作用”等具体要求得到有效落实，同时，该教学过程较好地处理了知识性内容与操作性内容及课堂与课后的关系，可起到节约时间，提高教学效率的效果。
参考文献：
微生物培养的方法范文2
一、微生物不可培养的原因
对微生物进行常规培养时,由于生活条件的改变,有些微生物不能适应而死亡,另一些则通过产生孢子进入休眠状态或改变细胞形态、进入维持一定代谢活性但不生长繁殖的“活的非可培养状态”,结果均表现为微生物的“不可培养性”。
实际上,微生物的不可培养性是由于对微生物生长条件及其规律性的认识严重不足,而采取了偏离微生物生长实际情况的培养条件所造成的,这些偏离具体可以包括以下几个方面:
(一)实验室中无法完全模拟自然界的环境条件
由于目前监测技术和手段的限制,人们对微生物生存环境和自然条件的了解尚不充分。因此,人们没有或无法完全模拟微生物的自然生存条件,而通常将培养条件进行简化:将微生物置于恒温、恒湿、黑暗等环境中;将微生物限制在“板结”的琼脂或不扰动的液体介质中;简化微生物的营养组成没有提供微生物生长繁殖所必需的某些化学物质等等。所以在自然界中可以生长繁殖的微生物,在“纯培养”中生长条件得不到满足,从而导致了微生物的不可培养性。
(二)生长缓慢的微生物被忽视
环境中很多微生物都聚集生长,当将这些微生物接种至培养基时,适合生长的微生物由于生长快而占据优势地位,它们对营养成分的大量摄取使生长缓慢的微生物得不到充足营养而生长受到抑制。
(三)采用高浓度的营养基质
最初对微生物的培养是在富含营养的培养基中进行的,但是由于自然界中微生物数量庞大,其可利用的营养物质极度匮乏,多数处于“岔营养”状态。常规纯培养对这种认识不允分,通常将寡营养微生物迅速置于富营养状态,微生物初期的快速生长会产生大量的、微生物自身难以调节的过氧化物、超氧化物和羟基自由基等“毒性氧物质”,该类物质快速、过量的积累会破坏细胞内膜结构,导致细胞死亡,从而表现出微生物的不可培养性。
(四)环境微生物之间的相互关系被忽略
微生物相互关系繁多复杂,包括:(1)种间的偏利共生关系和互惠共生关系,两者的共性是至少一个群体提供另一些群体所需的生长因子而使微生物群体获利;(2)群体感应,这种关系被认为是通过细菌间的信息交流来调控细菌的群体行为:细胞通过感应一种胞外低分子量的信号分子来判断菌群密度和周围环境的变化,从而调节相应的细菌表达以调节细菌的群体行为。以上这两种关系都是微生物生长所必需的。由于人们目前对环境中微生物之间多数复杂的相互关系所知甚少,采用的培养技术没有将这种关系考虑在内。纯培养技术将待培养的微生物与其它微生物群体、以及生存环境人为地分离开,种间的共生关系和信息交流被阻断,微生物缺乏必需的生长因子和信号分了而死亡,表现出微生物的不可培养性。
(五)对微生物生长状况进行判断的常规标准存在的缺陷,也导致某些微生物生长不被发觉,表现为“不可培养”
微生物培养的方法范文3
意义
无土栽培是指不用天然土壤，而使用营养液或固体基质加营养液的栽培方法。固体基质或营养液代替天然土壤向作物提供良好的水、肥、气、热等根际环境条件，使作物完成从苗期开始的整个生命周期。无土栽培是实现蔬菜由传统大田生产向工厂化、规模化、集约化转化的新型栽培方式。
无土栽培的植物主要依靠营养液提供生长发育所必需的营养元素。目前营养液的使用存在以下问题：①营养液容易缺氧。无土栽培尤其是水培，因营养液层较深、根系活动范围小，容易造成氧气供应不足。作物根系缺氧时，其生长缓慢，水分及养分吸收减弱，从而影响地上部分生长，导致产量下降。②营养液的循环使用容易接触病原菌。植物根系一旦染病，传播会非常迅速，短时间内就能使整个栽培系统全部染病，造成重大的经济损失。因此，开发一种经济高效的循环营养液增氧和消毒方法成为亟待解决的重要课题。
营养液增氧和消毒的方法
增氧技g
在植物根系生长发育过程中，呼吸过程要消耗氧气，为使其能正常生长就需要有足够的氧气供应。无土栽培植物根系生长环境可以是在类似土壤的生长基质中，也可以是在与土壤环境截然不同的营养液中。因此，在无土栽培中根系氧气的供给是否充分及时，往往会成为制约作物生长的重要因素。
营养液中氧气溶解量可以用溶解氧浓度（DO）表示。溶解氧浓度是指在一定温度、一定大气压力条件下，单位体积营养液中溶解的氧气的数量，以毫克/升（mg/L）表示。营养液中溶解氧的多少与液温、大气压有关，温度越高大气压力越小，营养液的溶解氧含量越低；反之，温度越低大气压力越大，其溶解氧的含量越高。这是导致夏季高温季节水培植物根系容易缺氧的一个原因。
在植物生长过程中，营养液中溶解氧还与植物根系和微生物的呼吸有关，同一植物在白天和夜间对营养液中的溶解氧的消耗量也不尽相同。晴天时，温度越高，日照强度越大，植物对营养液中溶解氧的消耗越多；在阴天，温度低或日照强度小时，植物对营养液中溶解氧的消耗较少。植物根系的耗氧量与根系数量、呼吸数量、呼吸强度成正比，因此耗氧量取决于植物种类、生育时期、种植密度。生长过程耗氧量大、处于生长旺盛期以及每株植物平均占有营养液液量少的植物，则营养液中的溶解氧的消耗速率较大；反之，溶解氧的消耗速率较小。一般甜瓜、辣椒、黄瓜、番茄、茄子等瓜菜或茄果类作物的耗氧量较大，而蕹菜、生菜、菜心、白菜等叶菜类作物的耗氧量较小。另外，营养液内的还原性物质被氧化时也要消耗一些溶解氧。
一般营养液中的溶解氧含量维持在4～5 mg/L
以上，能满足大多数植物的正常生长。但是无土栽培别是水培营养液中的溶解氧很快会被消耗掉，因此必须采取一些方法来补充植物根系对溶解氧的需求。营养液溶解氧的补充，实质上是通过破坏营养液液相与空气气相之间的界面而让空气进入营养液的过程。在一定的温度和压力条件下，液-气界面被破坏得越剧烈，进入营养液的空气数量就越多，溶于营养液的氧气也越多。补充营养液溶解氧的途径主要来源于空气向营养液的自然扩散和通过人工的方法来增氧。自然扩散进入营养液的溶解氧的速度慢，数量少，远达不到作物生长的要求。人工增氧的方法包括营养液循环流动、落差法、喷雾、增氧器、间歇供氧、滴灌、压缩空气、反应氧、动态液位法等，其原理和特点见表1。
营养液循环流动、落差法、喷雾法和增氧器等都是通过增加营养液与空气的接触而提高营养液中的溶氧值，陈艳丽[2]在研究水培生菜有机态氮的营养效应及营养液溶氧管理技术时发现，水泵增氧达到溶氧浓度的饱和点后不再增加，这也可能是几种方法的共性。滴灌法、潮汐法均通过间歇供氧的方法，将根系暴露于空气中直接吸收氧气。甘小虎等[3]研究辣椒潮汐式灌溉育苗技术时指出，育苗过程中基质始终疏松透气不易板结，具有降低能耗、减少用工、节约用水等优点。动态液位法同时采用了增加营养液与空气的接触以及暴露根系于空气中的方法来增加根系对氧气的吸收效率。宋卫堂等[1]对动态液位法的研究表明，提高根系对氧气的吸收效率可以提高番茄的相对生长率、增强根系的活力、促进根系的生长发育。不同的增氧方式应用于不同的无土栽培方式，往往是几种增氧方式协调增氧。夏季高温时营养液增氧困难是制约增氧效果的一个关键问题。
消毒技术
营养液灭菌消毒的方法比较多，包括化学药剂消毒、高温消毒、紫外线消毒、臭氧消毒、慢砂过滤消毒等[4-11]。宋卫堂等[10]对营养液加热消毒机的研究表明，75℃、90 s的杀菌组合对（3.9×105～8.3×105）cfu/mL番茄萎蔫病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、番茄细菌性青枯病病原菌达到100%的杀菌效果。刘楠等[11]研究循环消毒装置时指出，在0.57 mg/L臭氧浓度下，对空心菜的生长有一定的促进作用，可以增加空心菜产量，而对于臭氧在营养液消毒及水培空心菜的影响等需进一步的试验研究。刘伟等[7]研究慢砂过滤装置时指出，慢砂过滤对病毒、线虫及部分细菌的消除率达到90%～99%，不会杀死营养液中所有的微生物，可以利用有益微生物抑制病原微生物，因此慢砂过滤用于营养液消毒还需要进一步研究与完善。宋卫堂等[9]对紫外线-臭氧组合式营养液消毒机进行了研究，UV、O3、UV+O3 3种方法的消毒效果分别达到70.6%、15.9%和89.9%。紫外线-臭氧组合式消毒比单一灭菌方法效果更好，显现出了协同效应，可以较大幅度地提高消毒效率。各消毒原理和作用见表2。
营养液微纳米气泡
增氧消毒技术
针对现有无土栽培营养液增氧效率低，各种消毒方法单一使用，存在环境污染大、运行成本高以及效果差、效率低等问题，一种新型高效的无土栽培营养液的增氧、消毒技术――“营养液微纳米气泡增氧消毒系统”经研发并逐步推广。
营养液微纳米气泡增氧消毒系统采用国际先进的微纳米气泡发生技术，并结合臭氧杀菌技术、紫外线消毒技术等，解决营养液供氧不足以及因病原微生物侵害而造成的无土栽培作物生长受抑制、产量下降等问题，避免由此造成的经济损失，在设施农业领域具有很好的实用性。
微纳米气泡发生技术是利用微纳米气泡快速发生装置将气体快速高效溶入水中产生微纳米气泡。微纳米气泡的显著特点是其在水中上升缓慢，停留时间长，并产生自我压缩，在水中具有很高的溶解度，并且微纳米气泡具有促进植物生长的生理活性，因此微纳米气泡技术被认为非常适合应用于水培栽培系统[12]。此外，利用微纳米气泡发生技术将气体溶入水中，与其他曝气方式相比，受温度影响较小，在夏季高温季节使用具有显著优势。
营养液微纳米气泡增氧消毒系统的技术原理：利用微纳米气泡发生技术将氧气溶入营养液中形成微纳米气泡富氧水对营养液进行增氧；利用微纳米气泡发生技术将臭氧溶入营养液中形成微纳米气泡臭氧水，并经过紫外线消毒器对营养液发挥协同消毒作用[13]。
营养液微{米气泡增氧消毒系统的创新点：①利用微纳米气泡发生技术使氧气、臭氧在水中高效溶解，生成的微纳米气泡具有缓释效果，可延长氧气、臭氧在水中的存留时间，提高利用率；②臭氧、紫外线协同作用灭菌，臭氧与有机物分子反应需要活化能，紫外线的照射提高了有机物分子能量，使活化分子比例增多，从而使有机物更容易在臭氧的氧化下分解。另外，水中溶解的臭氧在紫外线照射下能够生成反应活性更高的羟基自由基（OH-），进而加速了水中有机物的去除速率；③在营养液进行臭氧和紫外线消毒前过滤，减少了营养液中还原性物质和不透明杂质对消毒效果的影响，提高杀菌效果；④采用空压机对残留臭氧进行吹脱，使营养液中的臭氧浓度迅速下降，减少或避免对植物根系产生危害；⑤无土栽培换茬时不启动空压机，含有较高浓度微纳米气泡臭氧水的营养液在串联水培设施内进行数次循环，有效清除设施死角的病原菌；⑥可实现增氧、消毒双重功能，既能对营养液进行增氧，又能对营养液进行消毒，有效降低了单一设备的累加投资成本；⑦装置采用自动化控制，使用PLC和LED控制面板，操作简便；控制单元预留数据端口，可连接其他装置的控制单元，实现物联网综合控制。
适用范围
营养液微纳米气泡增氧消毒系统非常适用于水培，直接对营养液进行增氧、消毒。深液流水培（DFT）营养液的溶解氧随栽培槽长度的增加而降低，因此DFT种植槽长度不宜过长[14]。利用微纳米气泡技术增氧，其产生微纳米气泡具有缓释效果，可保证DFT种植槽末端的溶解氧浓度。
对于气雾栽培，营养液以喷雾的形式喷射出，在雾化的过程中营养液与空气充分接触，有效提高了营养液的溶解氧浓度，配以营养液循环流动方式，足以满足植物生长需要。因此，只需使用营养液微纳米气泡增氧消毒系统的消毒功能即可。
对于基质栽培，既可以通过控制滴灌流量及时间，使基质的透气性和持水性达到动态平衡而使根系获取充足的氧气，亦可利用营养液微纳米气泡增氧消毒系统进行增氧；基质栽培的营养液残液不再循环利用，排放前需经营养液微纳米气泡增氧消毒系统进行消毒，消毒之后可作为肥料用于大田灌溉。
推广应用
营养液微纳米气泡增氧消毒系统率先应用于北京农业嘉年华的蔬菜主题馆，该馆展示了各种新颖的无土栽培设施及蔬菜（图1～2）。营养液增氧方式包含了营养液循环流动、落差法和营养液微纳米气泡增氧消毒系统。该系统布置于地下贮液池附近，增氧时调节溶氧值10 mg/L左右（浓度范围>20 mg/L），与贮液池的营养液混合后将含有丰富溶氧值的营养液通过液循环流动供无土栽培蔬菜根系利用；消毒时调节臭氧浓度1 mg/L左右（浓度范围1～8 mg/L）对营养液进行消毒，消毒后采用空压机对残留臭氧进行吹脱处理，使营养液中的臭氧浓度迅速下降到0.1 mg/L，减少或避免对植物根系产生危害。增氧消毒后无土栽培内的作物无烂根现象和营养液病害，营养液微纳米气泡增氧消毒系统确保了无土栽培蔬菜保持良好的生长态势。
山东惠民鑫诚现代农业科技示范园也应用了营养液微纳米气泡增氧消毒系统（图3～4），园区内有2栋连栋温室，总建设面积为18276.48 m2，以荷兰高效无土栽培（椰糠基质培）生产模式为主。椰糠基质培除了应用间歇滴灌法增氧与紫外线消毒外，还应用营养液微纳米气泡增氧消毒系统对营养液进行增氧，收集的残液进行消毒后还可以应用于大田灌溉；该系统也可应用于园区的深液流水培韭菜，增氧消毒效果明显，韭菜根系发达，病害发生率极低。
应用展望
我国无土栽培的生产面积不断增加，与传统栽培模式相比，无土栽培可以有效克服保护地栽培中土壤盐渍、土传病害等连作障碍，在非耕地场所进行周年种植，并能提高单位面积产量和产品质量。无土栽培主要依靠营养液为作物提供所需养分，而营养液的增氧和消毒是无土栽培进行有效生产的关键。
目前，很多生态园区和农业园区在生产运营过程中，常常会遇到营养液增氧困难、易滋生藻类和病菌等问题，客户对营养液增氧消毒设施具有很强烈的需求。因此，该技术具有切实的推广市场。
营养液微纳米气泡增氧消毒系统由于集成了现有的增氧消毒优势技术及自控和物联网控制系统，成本相对比较高，这就决定了该系统需首先面向高经济附加值的蔬菜、水果、中药、花卉、食用菌等作物进行应用推广。其次，营养液微纳米气泡增氧消毒系统在生产与示范方面具有一定的应用，其增氧与消毒的基础研究有待进一步探索，以期为技术改进、降低成本、生产应用提供参考。
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[14] 陈海生，崔绍荣，苗香雯.深水培栽
微生物培养的方法范文4
[关键词] 微生物限度检查；验证；如意金黄散
[中图分类号] R286.0[文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）19-97-02
Study on the Method of Microbial Limit Test for Ruyi Jinhuang San
GAO HongLI KaiZHU Huiqin
Ningxia Institute for Drug Control, Yinchuan 750001, China
[Abstract] Objective To establish the method of microbial limit test for Ruyi Jinhuang San. Methods The validation test was carried out according to Chinese Pharmacopoeia (Chp 2010). Results The results of validation test showed Ruyi Jinhuang San had antibacterial activity. The culture media dilution method was used as the counting methods for the bacteria, moulds and yeasts (0.5mL/dish, 1∶20 sample solution) and the controlled bacteria detection test. Conclusion This method is feasible for the microbial limit test of Ruyi Jinhuang San.
[Key words] Microbial limit test; Validation; Ruyi Jinhuang San
为确保微生物限度检查方法的可靠性和准确性，《中国药典》2010年版规定对微生物限度检查方法需进行验证。目前，绝大多数药品的微生物限度检查方法药典中都未有具体的检查方法，都需要进行验证试验后建立。如意金黄散具有清热解毒、消肿止痛的功效，是国家评价性抽验样品品种之一。为了比较全面地反映此药品的整体质量，确保人民用药安全，另一方面也是为了更好地完成国家评价性抽验样品工作，为国家制定政策提供参考依据，本文对如意金黄散的微生物限度具体检查方法进行了验证和总结，供同行参考。
1材料与方法
1.1仪器
高压灭菌器，恒温恒湿培养箱（32.5℃、25.5℃）。
1.2药品
如意金黄散七个厂家56个批次（样品来自全国各地市售及生产厂家）。
1.3培养基
营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基。胆盐乳糖增菌液（BL增菌液），营养肉汤或亚碲酸钾肉汤，溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，甘露醇氯化钠琼脂培养基，pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。
1.4菌种
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、铜绿假单孢菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]。
1.5方法
菌液、供试液制备按中国药典2010年版二部附录ⅩⅢ C[1]进行。
按中国药典2010年版二部附录ⅩⅢ C进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证试验、控制菌检查方法的验证试验和样品检验。
2结果
2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证试验结果
2.1.1常规法取如意金黄散七个厂家26个批次的110供试液各1mL按常规法进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证试验。结果为24批样品大肠埃希菌、白色念珠菌试验组和稀释剂对照组回收率都＞70%；个别几个试验组＜70%而＞50%。而26批样品金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验组回收率都＜10%，黑曲霉菌的试验组回收率都＜60%而＞40%；其稀释剂对照组回收率都＞70%；表明供试品在此条件下对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌有不同程度的抗菌活性。综合验证试验结果得出如意金黄散按常规法进行细菌、霉菌及酵母菌计数，方法学验证试验不成立，需要建立新的检验方法。常规法的验证试验结果同时也表明细菌计数的敏感菌为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌；而霉菌及酵母菌计数的敏感菌为黑曲霉菌。
2.1.2 培养基稀释法、薄膜过滤法、上清液法（1）培养基稀释法：取110或120供试液1mL，分别注入2个或5个平皿中，每个平皿0.5mL或0.2mL。同时每个平皿加入含50～100cfu的1mL试验菌，立即倾注相应的培养基，培养后计数。（2）上清液法：取110供试液摇匀后静置10min，取其上清液按常规法或培养基稀释法试验。（3）薄膜过滤法：取1:10供试液摇匀后静置10min或500r/min低速离心5min，取其上清液1mL于100mL pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，按薄膜过滤法操作。
26批样品计数方法按其敏感菌进行培养基稀释法、上清液法、薄膜过滤法验证试验，结果见表1。
表1结果得到枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌在培养基稀释法0.2mL/皿（110供试液）或培养基稀释法0.5mL/皿[120供试液或上清液（110）]或薄膜过滤法条件下试验组和稀释剂对照组回收率均＞70%，表明供试液在此条件下对其基本无抑菌作用。细菌、霉菌及酵母菌计数按培养基稀释法0.2mL/皿（110供试液）或培养基稀释法0.5mL/皿[120供试液或上清液（110）]或薄膜过滤法进行都可行。
2.2控制菌检查方法的验证试验结果
对七个厂家共26个不同批次的样品按常规法、培养基稀释法即取110、120供试液各10mL分别加入100mL、200mL和400mL BL增菌液和营养肉汤或亚碲酸钾肉汤进行两个控制菌铜绿假单孢菌和金黄色葡萄球菌验证试验，结果见表2。
结果为七个厂家共26个不同批次样品试验组常规法、培养基稀释法都检出控制菌铜绿假单孢菌；110的供试液其培养基稀释法400mL都检出金黄色葡萄球菌；120的供试液其培养基稀释法200mL、400mL都检出金黄色葡萄球菌；表明该样品溶液在此条件下对铜绿假单孢菌无抑制作用，铜绿假单孢菌的检查采用常规法就可以；而该样品溶液对金黄色葡萄球菌有一定程度的抑制作用，金黄色葡萄球菌的检查要采用培养基稀释法。
通过方法学验证实验得出，如意金黄散采用培养基稀释法0.5mL/皿（120）进行细菌、霉菌及酵母菌计数检查，控制菌铜绿假单孢菌检查可按常规法进行，金黄色葡萄球菌的检查采用培养基稀释法200mL（120）。按照上述验证过的检查方法对56批如意金黄散进行微生物限度检查，结果都符合规定。
3讨论
控制菌金黄色葡萄球菌的检查虽然也可以采用亚碲酸钾肉汤增菌，但由于亚碲酸钾微溶于灭菌水，溶解时要适当加温；亚碲酸钾对热不稳定，加温温度不能太高，最好溶解后马上使用，否则极易析出结晶；此外亚碲酸钾的加入量要适合，不能超过0.002%，否则亚碲酸钾也抑制金黄色葡萄球菌的良好生长。因此样品杂菌不多时，建议还是采用营养肉汤增菌。
计数方法采用培养基稀释法0.2mL/皿（110供试液）或培养基稀释法0.5mL/皿[120供试液或上清液（110）]或薄膜过滤法都可行，但考虑到样品数量多，计数方法采用培养基稀释法（0.2mL/皿，1∶10的供试液），双碟用量多，费时费力，成本也高；上清液法、薄膜过滤法操作繁琐些。本着简便、快速、节约成本及同时考虑到控制菌的检查，最终选用培养基稀释法（0.5mL/皿，1∶20的供试液）作为计数方法。
如意金黄散生产厂家不同，即使是同一个生产厂家，其有抑菌作用的原药材来源不同，其抑菌作用也不一样，其微生物限度检查方法也就不同；为了统一制定出适合各厂家同一品种的微生物限度检查方法，我们对同一厂家3～4个不同批次进行试验，选取各厂家各批次都可行的方法作为此品种的微生物限度检查方法。
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微生物培养的方法范文5
【关键词】无菌检查；试验；策略
无菌检查法系指检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于药典要求无菌检查的其他品种是否无菌的一种方法[1-2]。无菌 （asepsis） 物体中无活的微生物存在，称为无菌。我国开展药品无菌检查和微生物限度检查已有数十年的历史。新中国第一部药典（1953年版）收载了无菌检查法，以后每部进行了不断的修订和完善，从样品的取样量到培养时间的变化都更加的科学，合理[3-4]。本文对无菌检查试验的存在的问题进行介绍并提出应对策略。
1.无菌检查试验的先天缺陷
1.1采样
由于没有从统计学的角度考虑采样，使无菌检查试验检测污染物的能力受到限制，出现错误结果的可能性很大。有学者从统计学角度分析发现污染率越低对污染物漏检的可能性越大。由于不可能对一批成品的每一包装单位进行检测，所以药品生产者必须遵守GMP进行生产。无菌生产工艺的验证、良好厂房设计、员工的培训，才能取得高水平的无菌保障[5]。
1.2培养条件
研究表明，药典规定的微生物培养条件并不是许多细菌和真菌的最适生长条件[6]。细菌生长在二十五摄氏度到四十摄氏度之间，真菌生长在二十五摄氏度到三十摄氏度之间，而药典规定在二十摄氏度到二十五摄氏度下培养。 药典对温度规定的目的是检测环境中的污染菌。美国药典无菌试验专家委员会推荐25～30℃为细菌、酵母菌和霉菌的培养温度[6]。用不同的培养基检查不同的细菌、酵母菌和霉菌，结果发现， 二十六摄氏度培养真菌和酵母菌10天后，胰酪胨大豆胨肉汤培养基的效率不及蛋白胨肝消化肉汤等培养基[6]。硫乙醇酸盐流体培养基也不适用于苛求厌氧菌的恢复培养[7]。胰酪胨大豆胨肉汤培养基不适用于对苛求微生物的培养。
2.西方国家相应的对策
2.1美国
2012年修订的美国联邦法规21CFR610.12，规定了一个不同于药典描述的无菌检查方法。FDA修订该法规的目的是为了确保生物制品的安全性。21CFR61O.12取消了微生物、培养时间、培养温度、培养基、取样量和采样计划等内容并允许使用非培养的检测方法。
2.2欧洲
欧洲药典的非强制章节“5.1.9无菌试验使用指南”指出，无菌试验合格结果的保证水平取决于批次的均一性、生产条件、采样方法等的有效性；对于最终灭菌产品提供灭菌过程的证据比无菌试验更重要。2007年新载入欧洲药典的“细胞产品的微生物控制”中指的方法可代替无菌检查。
2.3澳大利亚
在2006年的《治疗产品无菌检查指南》中提出了控制无菌检查试验的附加试验一停滞试验。停滞试验目的是要证明使用的培养基在整个培养期是否具有支持生长的能力。《治疗产品无菌检查指南》的原理部分指出：统计学考虑也是无菌检验成功的重要一环；药典无没有对所使用的培养基作具体要求，只是从原则上菌检查方法不利于对低水平污染的检出。
3.对规范我国药品标准中无菌检查试验的思考
3.1应对无菌检查试验做出充分的解释
我国少数药品生产企业的部分从业人员对药品无菌检查试验的原理理解不深，导致无菌检查试验方法不规范。药品监督管理部门对生产企业加强监管的同时，应制订与欧洲药典“无菌试验使用指南”相类似的文件，促进我国药品质量的提高。我国药典没有对无菌检查试验的原理、所起作用等做详细的解释说明。这样导致了部分企业重无菌检查结果，轻质量管理。我国药典或相关法规应以适当方式提示至少注意以下几点：对于最终灭菌的产品提供灭菌过程的证据比无菌检查试验更重要；没有绝对的无菌保证，通过验证很重要；即使整个批次均一，能检测出低水平污染的可能性也是非常小的。
3.2无菌检查方法的制订要考虑生物制品的特殊性
美国、欧洲、澳大利亚的药典或其它法规中，对生物制品的无菌检查方法都另有专门的规定[8-10]。生物制品因为其原料、生产过程、内含成份、具有生物活性等特点，使用单一的无菌检查方法会存在风险[11]。我国也应对生物制品的无菌检查做专门规定，特别在使用培养基和相应培养条件等方面。
3.3抽样方案
国药典规定了不同药物产品的原液、半成品、成品最少抽验数量，没有对抽样方式做具体规定。我国应参考欧洲、美国、澳大利亚的相关规定并结合自身特点，增加对抽样方式的规定。
3.4对培养基的规定
中国药典无菌检查法规定使用2个培养基：硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，用两个培养基完全覆盖所有需要无菌检查的药品并不现实。欧洲药典“细胞产品微生物控制”没有指定培养基，但规定了更严格的培养基促生长性能检查法和基于实践中最可能污染微生物的方法验证。中国应对于某些特殊药品应允许使用经验证的替代培养基。
3.5微生物检验的新技术
应用微生物检验的新技术如生物发光技术、电化学技术、比浊法、固相细胞计数法、流式细胞计数法、脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。微生物检验的新技术与传统的检验方法比较，具有检验简便，速度快的特点，有实时或近实时监控的潜力，能够对生产过程的关键工艺环节作出及时的微生物质量评价，因此在医药行业完全有必要也有可能使用微生物检验的替代方法。采用非药典规定的替代方法进行微生物检验时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。 [科]
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微生物培养的方法范文6
关键词：特色；环境微生物学；课程改革
中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2013）20-0054-02
高等学校实施创新、实践为重点培养的素质教育以来，需要开创相应的教学方式。以前，高等教育偏重于在知识讲授、学生理解和应用层面上开展教学活动，近年来，也有高校进行综合应用和创造性解决问题层面的教学方法探索，但与高等学校的培养目标相距甚远，因而要培养学生的创新精神和实践能力非常困难。信息技术广泛应用于教学领域为培养学生的创造性思维和能力提供了条件。如何处理好创新精神培养与科学态度培养、学习科学知识和解决实际问题能力培养、内部思维操作与外部实际操作、认知发展与情感体验、独立思考与合作探究等课题已倍受国内外教育工作者的普遍关注。环境微生物学是环境工程专业和环境科学专业的主要的专业基础课程。环境微生物学还属于多学科相互交叉的前沿研究领域。本文是针对环境工程专业、环境科学专业的特点，探索一种注重于学生主动收集信息、加工处理信息、解决实际问题，并在实践中获得积极情感体验的教学方式，使学生的学习得到总体提升。本文从以下几方面进行本课程的建设。
一、重视实践教学环节建设，实现工程应用型人才的培养目标
环境微生物学是一门实验技术要求较高的学科，做好实验及实践环节能有效地提高学生工程应用能力。实验课主要培养学生动手、动脑能力，提高创新思维，培养和逐步提高科研能力。在以往的实验课教学中，学生只能做验证性实验，因为结果是已知的，故同学们兴趣不高，也缺乏思考。如何将环境工程微生物学实验技术和前沿进展一同传授给学生，使学生在系统地掌握环境微生物学实验技术体系的同时，也能够运用所学专业知识解决实际问题，这些是很重要的教学内容。根据几年的教学实际，我们进行了一系列改革和尝试，比如构建环境微生物实验课新体系等，而且取得了更好的教学效果。实践教学环节包括基础实验和工程实个环节。
1.改变原有的实验内容，按科研实践顺序重新安排实验内容和实验顺序，建立我校环境微生物学实验课程新体系。由于环境微生物学涵盖的实验内容丰富，环境微生物学和其他的课程存在交叉重叠，所以必须在实验内容上有所取舍。环境微生物学的基础操作占了重要地位，所以首先要让学生牢固掌握这方面的技能，包括培养基的制备，微生物的接种、培养和保存，微生物的染色技术及显微观察实验（如美兰染色法，革兰氏染色法），细菌三程形态的观察及细菌、真菌和放红菌的观察实验。综合性实验包括环境微生物生态学实验（微生物在土壤环境中的分布、类群、活性及其相互作用），环境微生物的监测方法与评价体系，环境微生物分子生态学试验（环境样品总DNA提取技术），微生物法处理技术污染物。大的综合性试验能使学生用微生物的基础知识，解决应用微生物和环境间的一些问题，试验与实际相结合，使学生加深对科学前沿发展情况的了解，开拓视野。
2.用生活实例激发学生的兴趣。在环境微生物学教学过程中，应结合生活，使学生养成使用所学知识关注和改善当今社会上各种环境问题的能力。通过酸雨、白色污染、固体废弃物污染、重金属污染、能源危机等当今社会主要环境问题的讲解，让学生意识到专业的重要性；让学生了解生活中有害微生物，如酸奶里有活性的微生物、发霉物中主要的微生物、校园人工湖的微生物生态及类群、教室和医院微生物中与致病性相关的群落等，将所学融入到日常生活，充分激发学生探索知识的热情。
二、优化理论教学内容、教学手段，体现专业特色
环境学科具有涵盖面广的特点，其专业基础课程《环境微生物学》的教科书涵盖了环境微生物的理论、技术及检测流程等内容。为培养学生学以致用、紧密联系实际的能力，我校教学中应从教学内容与教学手段两方面进行改进。
1.教学内容方面，围绕水、大气、固废污染的防治进行。（1）教材的选取上认真比较。目前，《环境微生物学》教材主要有：高等教育出版社出版，王家玲主编的《环境微生物学》；华中科技大学出版社出版，赵开弘主编的《环境微生物学》；浙江大学出版社出版，郑平主编的《环境微生物学》；哈尔滨工业大学出版社出版，马放、任南琪主编的《污染控制微生物学》。前两本教材的体系基本相同，王家玲主编的教材内容较为宽泛，通过多方面比较，作者认为马放、任南琪主编的这本教材更适合我校环境工程专业选作主教材。（2）教学内容上的取舍。教师切忌照本宣科，应该更结合实际，多增加些创新性的实验，同时讲课中还应该做到有重点、概括、启发。例如要重点讲解环境中的主要微生物类：细菌、真菌、原生动物和后生动物，这些物种的各自结构、特点，因为对污水处理过程中的微生物检测这些内容是很重要的部分；微生物与环境之间的关系、微生物对环境的危害及人利用微生物进行保护环境的实例，如淡水水华、污水处理、有机垃圾发酵沼气等，使学生对该课程学习的重要意义有一个清晰的认识，激发学生对学习该课程的兴趣。
2.采用多媒体的教学手段和多种教学方法相结合，激发学习兴趣，锻炼动手和创新能力。利用多媒体教学使学生有兴趣自主学习本课程，从而提高学习效率。在教学中改变“满堂灌”的教学方法，主要以讨论式、启发式教学，使学生变被动为主动。让学生发挥主观能动性，积极参与各种实验问题的解答，使学生在探讨中学习新知识，并逐渐养成遇到实际问题时，善于用所学过的理论知识进行解决的良好的学习和思维习惯。
对于环境微生物学课，我认为教改难度较大、周期较长。随着杭州电子科技大学环境工程、环境科学课程教学，还会发现更多需要改进和完善的内容。为体现本专业理论与实际相结合的特色，增强学生创新力、竞争力的思想，还需进一步探索《环境微生物学》课程改革的新内容。从2011年新的课程改革实施后，学生认为微生物学和生活联系非常紧密。部分学生参与到教师的科研中，学生能自己设计完整的实验进程，取得了很好的成效。
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