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所见袁枚范文1
【关键词】金融危机 货币美元比索
阿根廷的金融危机发生在2001年，之前，新自由主义作为拯救拉美国家的灵丹妙药被引入，各国在国际贸易和国际金融中普遍使用了新自由主义。阿根廷以这种经济主张为指导制定政策，放松了对进口的管制，使得大量商品从外国进入阿根廷市场，因为阿根廷采用的是盯住美元的汇率政策，美国那时属于强势美元时期，美元对大多数货币升值，所以其他国家商品在进行兑换后价格普遍便宜，大量的进口使得阿根廷欠下巨额外债。同时，由于盯住美元的货币政策，比索相对其他货币也处于升值周期，本来不值那么多钱的商品被高估，这样就导致阿根廷出口受阻。越来越大的贸易逆差使得外债也越来越多。而在那段时间，阿根廷乃至整个拉美地区经济增长都极度缓慢，经济增长的缓慢导致政府得不到足够的税收，也就说政府没钱还外债。最初的导火线是3月一次小的偿债高峰，债权人催促阿根廷还款，但是阿根廷政府没有足够的外汇储备还债。这使得负债累累的阿根廷政府不得不借新债还旧债，阿根廷政府信誉受到严峻质疑。 2001年危机爆发前，阿根廷公私债务的总规模大约为2110亿美元，而就阿根廷当时的外汇储备和财政收入来看，阿根廷是绝对还不起这一数目的，于是债权人陷入恐慌，不相信比索的偿债能力，各银行或国际组织也拒绝给阿根廷贷款。大量外国投资资本外逃，这些资本撤出阿根廷时必然要拿走美元或者本国货币，这就导致阿根廷外汇市场上比索被大量抛出，种种因素结合在一起，使人们普遍预期比索会贬值，在这样强大的预期和对政府的极端不信任下，存款人纷纷抛出比索换取其他值得信任的货币，最终，阿根廷的联系汇率制度再也维持不下去，比索大幅度贬值，而阿根廷的外贸合约，政府公债等等都是以美元标价签订，这一贬值，就使得阿根廷外债从本国来看急剧扩大，阿根廷陷入危机。
这就是本国货币不是国际支付货币的悲哀。
美国在今年也遭受了1933年以来最大规模的金融危机。这一次由次贷引发的经济危机使美国经济整个陷入萧条，按道理说美国政府的偿债能力也应受到质疑，美元应该贬值，美国应该遭受跟阿根廷一样的遭遇，可是没有，美元甚至还升值了，这又是为什么呢？
归根结底就在于美元是世界最值得相信的货币，它在世界范围内自由流通，世界很多国货币几乎都是盯住美元的浮动汇率制，这是由美国长时间保持的世界第一大强国的地位决定的。
美国近年来的贸易逆差使美国欠下大量外债，但这些外债大都是以美元为货币单位的，因为在包括中国在内的对美国出口商品和服务的国家中，绝大多数国家签的都是美元合同，因为美元是最可靠的货币，在外汇市场上不存在大幅度贬值的可能性，而且美元是世界性流通货币，在世界各地都可用于支付，比人民币等货币方便许多，而收到美元作为外汇储备也是最安全的，如中国就是由于常年对美国巨大的贸易顺差，持有了巨额的美元外汇。二来美国由于巨额财政赤字发行了大量国家，许多国家都把美国国债当做是风险极小的有利可图的投资，在美国良好的信誉和强大的国力下，美国国债基本不存在偿付危机，世界上比之更安全的国债似乎不存在，因此许多国家都大量持有美国国债。
美国金融危机全面爆发后，美元确实经历了一段时间的贬值，可是人们没有预期到的是，美元并没有如人们所愿的继续贬值，而是奇迹般的大幅升值。因为在金融危机蔓延的情势下，即使这危机已经使美国损失惨重，可世界上已经没有比美元更安全的货币了。由于大量的外贸合同都是以美元标价，若美元大幅贬值，那么出口国们都要遭受巨大的外汇损失，同时，美国国债的持有者们也会由于美元的贬值遭受利息减少的损失。再者，除开美国，许多国家间的贸易合同也是以美元为货币单位签订，美元在世界范围内的利用太广了，以至于若是美元大幅贬值，或许整个世界支付体系都会出大问题。这也是人们预期美元不会大幅贬值的原因，或者说没有人希望美元大幅贬值。
从供需来说，世界市场上对美元的需求并没有因美国的金融危机而减少，各国之间的支付仍是大量使用美元，对美国的信任使得人们普遍预期美元还会再涨回来，持有美国资产是有利可图的，因此美国并没有出现类似阿根廷的资本抽逃，相反，大量投资涌入美国使得美元需求大幅上升。而且美国政府也开始实施各种各样的救世计划，为保持威信，美国政府也必然不会允许美元大幅贬值，这也是美国实力雄厚的表现之一。
由此我们可以看出，本国货币作为国际支付货币是多么保险的一件事。但是要使本国货币成为世界性支付货币需要强大的国力支持，美国有这样的国力，但是阿根廷没有。这就导致美国财政赤字发国债有人买，不管是自愿的还是被逼迫的（这也是美国强大的表现之一，它可以给中国施加压力逼迫中国用大量的外汇储备购买美国国债），但阿根廷发国债无人问津，因为人们不相信阿根廷能够偿还债务甚至只是支付利息。美元贬值可以吸引大量投资，而比索贬值只会加速资本抽逃也是这一原因。美国不用担心金融危机或者经济萧条会使本国货币大幅贬值，因为美元没被高估，并且绝大多数国家都是用美元来衡量本国货币，它们几乎都只考虑本国货币是否被高估或低估，而不会考虑度量单位的问题，在出现高估或低估后，它们也只是调节本国货币而不会联合起来调节度量单位，但阿根廷做不到，所有人都看到比索被高估，因为就阿根廷的国力和外汇储备，它不可能跟美元1：1。从实际出发的预期也起到了很大的推动作用，大部分人对美元的预期是乐观的，即使美国现在经济衰退，几年后也一定会恢复，况且若美国经济陷入大规模衰退，相信没有国家可以不被殃及，在全世界范围内的经济衰退时，美国仍是相对最发达的。这就是强大国力在世界人民心中建立的威望，但阿根廷做不到，毕竟它的经济比不上它的足球，那时大概没人预期阿根廷境况会好转，也没有人愿意做这一项风险投资。
参考文献
[1]沈安.阿根廷经济跨国公司化及其后果——阿根廷金融危机探源之一.拉丁美洲研究，2003，2.
所见袁枚范文2
关键词：美术；作品；所有权；转移
我国《著作权法》第十八条规定：美术等作品原件所有权的转移，不视为作品著作权的转移，但美术作品原件的展览权由原件所有人享有。美术作品原件的所有权与美术作品的著作权并非同等法律概念。在现实生活中，美术作品原件所有权的转移，往往会误以为美术作品著作权随之发生了转移，但是，取得美术作品原件的所有权，不等于就取得了该美术作品的著作权。举例说明，某画家张三将其所创作的一幅国画卖给了某收藏家李四，收藏家李四当然取得了该国画的所有权，李四合法占有该国画，他可以自己欣赏，也可以提供给他人欣赏、李四也可以出卖甚至丢弃、毁掉该国画；但是，收藏家李四对该国画没有署名权，没有修改权和保护作品完整权，也不能擅自将该国画让人出版发行。与之相应，该国画的著作权仍然属于创作该画的画家张三。由此可见，我国《著作权法》确定的原则是：美术作品原件所有权的转移，不视为美术作品著作权的转移，对此本条的例外规定是，即美术作品的原件所有人享有对美术作品原件的展览权。根据以上的初步分析，结合美术作品所有权转移的司法实践中出现的问题，我们有必要对此进行更进一步的a分析，以便在沥青法理的基础上，深入发掘现行立法的
特点，扬长避短的指导我们的司法实践工作。
美术作品著作权中的“展览权”，也称公开展出权，是指公开陈列美术作品、摄影作品的原件或者复制件的权利。它是著作财产权中的一项重要权利。展览的对象主要是美术作品和摄影作品，但也不排除文字作品的手稿等可以展出的其他作品。美术作品展览权包括作品原件和复制件的展览权，但是，原件所有权人只是享有“原件的展览权”，并不享有著作权。
以下将从美术作品的物权与展览权的冲突、美术作品的可复制性分别与物权和展览权的冲突等方面分析《著作权法》第十八条规定的不恰当性：
一、将美术作品原件之物权，和美术作品原件所承载的著作权进行分离，导致原件的物权和原件所承载的著作权之间的冲突
物权，是指权利人依法对特定的物享有直接支配和排他的权利，包括所有权、用益物权和担保物权。或者说，指自然人、法人直接支配不动产或者动产的权利，包括所有权、用益物权和担保物权。不动产指土地以及建筑物等土地附着物；动产指不动产以外的物。制定物权法，对明确物的归属，充分发挥物的效用，维护经济秩序，促进社会主义现代化建设，具有重要意义。
著作权也称版权，是指作者及其他权利人对文学、艺术和科学作品享有的人身权和财产权的总称。分为著作人格权与著作财产权。其中著作人格权的内涵包括了公开发表权、姓名表示权及禁止他人以扭曲、变更方式，利用著作损害著作人名誉的权利。著作财产权是无形的财产权，是基于人类智识所产生之权利，故属知识产权之一种，包括重制权、公开口述权、公开播送权、公开上映权、公开演出权、公开传输权、公开展示权、改作权、散布权、出租权等等。著作权要保障的是思想的表达形式，而不是保护思想本身，在保障私人之财产权利益的同时，须兼顾文明之累积与知识之传播，算法、数学方法、技术或机器的设计均不属著作权所要保障的对象。
1.美术作品原件所有权，与美术作品的著作权是不同的概念。
依据《著作权法》的规定，美术作品的著作权可以由作者原始取得，或者由其他自然人、法人和其他组织通过购买、赠与或继承等方式继受取得著作权。
美术作品原件具有特殊的艺术价值和不可再现性，美术作品的原件可以通过出售、赠与、遗赠、继承等方式转移到作者之外的人，依据《物权法》等法律规定，原件的合法所有权人，依法对该物享有占有、使用、收益、处分的权利。
2.将“原件展览权”独立于著作权，而归属原件所有人，客观上造“原件展览权”和“复制品展览权”之间的冲突
美术作品的著作权，不因美术作品原件之所有权的转移而发生变化，但是，我们必须认识到著作权中的“展览权”也包括了“复制品”的展览权，比如：意大利文艺复兴时期著名画家达.芬奇的《蒙娜丽莎的微笑》在各地展出了大量的复制品，而其真迹是在法国巴黎的罗浮宫博物馆。
对于美术作品而言，原件展览权和复制品展览权，都具有财产性。按照《著作权法》第十八条的规定：原件所有人仅享有该作品原件的展览权，即公开陈列美术作品、摄影作品的原件的权利，而美术作品的作者仍然享有该作品复制件的展览权。尽管原件因其是真迹而与复制品在展览的角度有着巨大的差别，但是，“展览权”本身是展示美术作品的权利，对于美术作品的展示，“原件”和“复制品”都能体现美术作品的构思、制作、韵味、意境、风格等等体现作者艺术素养和功底的艺术；因此，“原件展览权”和“复制品展览权”势必存在冲突。
3.将“原件展览权”独立于著作权，而归属原件所有人，势必造成“原件展览权”与“美术作品发表权”之间的冲突
所见袁枚范文3
关键词校园文化校园媒体和谐校园
建设高校和谐校园，是遵循教育规律，坚持用科学发展观统领高校事业全面协调可持续发展，培养中国特色社会主义事业合格建设者和可靠接班人的必然要求。是充分调动高校师生积极性、主动性、创造性，实现高校师生全面和谐发展的必然要求。如同和谐社会的建设一样，高校和谐校园建设是一项系统工程，涉及到方方面面的因素。其中，师生共同的思想基础、校园舆论环境、校园文化状况以及高校的社会形象等等因素在和谐校园构建中具有举足轻重的影响。而这些因素的共同基础都与校园舆论宣传的导向息息相关。在构建高校和谐校园进程中，校园媒体作为高校舆论宣传的重要阵地和有效载体，如何进一步突出优势创新职能，实现由“宣传工具”到“信息平台”的功能创新越来越受到关注。本文谨就此作一探讨以期抛砖引玉。
一、发挥舆论引导功能，倡导和谐理念，为和谐校园夯实共同思想基础
以正确的舆论引导人是对媒体的本质要求。当前，我国改革和发展正处于关键时期，社会思想意识空前活跃，各种思想观念相互交织，各种文化相互激荡，各种思潮不断涌现，各种矛盾错综复杂，深刻影响着和谐社会的建设，而高校是社会主义意识形态的重要阵地，也是各种意识形态碰撞和较量的前沿。在这种情势下，更需要用统一的指导思想和共同的理想信念来凝聚人心，强基固本，为政治稳定、校园和谐提供根本的思想保证。校园媒体作为校园主流媒体，一定要强化责任意识、阵地意识，将各种宣传阵地牢牢掌握在自己手中，理直气壮地宣传党的路线、方针、政策，按照构建和谐社会、和谐校园的总要求，正确把握宣传引导的方向，积极谋划宣传引导的思路，切实体现宣传引导的实效，唱响促进校园和谐的主旋律。坚持稳定鼓劲、正面宣传为主的方针，及时把构建和谐社会的理论、方针和高校和谐校园建设的政策部署传播给广大师生员工，让师生能时时处处看到、听到、触摸到和谐的声音，加深对和谐社会理论和构建和谐校园的理解，引导激励师生把智慧和力量凝聚到推进和谐校园建设上来。要充分发挥校报、网络、广播等校园媒体的合力作用，优化信息资源共享，有针对性地组织好宣传报道，大张旗鼓地宣传和谐校园建设发展的成就，弘扬先进典型先进人物事迹、反映师生员工的思想生活，营造积极向上的和谐舆论氛围。要关注校园热点焦点问题，加强对校园舆情的调研分析，积极有效引导校园舆论。通过舆论引导理顺情绪，化解矛盾，营造良好氛围，为和谐校园建设提供精神动力和思想保证。
二、突出信息传播功能，为和谐校园搭建沟通交流平台
当今时代科学技术和信息发展瞬息万变，高校师生时时处于良莠难辨的海量信息中，健康的、颓废的、真实的、虚假的信息充满校园。这就要求校园媒体发挥沟通信息主渠道功能，辨真伪、正视听，坚持传播科学信息，严防虚假信息在校园误传误导。在和谐校园建设中保持信息沟通交流非常重要。高校的各项改革决策、日常管理事事关系师生的切身利益，引起广大师生的高度重视，很容易形成舆论中心。这些舆论形成于校园生活，传播于校园范围，影响于学校建设。处理得好，能争取人心，获取支持；反之，则可能影响学校正常工作的开展。校园媒体要及时准确地将学校的各项工作决策和改革措施传达给师生员工，促进学校各部门、校领导和学校师生之间的互通互动，增进了解；同时。要成为上下沟通的桥梁，积极反映师生的意见和建议，将他们的呼声上传到学校领导和职能部门，促进学校决策的科学化和针对性。尤其是师生关注的重大突发事件及热点问题，应在第一时间迅速作出反应，充分利用各种媒体资源，通过召开新闻会、吹风会，发放信息简报等多种形式，及时把准确、权威的信息告诉师生，避免和遏止谣言、小道消息和虚假信息在校园的传播和蔓延，让权威的声音迅速形成先发优势，以利于事件的处理和问题的解决，维护校园的稳定和谐。校报、校刊、广播、校园网要及时提供信息交流和思想交流的栏目平台，让师生畅所欲言，抒发胸臆，疏通矛盾，化解不良情绪，发挥校园传媒的各自优势，使信息得以传播，观点得以交流，校园更加和谐稳定。
此外，校园媒体也是宣传学校展示形象的窗口。要善于透过校园媒体向社会广泛介绍学校的专业学科和师资力量、办学业绩，宣传学校的良好教风学风校风和优美环境，增强学校师生校兴我荣的集体荣誉感，也使社会各界可以透过校园媒体了解学校、理解学校、支持学校，扩大学校的美誉度和影响力，为学校和谐校园建设营造良好的外部环境。
三、强化思想教育功能，服务人才培养中心工作，促进大学生的全面成长成才
人的和谐是高校和谐校园的核心，促进大学生个性的和谐发展是和谐校园建设的应有之义。大学阶段是青年学生自我发展和个性张扬最活跃的时期，是青年学生树立正确的世界观、人生观、价值观的重要时期。面对纷繁复杂的外部世界，什么是最适合自己的，什么是自己最需要的，常常困惑无所适从，需要通过一定的渠道获取他们喜欢和需要了解的信息、渲泄成长的快乐与烦恼，表达思想情感与激情。校园媒体作为高校师生自己的新闻媒体，报道的内容都是发生在校园师生身边的事情，贴近师生工作学习生活实际，具有很强的可读性和接近性，对师生的影响作用更直接、更有效，这种贴近性、亲和性是其它社会媒介无法比拟的。校园媒体要充分利用这些优势和特点，强化“一切为了学生、为了学生一切、为了一切学生”的理念，充分适应大学生接收新生事物快、求知欲望强烈的群体特点，以更加丰富多彩的内容形式，弘扬科学的世界观、人生观、价值观、荣辱观和社会主义道德准则，对大学生进行润物无声的思想引导、情感熏陶、意志磨炼和人格塑造，引导他们的价值判断和善恶是非观念，实现道德评价与规范，促进大学生人格的和谐健康成长。
当前，尤其要大张旗鼓地以理想信念教育为核心，深入进行树立正确的世界观、人生观和价值观教育；以爱国主义教育为重点，深入进行民族精神教育；以基本道德规范为基础，深入进行公民道德教育；以大学生全面发展为目标，深入进行素质教育。时时事事考虑到大学生的成长与成才，真心做到尊重学生、关心学生、理解学生、爱护学生。要广泛吸纳大学生参与校报、校园网、广播台的实践工作，配备专门老师指导大学生充当校园媒体的记者、编辑、助理，让他们在实践中增长知识技能，培养良好作风，积累工作经验，提高综合素质。
四、发展先进文化，弘扬大学精神，丰富积淀校园文化内涵与精髓
所见袁枚范文4
【关键词】煤炭企业；员工退出机制；探索
近年来，虽然国有煤炭企业人力资源管理制度改革在大步前进，并取得了较好的成绩，但还有一些问题没有得到改善。一是基础管理相对薄弱，因为当下煤炭市场基本面较好，所以缺乏危机感和竞争意识，导致人力资源创新管理没有运行新机制；二是管理体制落后，整体运行还达不到闭环管理；三是某些方面还停留在人为管理阶段，而未进入制度管理状态；四是员工退出机制没有得到完善，无法使企业发展及时补充新生力量。针对上述问题，我们应加大管理创新力度，通过科学规划、合理配置、培训开发、绩效激励和员工退出等机制的不断健全和完善，从而使煤炭企业人力资源管理达到最优状态。
一、员工退出机制的内涵
煤炭企业员工退出机制的建立，是战略发展的需要，为了煤炭企业早日实现人才与开发、岗位与能力、绩效与薪酬等整体规划，和谐开发的必经之路。通过制度建设，结合绩效考核，使那些达不到要求的员工依据不同差距采用降职、调岗、培训、离职、解聘、退休等措施，让那些不能同企业共同发展的员工直接或间接地退出，实现煤炭企业人力资源管理的优化配置。通常认为退出就是与企业解除劳动关系，实际这只是其中的一种方式，在退出之间还存在着缓冲带，如上所述的降职、调岗等，而直接裁员和解除劳动合同是最下策，这样做虽然能够解决和减轻企业存在的一些问题，但由此会引发员工的家庭矛盾、产生激情上访等一系列后遗症，等于把问题推向社会，直接造成了社会的不和谐，而且这些问题出现后就很难在短时间内得以解决。因此，通过员工退出机制的建立健全，能够更好、更快的解决这一突出问题。这也是国有煤炭企业为了提高队伍的市场竞争力而必须进行的有力决策。
二、建立退出机制必要性的探索
过去一段时间，国有煤炭企业在煤炭市场处于低谷时期，曾经通过减员增效来改善经济效益严重滑坡，窘况而被动的局面，于是就掀起了一股下岗、裁员的风潮，造成企业隐性失业明显化，这是国有煤炭企业一次集体的人才退出，频繁的员工流动，造成人才的无序性和随意性，也就是说缺乏科学的员工退出机制，同时也为社会增添部分问题至今没有得到有效解决。
建立和完善员工退出机制，使企业员工处于合理流动状态，企业就好比一间房子，员工的招聘相当于一扇打开的窗户，退出机制相当于另一扇打开的窗户。员工只有招聘，而缺乏退出机制就没有流通的空气，如果长时间下去，房间的空气 就不会新鲜了。员工退出机制是国有煤炭企业人力资源管理系统的重要组成部分，通过科学决策、和谐有效的退出机制，有利于企业的活力与动力，对企业的健康发展至关重要。美国的行为科学家弗雷德里克?赫茨伯格提出来的双因素理论认为，引起人们工作动机的因素主要有两个：一是保健因素，二是激励因素。只有激励因素才能够给人们带来满意感，而保健因素只能消除人们的不满，但不会带来满意感。本文的目的就是探索营造一个能进能出、能者上、庸者下的考核、激励、竞争的氛围，最根本的结果是引入退出机制给员工造成一定的危机感和紧迫感，促使他们保持较高的工作积极性，同时也为他们提高自身的专业技能水平和综合素质提供动力。
三、完善退出方式，消除潜在危害
国有煤炭企业员工退出机制的主要途径：一是实行员工的提前退休计划。员工在取得一定的经济补偿，提前退出工作岗位，享受退休待遇，就像依法破产企业一样，将年龄调整到科学合理，并被企业与员工都能接受的阶段；二是通过实施公开、公正、公平的绩效考核，并根据员工的考核结果做好退出机制的缓冲工作。这一环节如果做得好，就可以从退出机制中获益，如果做得不好，不但不会起到应有的作用，而且还会影响到员工士气和忠诚度。三是实行轮岗转换退出机制。以不断加强培训转岗的管理为抓手，并根据企业发展的需要和员工应当具备的执业标准能力，以及满足岗位任职上岗条件的具体情况，对员工不符合要求和落聘的员工实行岗位退出，进入企业内部人力资源市场，使员工在正规、有序的流动中找到适合自己的岗位；四是对已经达到所任职位年龄高限的中层管理人员，计发一定额度的离职补贴，然后退出中层管理岗位等方式。
四、实现退出机制，提高绩效留人才
成功的国有煤炭企业除了要留住核心员工外，还要有方法使那些对发展造成不利影响的员工退出组织。企业为了保持人力资源的质量，必须对绩效考核结果不佳、无法满足和胜任工作需要的员工进行调整，员工所在岗位也早就不是“铁饭碗”了，如果不能学习新技能，适应新环境，就有被淘汰的危险。因此退出机制能使员工感受到竞争压力，从而激发原动力，使企业的发展充满生机。退出机制建立在绩效考核的基础上，考评结果所反映的员工能力与岗位的匹配程度，显示了国有煤炭企业今后的发展状态是否有持久力。而引进退出机制则能使员工通过暂时的离岗去进修学习，从根本上解决效率低下、人浮于事的局面，规避了员工的职业通道逐渐变窄。退出机制的实行真正有效地避免了各种问题的发生，留住企业所需要的有用之才，为企业的发展壮大增添人力资源保障。
综上所述，人员退出的途径是多样的，但是国有煤炭企业还要根据自身的用工实际制定适宜的员工退出机制，前提条件是必须结合国家法律法规和政策的要求，避免走入误区。
参考文献
[1] 李文武.企业人才退出机制的构建[J].经济与管理，2007（4）：53-55.
[2] 洪 琳.国有企业如何有效发挥薪酬体系的激励性[J].厦门科级，2007（02）：46-48.
所见袁枚范文5
关键词：羧肽酶原B；甲醇酵母；表达；多克隆抗体制备；蛋白质印迹
中图分类号：Q556文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)11-0005-03
Construction and Secreted Expression of Recombinant Procarboxypeptidase B in Pichia pastoris
LI Su-xia, YUAN Qin-sheng
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)
Abstract：Objective To construct the recombinant procarboxypeptidase B in Pichia pastoris. MethodsThe yeast plasmid containing procarboxypeptidase B coding gene was constructed, and then transferred to Pichia pastoris. The positive clone was obtained by G418 resistance selection in His- medium. The rabbit anti-rat recombinant procarboxypeptidase B serum was prepared with recombinant procarboxypeptidase B expressed in E. coli. Western-blotting analysis was used to determine the expressed protein with the prepared antiserum after fermentation and methanol induction of recombinant yeast. Results The rabbit anti-rat recombinant procarboxypeptidase B serum with higher antibody titer was got. The result of Western-blotting analysis showed that the supernatant was positive with the antiserum after methanol induction of recombinant yeast. ConclusionThe recombinant procarboxypeptidase B in Pichia pastoris can be constructed with the successful secretion of recombinant procarboxypeptidase B.
Key words：procarboxypeptidase B; Pichia pastoris; expression; polyclonal antibody preparation; Western-blotting
羧肽酶B（carboxypeptidase B，CPB，EC 3.4.17.2）是一种含锌的胰外肽酶，特异性水解肽链C端的碱性氨基酸：精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸，CPB含307个氨基酸，Mr约35×103。天然CPB由前羧肽酶原B（preprocarboxypeptidase B）产生，其N端包含108个氨基酸（其中13个氨基酸为信号肽序列，95个氨基酸组成活性肽部分）片段，并与C端的CPB相连，前羧肽酶原B在转运到内质网的过程中，信号肽被切掉，得不具有酶活性的羧肽酶原B（procarboxypeptiedase B，pCPB）从细胞中分泌，然后通过胰蛋白酶将其酶解为具有酶活性的CPB和活性肽部分[1]。目前，商业及研究所用的CPB均从动物胰腺提取，价格昂贵，且不能完全去除其他蛋白酶。重组CPB与生物提取的CPB相比，具有无动物源性、无其他蛋白酶混杂等特点。
pCPB可在大肠杆菌中表达，但是以包涵体形式存在，需经过超声波破碎细胞及包涵体复性等过程[2]。所以，我们尝试用甲醇酵母（Pichia pastoris）表达pCPB。甲醇酵母具有高等真核表达系统的许多优点，如蛋白质加工，蛋白质折叠和翻译后修饰等，并且能像大肠杆菌一样便于控制。目前许多蛋白质都可用甲醇酵母表达，例如阳离子依赖的甘露糖-6-磷酸受体、内毒素中和蛋白、马乳铁蛋白等在甲醇酵母中均得到了很好的表达[3]。本研究构建了pCPB重组酵母工程菌株，并用自制抗体对上清表达pCPB进行了蛋白质印迹检测。
1实验材料
1.1菌株与质粒
酵母菌株（Pichia pastoris）GS115（Invitrogen公司）。
质粒pPIC9K（Invitrogen公司）；p473-pCPB（中科院生物工程中心构建，本室保存）。
1.2培养基及相关试剂
1.2.1试剂蛋白胨，酵母提取物，酵母氮源（YNB）等购自Difco公司；各种氨基酸购自生工公司。
1.2.2培养基YPD培养液：2 % 蛋白胨，1 % 酵母提取物，2 %葡萄糖；SD培养基：1.34 %YNB，氨基酸，2 %葡萄糖；MM培养基：1.34 % YNB，4×10-5 %生物素，0.5 % 甲醇；MD培养基：1.34 % YNB，4×10-5 %生物素，2 %右旋糖酐；BMGY：1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，100 mmol/L磷酸钾，pH 6.0，1.34 %YNB，4×10-5 %生物素，1 %甘油；BMMY：1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，100 mmol/L磷酸钾，pH 6.0，1.34 %YNB，4×10-5 %生物素，0.5 %甲醇；10×混合氨基酸用量表（组氨酸缺陷）：L-缬氨酸（1 500 mg/L），L-异亮氨酸（200 mg/L），L-精氨酸（200 mg/L），L-赖氨酸（300 mg/L），L-甲硫氨酸（200 mg/L），L-苯丙氨酸（500 mg/L），L-苏氨酸（2 000 mg/L），L-酪氨酸（300 mg/L），L-尿嘧啶（200 mg/L），L-腺嘌呤半硫酸盐（adenine hemisulfate salt，400 mg/L），L-色氨酸（200 mg/L），L-亮氨酸（1 000 mg/L）。
1.3引物
pCPB-s3：5’-GCGGAATTC CAT GCT TCC GAG GAG CAC TTT GAT GGC-3’（含EcoR I 酶切位点和编码N端9个proCPB氨基酸）。
pCPB-a：5’-CGC AAG CTT TCA CTA ATA TAG ATG TTC TCG GAC ATA ATT-3’（含Hind III酶切位点和编码C端10个氨基酸）。
2实验方法
2.1pPIC9K-pCPB的构建
以本室构建的重组质粒p473-pCPB为模板[2]，用引物pCPB-s3和pCPB-a对模板进行PCR，胶回收后以Not I 和EcoR I 位点酶切将pCPB连接入同样酶切的质粒pPIC9K，测序鉴定pCPB基因以正确读框插入pPIC9K。
2.2pPIC9K-pCPB多拷贝重组子的筛选
用Sal I 酶切pPIC9K-pCPB线性化，用YPD培养甲醇酵母GS115至A600nm至1.2～1.5，按酵母质粒转化方法电击转化线性质粒pPIC9K-pCPB，于SD(His-)平板筛选，第2天至第3天可见含重组基因菌落出现。然后用含不同浓度G418的YPD平板筛选多拷贝重组子。
2.3GS115 pPIC9K-pCPB的诱导表达
选取2个较大的菌落分别接种至BMGY培养基中，第2天离心后倾去培养基，用无菌水洗涤1次，离心去上清，将菌体接入BMMY培养基，此后每天补加0.5 ％甲醇，96 h中每12 h取1 mL培养液离心，留取沉淀和上清样品。
2.4pCPB多克隆抗体的制备与滴定
溶解大肠杆菌表达的pCPB，加入免疫佐剂混匀后免疫家兔，于颈背部皮下、足垫点状多点注射，2周后加强1次，1月后再加强1次。1月后心脏取血，离心，得血清，即为兔抗鼠CPB抗体，将抗血清稀释至不同浓度，与二抗结合，显色，进行抗体滴定。
2.5蛋白质印迹检测pCPB在酵母中的诱导表达
将诱导后96 h的保存样品，破碎菌体后离心上清，与酵母诱导后的培养基同时电泳，转膜后进行蛋白质印迹检测。
3结果与讨论
3.1pPIC9K-pCPB的构建及pPIC9K-pCPB多拷贝重组子的筛选
SD(His-)平板筛选含有插入基因的重组甲醇酵母，第2天至第3天后可见含重组基因菌落出现。挑取较大的菌落至含0.25 mg/mL G418的YPD平板上，第2天再将能生长的菌落挑至含0.5 mg/mL G418的YPD平板上，依次挑取至含0.75，1.0，2.0 mg/mL G418的YPD平板上，最终选取2个菌落做诱导表达。
3.2兔抗大鼠重组pCPB的抗血清制备
用自制的标准重组CPB检测制备的抗血清，结果见图1。由图1可见，抗体稀释1∶5 000，可以得到清晰的明显特异显色的蛋白质印迹条带，表明抗体制备成功，而且抗体滴度较高。
M. 蛋白Marker；1，2，3分别为重组CPB的SDS-PAGE的结果（分别为5，10，15 μL CPB样品）；4，5，6分别为对应1，2，3的蛋白质印迹结果（所用抗体为自制兔抗重组大鼠pCPB抗血清，稀释梯度1∶5 000）
3.2酵母表达pCPB的蛋白质印迹检测
将2株重组酵母培养诱导后检测上清及对菌体行蛋白质印迹检测，结果见图2。由图2可见，4个样品经过蛋白质印迹验证（抗体1∶10 000稀释），在2号菌株诱导后培养液上清中杂出条带，45×103，为pCPB条带的位置，其余3个样品都没有杂出条带。因此，此菌株即为筛选到的阳性菌株。
M. 蛋白Marker；1. 酵母菌株1号菌体；2. 酵母菌株1号发酵后培养液；3. 酵母菌株2号菌体；4. 酵母菌株2号发酵后培养液；5，6，7，8分别对应于1，2，3，4的蛋白质印迹结果（所用抗体为自制兔抗重组大鼠pCPB抗血清，稀释滴度1∶10 000）
图2蛋白质印迹检测pCPB在酵母中的分泌表达
2002年以来，本实验室一直从事重组CPB的研究。利用重组大肠杆菌，分别从包涵体表达和可溶性表达两方面进行研究，包涵体表达蛋白经进一步复性、激活得活性CPB[2, 4]，上清表达的pCPB经激活、纯化后也得活性CPB[5]。本研究进行了pCPB酵母表达的尝试，得到了pCPB的重组酵母菌，为进一步利用该重组酵母制备重组CPB奠定了基础。
参考文献
[1]Burgos F J, Salva M, Villegas V, et al. Analysis of the activation process of porcine procarboxypeptidase B and determination of the sequence of its activation segment[J]. Biochemistry, 1991, 30(16): 4082-4089.
[2]Li S X, Zhang Y J, Tian L P, et al. Cloning, expression of a new procarboxypeptidase B gene in Escherichia coli and purification of recombination carboxypeptidase B[J]. Protein Pept Lett, 2003, 10(6): 581-590.
[3]王黎明，王琦，梅汝鸿．巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展[J]. 微生物学杂志，2004，24（2）：42-45.
所见袁枚范文6
关键词：《多媒体技术》； 网络课程；资源库
中图分类号：TP311文献标识码：A文章编号：1009-3044(2008)20-30391-02
"Multimedia" Construction of the Network Curriculum Resources Exploration
ZHANG Ya-ming1,LIU Zhi-guo2
(1.Shijiazhuang Information Engineering Vocational College,Shijiazhuang 050035,China;2.Shijiazhuang University,Shijiazhuang 050035,China)
Abstract:The multimedia technical application will cause the computer to enter the family,artistic and life each aspect,thus enormously affect people's life and the production method.In order to enhance the teaching level of lesson,we will establish the network curriculum of .This article from the network curriculum of teaching goal,the teaching superiority as well as will construct the question to its resources storehouse which in the process will meet to carry on the discussion,the research.
Key words:;the network curriculum;resources storehouse
1 前言
《多媒体技术》是面向高等院校学生开设的一门计算机课程，其内容包括多媒体制作概述、数字图像处理技术、数字音频处理技术、动画制作技术、视频处理技术、Authorware多媒体创作工具、多媒体软件与使用等7部分。
《多媒体技术》是一门实践性很强的课程，大容量光盘的出现，高速通信的实现，给计算机的多媒体化奠定了物质基础。多媒体技术的应用将使计算机进入家庭、艺术及生活的各个方面，从而极大地影响人们的生活及生产方式。以多媒体技术为理论基础的实践性课程――多媒体制作技术的研究涉及到许多学科和众多领域。从对信息处理，数据压缩到多媒体著作工具，音、视频，动画技术等。该课程体现制作中所涉及的方法、技术与实践，将实践性与实用性结合在一起。
2 《多媒体技术》网络课程的教学目的
《多媒体技术》网络课程的教学目的是以培养学生地操作技能、动手实践的能力为目的，主要讲授各种媒体素材特点及其制作技术。通过教学使学生能达到独立、熟练使用计算机多媒体设备和多媒体制作软件，开发或制作多媒体软件产品的技能。此外，除了实现教学内容的实时交互，教学内容及时更新的同时，还可使学生在自主学习的过程中，学会网上资源的搜寻知识与技巧，提高学生的计算机操作技术与能力。因此，《多媒体技术》网络课程是一门培养学生综合素质的课程。
3 《多媒体技术》网络课程的教学优势
3.1 一定程度满足社会的实际需要
网络课程的内容能反映人们对教育本质的认识，能体现对年轻一代教育问题上的共同价值理念。如学会学习、终身教育。因此，网络教学包含众多有实际价值并与生活密切相关的内容。例如：理解教育，强调相互依存、重视和谐合作的实践态度的培养；环境教育，增强对人类与环境相互关系的理解，发展解决环境问题的技能，树立正确的环境价值观；美学教育，补充贫乏的美学观念，培养对于美学的鉴赏与批评的能力等等。教育的多功能作用，都可以通过网络课程得以同时实现。
3.2 为学生营造探索与创造的空间，培养全面发展的学生个性
在新世纪中，知识成为社会生活的重要内容，创新与创造成为日常工作的主要基调，把素质教育与创新能力的培养作为教育改革的重点，培养学生的探索、反思与创造能力显得尤为重要。网络是一个优秀的教育递送媒介，教育信息贮存媒介，在提供创新环境与创造性学习条件方面具有明显的优势。
在《多媒体技术》网络课程中，通过网络提供的协作学习环境，学生首先可以就某一感兴趣的内容（如图像处理、动画制作等）自主学习，并提出问题、寻找答案；其次，学生可在网上与同学、教师相互探讨，着手解决问题；最后，学生可以创造性地提出自己的创新观念、想法，为《多媒体技术》网络课程增添有利的新资源。这样，学生能在学习过程中提高其协作能力、探索能力、创造能力，并使之具有面对新问题的勇气和自信，从而使个性得以全面的发展。
3.3 体现课程自身的开放性、动态性
网络动态和开放的特点必须影响到网络课程的动态和开放，这个特征没有得到充分发挥的网络课程将不是合格的网络课程。动态、开放可以使网络课程得到不断地充实、完善，能随时做出调整来满足各方面需求。课程自身的动态和开放是时间、空间以及内容上的开放，还表现在：各个知识领域的相互关联；对科学技术进步的开放；教学内容的动态及开放性组织；学习过程组织中的平衡。这种开放、动态性充分体现了时展的特征和网络教学的优势，将知识以课程的形式进行新的组合或分类，构建网络课程结构，体现课程间的关联性，充分表达教学过程中人的活动，使网络课程体系走向有序化和人性化。
4 《多媒体技术》课程资源库的设计
能否提供一个组织良好的教学资源库以及提供灵活选取的方式，直接关系到教师备课时利用组装工具方便地组装各种教学资源的效率，并且能够影响学生使用本教学软件的效果。
4.1 《多媒体技术》资源库信息特征
信息资源由信息、人、符号、载体四种最基本要素构成，其中信息是信息资源的源泉，但信息并非都是资源，只有满足一定条件的信息才能称之为信息资源。换言之，只有经过人类开发和组织的信息才能称之为信息资源。基于网络的《多媒体技术》课程的教学信息资源则是以网络和多媒体机为载体，以提高学生的多媒体制作能力为宗旨，由教育者和参与教学设计的技术人员采集与共同开发，在自主的教学系统中使用的信息。
基于网络的信息资源库则根据网络赋予的优势和网络学习者与教育者使用网络的需要而建构。我们把基于Internet网络的《多媒体技术》教学信息资源划分为三大部分：
（1）为传播者提供的素材资源；
（2）为受传者提供的教材资源；
（3）为通过超链接实观远程登录共享资源而提供的信息检索资源。
4.2 目标学习者的了解与调查
目标学习者的了解、调查主要为了设定课件制作的总体方向。课件为什么人设计?学习者对本课程的基础？学习者的计算机使用技术？学习者使用什么类型设备进行学习?等等这些，都是我们在进行网络课件制作之前所需要调查、了解的。只有做好这些工作，才能使网络课程的设计与开发更加适应于学习者。
《多媒体技术》网络课程的学习者是计算机及相关专业的高等院校学生，具备一定的计算机操作能力、网络使用技术；具有通过网络独立获取和筛选资源库中信息的水平；并使用普通的多媒体计算机进行学习。
4.3 《多媒体技术》资源库的素材获取
《多媒体技术》资源库的构建，主要是以专业教师们在长期授课过程中所积累的优秀案例、学生的优秀作品、及各种素材和教师们的优秀教案、教学课件、本课程的教科书作为该网络资源库的主体内容，而一些出色的的多媒体网站，如： /（宇风多媒体）、/aw/（Authorware爱好者）、/（5D多媒体）、/（奥古多媒体）等则作为本素材库构建的有益补充。
4.4 资源库的结构
（1）优秀案例：根据课程模块分别展示不同的精彩案例，供学生模仿制作。
（2）学生作品：展示历界学生通过对该课程的学习之后所制作出的优秀作品。
（3）素材库：分模块提供不同的原始素材，为学生练习操作提供方便。
（4）教学课件、教案：提供该课程教学时所使用的课件，授课教师及学生均可使用。
（5）讨论交流：提供一个交流平台，通过互相探讨、交流，创新思维、提高技能。
5 结束语
《多媒体技术》网络课程的开设，将是一种新的尝试，旨在更合理、更有效地运用多媒体网络技术进行教学，并使学习者在学习过程中获得协作、探索、创造能力，以及勇气与自信的全面提高。网络课程资源库的建设主要为了学习者进行教学内容以外的，更广泛地搜索、学习有关多媒体技术资料。
参考文献：
