巨噬细胞范文1
关键词：巨噬细胞；鱼红细胞；实验方法；吞噬
中图分类号 G642.0 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）23-17-02
高等动物体内的巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞等多具有吞噬功能，均由骨髓干细胞分化而来，是机体非特异性免疫功能的重要组成部分。当病原微生物或其他异物侵入机体时，由于巨噬细胞具有趋化性，便向异物处聚集，巨噬细胞可将之内吞入胞质，形成吞噬泡，然后在胞内与溶酶体融合，将异物消化分解，这在机体非特异性免疫中具有重要意义。静息的巨噬细胞吞噬功能低下，只有活化状态下的巨噬细胞才具有较强的吞噬能力。现在所用细胞实验教材[1-4]所编列吞噬实验大多用鸡红细胞、羊红细胞、墨水、杆菌[5]、荧光微球等作为吞噬物，本文首次使用鱼血细胞作为吞噬物，对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬效果进行了探索和研究，以期避免使用家禽作为实验材料，并进一步完善了实验方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 鱼血红细胞稀释液的制备 从市场上购买鲫鱼，用注射器尾静脉采血，或解剖后从鱼血窦或心脏抽取鱼血。抽取的鱼血，不添加抗凝剂，直接用无血清L15培养基（Gibco，invitrogen Corporation），稀释10倍。配成10%鱼血红细胞悬液备用。
1.1.2 3%可溶性淀粉溶液的制备 称取可溶性淀粉3g，溶于100mL生理盐水中，混匀后121℃高压灭菌20min备用。
1.2 方法
1.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的诱导 在实验前3d，连续3d定时给小鼠腹腔注射3%淀粉液。注射部位在腹部中央，持针以45°斜角刺入，注意勿伤及内脏或注入肠内，注射后揉动腹部，分散淀粉粒，并观察注射后动物状态，以免小鼠死亡。
1.2.2 鱼红细胞的注射及腹腔液的收集 实验时，小鼠腹腔注射10%鱼红细胞悬液1mL，轻按小鼠腹部，使悬液分散。60min后，用颈椎脱臼法处死小鼠。将小鼠腹面朝上，于腹部中央用有齿尖镊夹起皮肤层，用剪刀剪一环口，撕开腹部皮肤，充分暴露腹膜。此时，向腹腔注射1mL生理盐水，并轻揉腹部片刻。随后用剪刀剪开腹膜成一纵形口，用镊子将两边皮肤夹起来，以防腹腔液流出。把内脏推向一侧后，可用不装针头的注射器或吸管吸取腹腔液，小心操作，以免腹腔内血管破裂，吸取到小鼠腹腔外周血细胞。
1.2.3 制片及染色方法 取腹腔液滴于洁净的载玻片上，按血涂片制备法制备细胞涂片。空气干燥后，载片放入100%甲醇液的固定缸中固定5min。固定后的载片，采用扣染法，即用牙签架起载片，细胞面朝下反扣在玻板上，用Giemsa染色液（Giemsa原液1份，0.075mol/L磷酸缓冲液9份）染色载片，染色时间为20min。染色完成后，揭起载片，用滴管吸取蒸馏水轻缓冲洗载片，洗去多余的染液。
1.2.4 显微观察及吞噬百分率和吞噬指数的计算 载片空气干燥后，在OLympus BX41显微镜下观察，用DP70摄像头进行显微拍摄，并用IPP5.0软件进行显微照片标尺标记。40倍物镜下已能观察到游离的鱼红细胞及吞噬鱼红细胞的巨噬细胞。实验共用小鼠5只，实验过程中未出现死亡，每只小鼠制备5片涂片。每片随机观察数个视野，记录100个吞噬细胞的吞噬结果，计算吞噬百分率、吞噬指数。吞噬百分率（%）=吞噬鱼红细胞的巨噬细胞数/计数的总巨噬细胞数（吞噬及未吞噬的）×100。吞噬指数=巨噬细胞中所吞噬的鱼红细胞数/计数的总巨噬细胞数。
2 实验结果
2.1 巨噬细胞吞噬状态 在普通光学显微镜下，可清晰观察到主要的三类细胞，鱼红细胞、未吞噬鱼红细胞的巨噬细胞（图1中1）及吞噬一个或数个鱼红细胞的巨噬细胞（图1中2～4）。鲫鱼红细胞多为长椭圆形，核常位于细胞中部，胞核染为深紫色。巨噬细胞大多呈不规则形状，胞体表面不光滑，常有突触，细胞核较大，呈肾形、圆形或其他不规则形状，染为紫红色。巨噬细胞吞噬鱼红细胞，常能观察到以下几种吞噬状态：巨噬细胞内鱼红细胞膜仍完整；巨噬细胞内鱼红细胞膜不完整或破裂；巨噬细胞内具有一个或数个大小不等的鱼红细胞细胞核；还可观察到巨噬细胞膜凹陷，鱼红细胞紧贴在凹陷处正在被吞噬。图1显示激活状态的巨噬细胞及多种吞噬鱼红细胞的状态。
2.2 吞噬率和吞噬指数 实验测得小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鱼红细胞的吞噬率为25.0%，吞噬指数为0.31。与鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数相近[6-7]。
3 讨论
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验是生物科学及医学专业本科层次细胞生物学课程开设的实验必修项目。近年来，由于禽流感[8]的流行，细胞生物学教学实验室通过多次试验、反复摸索和研究“小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验”这一实验内容，在传统方法的基础上不断改进。主要的改进有以下3个方面：一是采用小鼠实验前连续3d定时免疫，有效增加了腹腔内处于激活状态的巨噬细胞数量。二是取鱼血红细胞作为吞噬物，且所取鱼血不用添加抗凝剂，直接用不加血清的L15细胞培养液来稀释血细胞，实验效果明显，完全符合实验要求。三是染色方法的好坏直接关系到对实验结果的观察，本实验应用Giemsa染色扣染法，巨噬细胞及鱼红细胞染色均清晰，细胞的形态结构更加明显，能有效地分辨各类细胞的细胞核、细胞浆及吞噬鱼红细胞的各种状态。此实验方法已用于我院本科生实验教学，师生们普遍认为实验结果便于学生观察和计数，有助于学生对吞噬细胞吞噬作用的理解和掌握，提高教学效果。
综上所述，采用鱼血细胞作为吞噬物，实验结果明显，吞噬率及吞噬指数均高于或接近于鸡红细胞的数据，并进一步完善了实验方法，实验结果更直观与清晰。同时巨噬细胞吞噬实验常用于免疫增强药物活性的测定，其中以体内法最能反应实际吞噬能力，这一方法常用鸡红细胞来进行测定，是否也可用便于取材的鱼红细胞来测定，值得进一步实验和探讨。
参考文献
[1]李素文.细胞生物学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2001.
[2]王金发，何炎明.细胞生物学实验教程[M].北京：科学出版社，2004.
[3]桑建利，谭信.细胞生物学实验指导[M].北京：科学出版社，2010.
[4]杨汉民.细胞生物学实验・二版[M].北京：高等教育出版社，1997.
[5]朱兆玲，周红，李美玉，等.吞噬细胞吞噬作用实验方法的改进[J].临床医学工程，2012，19（4）：524-525.
[6]张华，曲震寰，王莹，等.小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与吞噬功能测定[J].黑龙江医药科学，2007，30（5）：9.
[7]汤城，薛雅蓉，余飞，等.一种检测巨噬细胞吞噬鸡红细胞活性新方法的建立[J].畜牧与兽医，2005，37（11）：47-48.
巨噬细胞范文2
关键词：奶牛；巨噬细胞；分离培养
中图分类号：S823.9+1；Q813文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）02-0038-03
巨噬细胞（Macrophage）为免疫活性细胞，是机体免疫系统的重要细胞，在机体固有和适应性免疫功能中扮演着极其重要的角色，可作为抗原呈递细胞在诱导特异性免疫反应中发挥重要作用，其产生的可溶性细胞活素类因子参与调节特异性免疫反应。巨噬细胞也是各类病原的靶细胞[1]，包括分支杆菌、沙门氏菌、衣原体等。
腹腔巨噬细胞是腹腔抗感染的第一道防线，是研究机体自然免疫和获得性免疫关系的重要研究材料。但是迄今为止的报道多为有关小动物如大鼠、豚鼠、小鼠的腹腔巨噬细胞的分离鉴定，绵羊[2]、猪[3]、牛[4]等大家畜也有肺泡巨噬细胞分离的报道，尚未见有关奶牛腹腔巨噬细胞分离鉴定的方法。因此，本研究拟运用RPMI-1640培养液灌洗奶牛腹腔的方法，获得高纯度、高活性的腹腔巨噬细胞并进行相关鉴定，为下一步构建奶牛巨噬细胞噬菌体文库和以巨噬细胞为模型研究奶牛免疫机制奠定基础。
1材料与方法
1.1主要试剂和仪器
RPMI-1640培养基购自Hyclone，小牛血清购自天津灏洋生物工程公司，酸性磷酸酶染液、α-醋酸萘酚酯酶染液，HE染液试剂盒购自南京建成科技有限公司，瑞氏-姬姆萨染色液购自济南百博生物技术有限公司；仪器主要有CO2培养箱、倒置显微镜。
1.2奶牛腹腔巨噬细胞的分离培养
购15日龄雄性奶牛1只，平躺保定，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液500 ml，轻柔奶牛腹部3～5 min，静置7～10 min后，用50 ml注射器抽取腹腔液。离心5 min（1 000 r/min），弃上清，用PBS洗涤3遍，再用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调节细胞浓度至2×106个/ml，接种于培养瓶及6孔培养板，置于37℃、5%CO2培养箱培养2 h，弃上清液，用不含小牛血清的RPMI-1640培养液漂洗2遍，然后加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃、5%CO2培养箱继续培养，并作相关染色和鉴定。
1.3培养细胞的形态学观察
体外培养6 h后，将培养瓶置于倒置显微镜下观察贴壁细胞形态；取已铺满细胞的爬片，晾干后进行姬姆萨染色，光学显微镜下观察细胞形态。
1.4奶牛腹腔巨噬细胞HE染色
取出细胞爬片，固定晾干，按照说明进行染色。
1.5奶牛腹腔巨噬细胞酶化学测定
1.5.1酸性磷酸酶染色（CACP） 取出细胞爬片，固定，晾干，按照说明进行染色。每片计数200个细胞，共观察5片，计算阳性率（胞浆内有棕红色颗粒沉淀物为阳性，胞浆内粉红色为阴性）。
巨噬细胞范文3
【关键词】 辛伐他汀; 巨噬细胞; 基质金属蛋白酶-9; 金属蛋白酶组织抑制因子-1
Abstract:【Objective】 To investigate the effects of simvastatin drug-serum on the expression and secretion of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in U937 monocyte-derived macrophages. 【Methods】 Fifteen New Zealand rabbits were randomized to 3 groups, normal control group (NL, n=5), atherosclerotic model group (AS, n=5) and simvastatin drug-serum group (SIM, n =5). The rabbit atherosclerotic model was developed by high cholesterol feeding. Then they were medicated with simvastatin liquor by gavage to prepare simvastatin drug-serum. U937 monocyte-derived macrophages were incubated with different concentrations (5%, 10%, and 20%) of simvastatin drug-serum for 24 hours. The mRNA expression and protein secretion of MMP-9 and TIMP-1 were detected by RT-PCR and ELISA. 【Results】 Compared to same concentration AS group, 5%, 10%, and 20% SIM group significantly inhibited the expression of MMP-9 mRNA in U937 monocyte-derived macrophages (P=0.005, 0.041, and 0.013), and the expression difference of TIMP-1 mRNA were not significant (all P >0.05). Compared to same concentration AS group, 10% and 20% SIM group not only significantly inhibited the secretion of MMP-9 in U937 monocyte-derived macrophages (P=0.009 and 0.001), but also significantly increased the secretion of TIMP-1 ( P = 0.017 and 0.001) . 【Conclusion】 Simvastatin inhibits the expression and secretion of MMP-9 and enhances the secretion of TIMP-1.
Key words: simvastatin; macrophage; matrix metalloproteinase-9; tissue inhibitor of metalloproteinase-1
冠状动脉粥样硬化斑块由稳定转为不稳定,继而破裂导致血栓形成是急性冠脉综合征最主要的发病机制[1, 2]。斑块脂质核心大、纤维帽薄、巨噬细胞多是结构性易损斑块[3]。斑块内单核巨噬细胞聚集,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)增多,金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP)减少,导致斑块内胶原降解,纤维帽变薄,是斑块稳定性下降的重要原因[4, 5]。临床研究显示他汀对急性冠脉综合征治疗有效,可能与改善内皮功能、抗炎及稳定斑块等调脂以外的作用有关[6],但其具体机制尚未完全明确。本研究拟观察辛伐他汀含药血清对U937单核细胞源巨噬细胞MMP-9及TIMP-1表达与分泌的影响,以探讨辛伐他汀稳定斑块、治疗急性冠脉综合征的机制。
1 材料与方法
1.1 材料准备
雄性纯种新西兰大白兔,体质量2.0~2.5 kg,购自中山大学动物实验中心。人单核白血病细胞株U937细胞,购自中山大学动物实验中心细胞库。辛伐他汀药片,购自默沙东公司,实验时溶解于蒸馏水灌胃。
RPMI 1640培养基,购自Gibco公司。新生牛血清,购自PAA公司。佛波酯(PMA),购自Sigma公司。Trizol reagent,购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒,购自Fermentas公司。Taq酶购自Takara公司。PCR反应引物,由上海生工生物技术有限公司合成。人MMP-9、TIMP-1细胞上清ELISA试剂盒,购自RapidBio公司。
1.2 动脉粥样硬化模型建立及含药血清制备
15只新西兰大白兔随机分为3组:正常对照组(normal, NL)、粥样硬化模型组(atherosclerosis group, AS)和辛伐他汀含药血清组(simvastatin group, SIM),每组5只。正常对照组予普通饲料喂养12周,其余各组予高脂饲料(1%胆固醇、10%猪油、89%普通饲料)喂养10周后,每组随机处死1只,证实有大动脉粥样硬化形成后,继续高脂喂养至12周,其中SIM组于第11周起给予辛伐他汀5 mg/kg,每天1次,灌胃14 d。末次给药前禁食12 h,给药后1 h颈动脉无菌取血,分离血清,同组动物血清混匀,0.22 ?滋m滤膜过滤灭菌,-80 ℃保存备用。
1.3 细胞培养及干预
U937细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基中,置于含5% CO2,37 ℃培养箱中,待细胞生长至接近融合时传代,2~3代后用于实验。调整细胞密度为5×106/mL,接种于6孔培养板,加入PMA使终浓度为50 ng/mL,培养48 h后见悬浮生长的U937细胞分化为巨噬细胞,伸出伪足,贴壁生长。弃去旧培养基,PBS液洗涤后,予不含血清的RPMI 1640培养基继续培养24 h,弃去培养基。分别加入各含5%、10%、20%正常兔血清,5%、10%、20%粥样硬化兔血清,以及5%、10%、20%辛伐他汀含药血清的RPMI 1640培养基,每组设3个平行组,培养24 h用于RT-PCR实验。
1.4 总RNA提取
吸净培养基,每孔加入1 mL的Trizol液,吹打裂解细胞,收集于无RNA酶离心管中,室温静置5 min。加入0.2 mL氯仿,剧烈颠倒15 s,室温静置3 min,4 ℃,12 000 × g离心10 min。转移上层水相液500 ?滋L到新的离心管,加入500 ?滋L异丙醇,室温静置10 min,4 ℃,12 000 × g离心7 min。弃上清,加入1 mL无RNA酶水配制的75%酒精,振荡混匀,4 ℃,7 500 × g离心5 min。重复酒精洗涤沉淀一遍,弃去酒精,室温干燥5 min,融解RNA于30 ?滋L无RNA酶水中,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,紫外分光光度计测定RNA含量,计算出RT-PCR所需样品量。
1.5 RT-PCR
取总RNA1.5 ?滋g,按逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA。以β-actin为内参照,进行半定量逆转录聚合酶链式反应。聚合酶链式反应:95 ℃ 5 min预变性,94 ℃ 45 s变性,56 ℃ 30 s退火,72 ℃ 45 s延伸,共35个循环,最后一次循环在72 ℃延伸7 min。RT-PCR产物用含1.5%琼脂糖凝胶电泳,Labwork成像系统采集图像及分析。合成引物序列,MMP-9-上游引物:5′- AGGACGGCA ATGCTGAT-3′,下游引物:5′- CGCCACGA GGAACAAACT-3′,扩增产物为362 bp;TIMP-1-上游引物:5′- TTCCGACCTCGTCATCAG-3′,下游引物:5′- GCATTCCTCACAGCCAAC-3′,扩增产物为340 bp;β-actin-上游引物:5′- ATCGTGCGTGA CATTAAGG-3′,下游引物:5′-ACAGGACTCC ATGCCCAGG-3′,扩增产物为195 bp。
1.6 ELISA测定
收集细胞上清液,4 ℃,3 000 r/min离心10 min,取上清,-80 ℃保存待检。ELISA采用双抗体夹心法,按照说明书步骤进行,测定细胞上清MMP-9、TIMP-1浓度。
1.7 统计学处理
所有数据均以均数±标准差(x±s)表示,三组间比较用单因素方差分析,两组间比较用LSD-t 检验,应用SPSS 10.0统计分析软件进行统计分析,P< 0.05 为差异有显着性。
2 结 果
2.1 辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞MMP-9 mRNA表达的影响
与相同浓度NL组相比,5%、10%、20%AS组MMP-9 mRNA表达均显着性增高(P值均< 0.05)。与相同浓度AS组相比,5%、10%、20%SIM组MMP-9 mRNA表达均显着性降低(P值分别为0.005、0.041和0.013)。与相同浓度NL组相比,5%、10%SIM组MMP-9 mRNA表达均增高(P值分别为0.034和0.029,表1、图1)。
不同浓度间SIM组MMP-9 mRNA表达差别无统计学意义(F=1.747,P=0.252)。
2.2 辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞TIMP-1 mRNA表达的影响
NL组、AS组和SIM组不同浓度之间TIMP-1 mRNA表达无显着差异(表2、图2)。5%、10%和20%SIM组之间TIMP-1 mRNA的表达有显着性差异(F= 6.498,P=0.032)。与5%SIM组相比,10%、20%SIM组TIMP-1 mRNA的表达显着性增加(P=0.039、0.014),而10%与20%SIM组之间无显着性差异(P=0.446)。
2.3 辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞MMP-9蛋白分泌的影响
与同浓度NL组比较,10%、20%AS组MMP-9分泌均显着性增加(P=0.007、0.002);5%、10%、20%SIM组MMP-9分泌无显着性差异(P=0.824、0.857、0.658)。与同浓度AS组比较,5%SIM组MMP-9分泌无显着性差异(P=0.427),10%、20%SIM组MMP-9分泌显着性减少(P=0.009、0.001,表3)。
SIM组不同浓度之间MMP-9分泌无显着性差异(F=0.985,P=0.427)。
2.4 辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞TIMP-1蛋白分泌的影响
与同浓度NL组比较,AS组TIMP-1分泌均显着性减少(P=0.004、0.044、0.003);与同浓度NL组比较,5%SIM组TIMP-1分泌减少(P=0.038)。与同浓度AS组比较,10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显着性增加(P=0.017、0.001,表4)。
SIM组不同浓度之间TIMP-1分泌有显着性差异(F=6.555,P=0.031)。与5%SIM组相比,10%、20%SIM组 TIMP-1分泌均显着性增加(P=0.038和0.014)。而10%和20%含药血清之间差异无显着性(P=0.456)。
3 讨 论
3. 1 MMP/TIMP与动脉粥样斑块稳定性
急性冠状动脉综合征患者是易损病人[1],通常指在冠状动脉粥样硬化的基础上,斑块破裂,继而血小板粘附聚集和血栓形成,引起完全或不完全的血管阻塞,导致不稳定型心绞痛、非ST段抬高心肌梗死、ST段抬高心肌梗死及猝死。有报道[7-9]冠脉“罪犯”病变处多是软斑块、以正性重构为主,常伴血栓形成。斑块内细胞外基质过度降解,导致斑块中胶原含量减少,纤维帽变薄,是影响斑块稳定的重要因素。斑块破裂常发生在富含单核巨噬细胞的斑块肩部,此处巨噬细胞可分泌大量MMP,促进纤维帽降解[10]。MMP-9,又称明胶酶B,是巨噬细胞分泌的主要基质金属蛋白酶。TIMP是MMP的抑制物,目前已发现有4种:TIMP-1~TIMP-4,它们均可与激活的MMP 呈1 ∶ 1结合,从而使MMP失活。用免疫组化方法检测动脉粥样硬化斑块显示TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3显着性增多,且多存在于斑块肩部的巨噬细胞、纤维帽和脂核内,与MMP分布部位一致,部分抑制MMP的活性[11]。急性冠脉综合征患者存在着由炎症反应导致的以MMP-9升高为主的MMP-9/ TIMP-1失衡状态[2]。因此MMP与TIMP之间的平衡,对斑块稳定性的调节具有重要意义。研究还表明[12],MMP-9在转录水平上受多种细胞因子、生长因子及活性物质的调节,而TIMP的表达很少受细胞因子和生长因子的影响。本实验采用血清药理学方法观察到,与同浓度NL组相比较,5%、10%和20%AS组U937单核源巨噬细胞MMP-9表达均显着性增高(P值均< 0.05)。这可能是因为粥样硬化血清中含有较高的低密度脂蛋白胆固醇,以及大量激活的炎性细胞因子、生长因子以及其他活性物质,促进MMP -9的表达。与相同浓度NL组比较,AS组TIMP-1 mRNA表达无显着性差异,但TIMP-1的分泌均显着性减少(P< 0.05),提示动脉粥样硬化血清不但可使巨噬细胞MMP-9增加,同时还可使TIMP-1分泌增加(翻译后水平)而表达(mRNA水平)并未增加,具体机制尚不清楚。
3. 2 他汀药与MMP/TIMP
PROVE IT(TIMI-22)研究[13]显示强化他汀治疗可使ACS患者30 d的临床事件减少,在稳定的患者,使临床事件长期降低,但其具体机制尚未完全明确。Luan等[14]报道,西立伐他汀呈剂量依赖性抑制兔平滑肌细胞和巨噬细胞MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9,但对TIMP-1和TIMP-2无影响。本研究显示,与相同浓度AS组相比,5%、10%和20%SIM组MMP-9 mRNA表达均显着性降低(P值< 0.05);10%、20%SIM组MMP-9蛋白的分泌显着性减少(P值均< 0.01)。与相同浓度AS组相比,SIM组TIMP-1 mRNA表达无显着性差异(P >0.05);但10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显着性增加(P值均< 0.01)。与Luan等[14]的报道有所不同,本研究显示辛伐他汀不但在一定剂量范围内可抑制巨噬细胞MMP-9的转录与分泌,而且增加TIMP-1的分泌。这可能是辛伐他汀稳定斑块、减少临床事件的机制之一。他汀具有多效作用(Pleiotropic effects)[15],除了调脂作用外,还有抗炎、改善内皮功能等作用。辛伐他汀可能通过抑制巨噬细胞MMP-9的转录与分泌,同时还增加TIMP-1的分泌,从而调节MMP与TIMP之间的平衡,起到稳定斑块的作用。
【参考文献】
FALK E,SHAH P K,FUSTER V. Coronary plaque disruption [J]. Circulation,1995,92(3):657-671.
刘金来, 关良劲, 谢旭晶, 等. 急性冠状动脉综合征患者血浆基质金属蛋白酶及其抑制因子的变化[J]. 中国病理生理杂志,2004,20(10):1921-1922.
NAGHAVI M, LIBBY P, FALK E, et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I[J]. Circulation, 2003, 108(14) : 1664-1672.
CRISBY M, NORDIN-FRIDRIKSSON G, SHSH P K, et al. Pravastatin treatment increases collagen content and decreases lipid content, inflammation, metallproteinases, and cell death in human carotid plaques : implications for plaque stabilization[J]. Circulation, 2001, 103(7) : 926-933.
刘金来, 关良劲, 朱承明, 等. 急性冠状动脉综合征患者颈动脉斑块与血浆基质金属蛋白酶的相关性 [J]. 中国动脉硬化杂志, 2005, 13(6): 763-766.
林 玲, 欧少雯, 吕 红, 等. 阿托伐他汀对老年冠心病患者血小板?琢颗粒膜蛋白的MP-140的影响 [J]. 热带医学杂志, 2007,7(1):55-56.
KOTANI J, MINTZ G S, CASTAGNA M T, et al. Intravascular ultrasound analysis of infarct-related and non-infarct-related arteries in patients who presented with an acute myocardial infarction[J]. Circulation, 2003,23(107): 2889-2893.
VARNAVA A M, MILLS P G, DAVIES M J, et al. Relationship between coronary artery remodeling and plaque vulnerability [J]. Circulation, 2002, 105(8) : 939-943.
王 庆,凌文华. C反应蛋白与动脉粥样硬化不稳定斑块[J]. 中山大学学报:医学科学版,2004, 25(3S):384-386.
LENDON C L, DAVIES M, BORN G, et al. Atherosclerotic plaque caps are locally weakened when macrophage density is increased[J]. Atherosclerosis, 1991, 87(1) : 87-90.
FABUNMI R P, SUKHOVA G K, SUGIYAMA S, et al. Expression of tissue inhibitor of metalloproteinases-3 in human atheroma and regulation in lesion-associated cells: a potential protective mechanism in plaque stability[J]. Circ Res, 1998, 83(3): 270-278.
VAN DEN STEEN P E, DUBOIS B, NELISSEN I, et al. Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) [J]. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2002, 37(6) : 375-536.
RAY K K, CANNON C P, MCCABE C H, et al, PROVE IT-TIMI 22 Investigators. Early and late benefits of high-dose atorvastatin in patients with acute coronary syndromes: results from the PROVE IT-TIMI 22 trial [J]. J Am Coll Cardiol, 2005, 46(8):1405-1410.
巨噬细胞范文4
【摘要】 目的 研究免疫抑制剂对小鼠腹腔巨噬细胞(Macrophage ，M)的损伤作用机制。方法 以小鼠腹腔巨噬细胞为对象，采用小鼠尾静脉注射地塞米松0.15mg/只，环磷酰胺2.0mg/只，小鼠腹腔巨噬细胞培养，检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能及腹腔灌洗液中NO2-/NO3-浓度并用形态学方法观察比较免疫抑制剂对小鼠腹腔巨噬细胞的损伤特点。结果 地塞米松和环磷酰胺均能抑制巨噬细胞功能，与对照组比，细胞吞噬功能均显著下降（P<0.01），DEX组腹腔灌洗液中NO2-/NO3-浓度显著升高，Cy组不升高。VitC为自由基链反应阻断剂，阻断过氧化链式反应可减轻损伤，可使DEX组细胞吞噬功能获得部分恢复。结论 推测环磷酰胺对腹腔巨噬细胞损伤是以直接损伤染色体而DEX以氧化损伤为主。
【关键词】 地塞米松 环磷酰胺 巨噬细胞
The effect of dexamethasone and cyclphosphamide on peritoneal macrophage of mice
【Abstract】 Objective We investigated demage mechanism of peritoneal macrophage(M) induced by injection of dexamethasone and cyclophosphamide in mice.Methods The immune function by determining the phagocytic function and structure of the macrophagocytes of the abdominal cavities of mice in vitro. The phagocytosis of peritoneal macrophages was evaluated by chicken erythrocytes method; Observed the concentratuon of NO-2/NO-3 in the peritoneal lavage fluid.Results Dexamethasone and cyclophosphamide induced the apoptosis of peritoneal macrophage and concomitant decrease of phagocytosis(vs control group，P<0.01)， the concentratuon of NO-2/NO-3 in the peritoneal lavage fluid significantly increased after dexamethasone injection;VitC(inhibitor of iNOS and inhibitor of reactive oxygen species) prevented the apoptosis of peritoneal macrophage and reduced the concentration of NO-2/NO-3 in the peritoneal lavage fluid after the effect of dexamethasone.Conclusion These evidences support that NO and active oxygen species may be involved in the apoptosis process of peritoneal peritoneal macrophage induced by dexamethasone in mice.
【Key words】 dexamethasone cyclophosphamide macrophage
地塞米松和环磷酰胺在临床肿瘤的治疗中是常用的药物，在杀伤肿瘤细胞的同时又会引起免疫系统损伤，而影响治疗效果。巨噬细胞(macrophage，M)是机体免疫体系中重要的免疫效应细胞，具有非特异性直接清除各种异物，杀伤病原体和肿瘤细胞的功能，并具有抗原提呈作用。本实验选用小鼠腹腔巨噬细胞进一步探讨在整体条件下地塞米松和环磷酰胺对免疫功能影响的机制。
1 材料和方法
1.1 实验分组及动物处理 昆明种雄性小鼠，日龄55～58天。60只分为5组：正常对照组；DEX组：腹腔注射地塞米松（Dexa）150μg/只，每日1次，连续注射3次；Cy组：腹腔注射环磷酰胺（Cy）1.5mg/只，每日1次，连续注射3次；VitC+DEX组：与DEX组同时注射；VitC+Cy组：与Cy同时注射；给药第2天上述小鼠腹腔注射2%无菌淀粉1ml。
1.2 腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定 于第4天取各组6只，小鼠腹腔注射5%鸡红细胞1ml，30min后，引颈处死小鼠，腹腔注射D-HanKs 1ml，轻轻按揉腹壁1min，吸出腹腔液滴片。置37°C湿盒孵育30min后，用PBS冲洗，去除未贴壁M?和游离鸡红细胞，1：1丙酮-甲醇固定7～8min，自然晾干。有姬母萨-瑞士染液进行染色，油镜下计数M和M吞噬CRBC数。用下列公式计算吞噬百分率和吞噬指数：吞噬百分率（%）=吞噬鸡红细胞的M/100个M（吞和未吞的）×100% 吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/100个M。
1.3 细胞涂片Giemsa染色 各组小鼠第4天引颈处死，腹腔注射D-Hanks液5ml，吸出腹腔液4℃ 500r/min，去上清与PBS制成细胞悬液，调细胞为1×106个/ml，100μl涂片，凉干后甲醇固定，晾干Giemsa染色，普通光镜下观察细胞形态变化。
1.4 腹腔巨噬细胞NO检测 NO2-/NO3-的测定按NO试剂盒（酶法）说明书操作，最后测定500nm吸光度值。NO2-/NO-3（μmol/L）=（样品管吸光度?空白管吸光度）/（标准吸光度?空白管吸光度）。
2 实验结果
所有数据均采用单因素方差分析法进行统计学分析，并采用Student-NK检验法进一步检验。腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定结果见表1。DEX和Cy注射组小鼠M的吞噬百分率和吞噬指数均明显降低，与生理盐水对照组比较具有高度统计学意义（P<0.01）;VitC+DEX组M的吞噬百分率和吞噬指数比DEX组有显著提高（P<0.01）；VitC+Cy组M的吞噬百分率和吞噬指数较Cy组差异无显著性（P>0.05）。形态学变化可见：DEX组和Cy组较对照组出现明显形态变化细胞变小，染色质凝聚，细胞质浓缩，可见凋亡小体。
腹腔巨噬细胞NO检测结果见图1：小鼠腹腔灌洗液中NO浓度测定显示：与对照组比，DEX组NO2-/NO-3浓度显著上升（P<0.01），而VitC能部分逆转NO浓度（P<0.01），但对Cy组无明显改善（P>0.05）。
表1 腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定结果
注：①与对照组比较，P<0.01;②与对照组比较，P<0.01;③与DEX组比较，P<0.01；④与Cy组比较，P>0.05
图1 腹腔巨噬细胞NO检测结果注：①与对照组比较，P＜0.01;②与DEX组比较，P＜0.01，③与DEX组比较，P＜0.01;④与Cy组比较，P＞0.05
3 讨论
巨噬细胞是机体免疫体系中重要的免疫效应细胞，本实验选用腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的方法来观察免疫抑制剂对巨噬细胞的影响。结果可见，免疫抑制剂可显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力；VitC能明显改善地塞米松对巨噬细胞的影响。文献报道抗氧化剂VitC通过清除氧自由基和降低脂质过氧化提高机体免疫功能［1～3］。机体氧化-抗氧化的平衡对维持正常的免疫功能具有重要的作用，它影响到免疫细胞膜磷脂、细胞内蛋白、核酸的完整性和免疫信号的传导及基因表达。免疫细胞由于其细胞膜磷脂含有较高的不饱和脂肪酸，因此对氧应激非常敏感［4］。已有实验证明VitC有很强的抗氧化作用，注射VitC可明显减弱DEX对小鼠巨噬细胞吞噬功能的抑制作用，分析DEX对巨噬细胞的免疫抑制作用可能与其氧化损伤有关。文献报道［5］抗氧化剂维生素C通过抑制DEX诱导的淋巴细胞凋亡增强淋巴细胞的增殖能力，VitC具有抗氧化作用，提示通过抗氧化促进细胞增殖，抑制DEX诱导的淋巴细胞的凋亡。巨噬细胞具有非特异性直接清除各种异物，杀伤病原体和肿瘤细胞的功能［6］。静止的巨噬细胞胞体小，细胞活性低，吞噬功能弱。当巨噬细胞被激活后，细胞胞体变大、表面突起增多，细胞内有完整的细胞器，且溶酶体、线粒体增多，细胞吞噬功能增强。本实验结果显示，VitC改善巨噬细胞吞噬功能，形态学观察发现，VitC处理的M细胞表面突起增多，细胞伸展率提高并能对抗DEX引起的细胞变小，伸展性差，细胞聚集成团现象。有研究报道DEX可降低M的吞噬作用［7，8］，Grasso等［9］研究发现DEX与M体外共同孵育可抑制M细胞吞噬功能，但培养液中一旦去除DEX，M吞噬功能很快便得到恢复。DEX具有诱导免疫细胞凋亡的作用［10］。M凋亡的机制十分复杂，近年的研究发现许多因素与M凋亡有关。巨噬细胞受到刺激或进行吞噬作用后，发生呼吸暴发，可产生大量的活性氧及NO等活性物质［11］。是巨噬细胞在肿瘤免疫中发挥独特作用的基础，一定浓度的NO又是M凋亡信息传递通路中的关键环节，通过调控巨噬细胞自身凋亡保持巨噬细胞数量恒定［12］。有研究报道凋亡时活性氧和NO或减少或增多［13］，机制尚不清。本实验结果提示DEX诱导巨噬细胞凋亡与NO生成增多有关。NO是一种自由基气体，其不成对电子在氮原子上，为氮自由基参与细胞内和线粒体内的链式反应，VitC为自由基链反应阻断剂，减轻损伤，能部分抑制巨噬细胞凋亡，细胞吞噬机能也获得部分恢复，以DEX组较显著。本实验提示VitC以抗氧化与抑制DEX诱导的M凋亡有关。推测环磷酰胺诱导腹腔巨噬细胞凋亡是以直接损伤染色体而DEX以氧化损伤为主，VitC以抗氧化作用而减轻DEX诱导的M凋亡。
【参考文献】
1 Pardue SL， Thaxton JP. Evidence for amelioration of steroid-mediated immunosuppression by ascorbic acid. Poult Sci，1984，63(6):1262-1268.
2 Olson GE， Poik HC Jr.In vitro effect of ascorbic acid on corticosteroid-caused neutrophil dysfunction.J Surg Res，1997 Feb，22(2):109-112.
3 De Ia Fuente M，Ferrandez MD.Immune function in aged women is improved by ingestion of vitamins C and E.Can J Physiol Pharmacol，1998 Apr，76(4):373-380.
4 ERIC H.KRAUT. Antioidants and immune response in aged person:overview of present evidence.Am J Clin Nutr，1995 Dec，62(6 Suppl):1462-1476.
5 Rojas M ，Rugeles MT.Differential modulation of apoptosis and necrosis by antioxidants in immunosuppressed human lymphocytes.Toxicol Appl Pharmacol 2002 Apr 15:180(2):67-73.
6 Williams MA，Newland AC. The potential for monocyte mediated immunotherapy during infection and malignancy. Part I:apoptosis induction and cytotoxic mechanisms.Leuk Lymphoma，1999 Jun，34(1-2):1-23.
7 Becker J，Grasso RJ.Suppression of yeast ingestion by dexamethasone in macrophage cultures:evidence for a steroid-induced phagocytosis inhibitory protein.Int J Immunopharmacol 1998;10(4):325-338.
8 Grasso RJ，Klein TW.Inhibition of yeast phagocytosis and cell spreading by glucocorticoids in cultures of resident murine peritoneal macrophages.J Immunopharmacol，1981，3(2):171-192.
9 Grasso RJ， West LA.Inhibition of yeast phagocytosis by dexamethasone in macrophage cultures:reversibility of effect and enhanced suppression in cultures of stimulated macrophages.Immunpharmacol，1982-83，4(4):265-78Related.
10 Sonia L. Glucocorticoids-Induced Apoptosis in Lymphocytes.Biochemical and Biophysical Research Communications，2000，279:307-312.
11 Malech HL，Gallin JI.Current concepts:Immunology，Neutrophils in human diseases.N Engl J Med，1987，317(4):687-694.
巨噬细胞范文5
关键词：巨噬细胞：Exosomes；透射电镜；超速离心
中图分类号：Q28
文献标识码：A
文章编号：1007-7847（2014）04-0283-03
Johnstone等研究网织红细胞发育时，发现网织红细胞成熟过程中会分泌出一种囊泡状物质，于是分离纯化了该物质并命名为Exosomes。目前研究认为Exosomes由细胞内多泡体（muiti-vesicular body， MVB）与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径约30～100nm的膜性囊泡，这些小囊泡具有呈递生物相关抗原与免疫治疗作用的特性。
巨噬细胞是目前功能最强的抗原呈递细胞，能刺激初始型T细胞增殖，激发机体免疫应答。巨噬细胞分泌的Exosomes主要表达MHC分子、共刺激分子及特异性抗原肽，并能将抗原刺激信号运送到抗原递呈细胞（antigen-presenting cells，APC）或T淋巴细胞从而诱导特异性免疫应答，发挥重要的免疫调节作用。近些年来Exosomes在免疫调节、肿瘤治疗、疫苗开发等方面的作用已经引起科研人员的极大关注并已经展开了许多基础与临床研究。
但由于Exosomes直径一般在30～100nm内，很难从细胞上清中分离及获得纯度较高的Exo-somes。本文主要利用低温超速离心方法收集巨噬细胞分泌的Exosomes，并对其形态学与生物学特性进行初步的分析鉴定，为后续实验研究奠定了实验技术基础。
1材料与方法
1.1材料
人单核白血病细胞系THP-1来自武汉大学保藏中心。
1.2试剂及仪器
RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Hy-clone公司，CD80、ICAM-3、HSP-70抗体购自美国Santa Cruz生物技术公司、佛波酯（12-邻-14-烷酰佛波醇-13-乙酸酯，PMA）购自德国默克公司，Cocktail蛋白酶抑制剂购自长沙海扬生物技术公司、蔗糖、磷钨酸均购白南京金斯瑞生物技术公司。
美国Beckman超速离心机；日本日立透射电子显微镜；美国Forma Scientific CO2细胞培养箱；倒置显微镜（Olympas）；中国六一垂直电泳仪。
1.3 细胞培养
THP―l细胞于含10%胎牛血清的RPMl-1640培养基中，37℃，5% CO2饱和湿度环境中培养48h后，0.1mmol/L PMA诱导THP-1细胞24h，使其分化形成巨噬细胞。
1.4Exosomes收集
收集巨噬细胞上清液，4℃，4000r/min，离心20min，保留上清；4℃，10000r/min，离心45min，保留上清；4℃，32000r/min，离心60min，保留沉淀，9%蔗糖溶液200μL、lOOx蛋白酶抑制剂2μL溶解沉淀；4℃，40000r/min，离心45min保留沉淀，9%蔗糖溶液50μL、lOOx蛋白酶抑制剂lμL溶解沉淀，-80℃保存备用。
1.5Exosome透射电镜鉴定
取10μL新鲜Exosomes溶液，3%磷钨酸染色5min，将Exosomes滴于铜网膜，65℃烤干，透射电镜下观察其形态大小并拍照保存分析Exo-somes提纯质量。
1.6Western blot
Bradford方法测定Exosomes蛋白浓度；配制10%SDS-PAGE电泳凝胶，将变性后的蛋白质按50μg的蛋白质总量上样电泳，然后通过电转移法将蛋白质转至PVDF膜上，以免抗人CD80、I―CAM-3、HSP-70抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的二抗进行免疫反应，凝胶成像系统观察拍照。
2结果
2.1佛波酯（PMA）诱导THP-1分化成巨噬细胞
THP-1细胞培养48h后细胞密集度达80%后的生长情况，THP-1细胞经0.1mmol/LPMA诱导24h后，分化形成梭形巨噬细胞（图1），分化形成的类巨噬细胞具很强的吞噬功能。
2.2透射电镜鉴定Exosomes
10μL新鲜Exosomes溶液，与3%磷钨酸2μl染色5min后，Exosomes溶液轻轻滴于铜网膜，65℃烤干，透射电镜下观察Exosomes形态学特征（图2A），并利用NanoSight统计系统分析Exosomes溶液中囊泡直径大小，并绘制曲线（图2B）。
2.3Exosomes膜蛋白表达
CD80、ICAM-3和HSP-70 3种蛋白质在不同细胞来源的Exosomes上均有表达，目前认为这3种蛋白质可以作为Exosomes的特征蛋白质。Western blot研究分析巨噬细胞分泌的Exosomes膜上CD80、ICAM-3、HSP-70的表达（图3）。
3讨论
近年来，越来越多的实验结果证明：树突状细胞和肿瘤细胞产生的Exosomes具有显著的免疫调节功能，可转运肿瘤抗原至抗原提呈细胞，诱导细胞毒性T-淋巴细胞反应，产生和增强抗原特异性免疫应答；Exosomes的非细胞性及其不易被体内环境诱导丧失活性、无繁殖能力、稳定性高、体积小易清除、储藏时间长等优点，使Exosomes有可能成为一种很有潜力的新型无细胞治疗性肿瘤疫苗。目前法国科学家研究的树突状来源的Exosomes肿瘤疫苗已经进入临床I期，并且尚未发现任何副作用。Bard等研究报道，肿瘤来源的Exosomes亦可诱导有效免疫应答，如恶性渗出物（胸水、腹水）中的Exosomes同样含有肿瘤抗原和抗原提呈分子，可以诱导产生抗肿瘤一细胞反应。
巨噬细胞范文6
巨噬细胞移动抑制因子（MIF）是一种重要的前炎症因子，主要作用为抑制巨噬细胞的游走移动，促进巨噬细胞在炎症局部浸润、聚集、增生、活化，增强其黏附、吞噬作用，还能促进多种炎性细胞因子的生成。MIF广泛参与机体多种生理及病理生理学反应，包括炎性反应、肿瘤生成和皮肤创伤修复等。MIF在病毒性心肌炎发病机制中起重要作用。近年来，随着克隆MIF cDNA的成功及其结构的阐明，MIF的特殊生物功能及其在不同炎症性疾病中的重要作用已日益为人们所重视。病毒性心肌炎（viral myocarditis，VM）是由亲心肌病毒感染所致以心肌炎症病变为主的疾病，MIF是一种重要的促炎因子，MIF在VMC发病机制及治疗中的作用成为目前研究的热点。因此，本文将MIF的最新进展及其与VM的关系作一综述。
1 MIF的细胞和组织学来源
MIF既产生于激活的T细胞、单核巨噬细胞及脑垂体前叶，也产生于多种组织细胞，哺乳动物的MIF mRNA和蛋白广泛表达于各种各样的造血细胞、中枢和外周神经细胞、具有内分泌和外分泌功能的上皮细胞、脂肪细胞、表皮细胞、汗腺细胞、肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞、血管内皮细胞、角膜上皮细胞及内皮细胞、皮肤角质细胞、肝细胞、肺、前列腺及等[1]。单核巨噬细胞是血液中MIF的主要来源。
2 MIF的膜受体
细胞因子通常需要与其相应的受体结合，活化信号传导途径而发挥生理作用。目前大量研究证实MIF激活丝裂原激活蛋白激酶（MAPKs）家族成员之一的细胞外信号调节激酶（ERK1/ERK2）传导通路，而对其激活方式是受体依赖型还是非受体依赖型的研究也是近年来的热点。2003年Leng等[2]研究发现，CD74是MIF的可能膜受体。MIF可能通过与细胞膜表面蛋白CD74的细胞外基团结合而发挥作用。CD74为MHCⅡ类相关恒定链，是一种跨膜蛋白。MIF与CD74分子的胞外部分即73-232位氨基酸残基高亲和力结合后，激活ERK磷酸化级联反应，从而引起各种细胞的增生及炎性介质的合成与释放，产生各种生理效应，而两种抗CD74抗体（LN2或M-B741）可明显阻抑MIF的上述作用。CD74胞外部分的可溶性片段sCD7473-232及抗CD74 中和性抗体均可抑制细胞膜上的CD74分子与MIF的结合，从而阻抑MIF的促炎作用。
3 MIF的基因与蛋白结构
人类基因组中MIF定位于21号染色体(21q22，3)，为单拷贝基因。但在小鼠基因组中，则是由10个以上假基因组成的多拷贝基因，定位于10号染色体上。MIF的基因较小，人和小鼠的MIF mRNA长度大约为0.8 kb。1995年，美国Duke大学医学中心Picower医学研究所Mitchell等人首次克隆了人MIF基因。人MIF基因全长约2 119 bp，其编码区由3个外显子和2个内含子组成，启动子区域有几个保守的DNA序列可以和转录因子AP1、NF-κB、ETS、GATA、SP1、cAMP结合元件反应蛋白等结合，从而受其调控。在MIF cDNA序列中，第173位碱基G或C的变化构成了MIF的单核苷酸多态性。MIF蛋白结构独特，为α/β结构，以同源三聚体形式存在，通过单体内的β2片层及α2螺旋C末端之间氢键相互作用加以稳定[3]。人和啮齿类动物MIF蛋白质的一级结构为115位氨基酸残基，相对分子量为12.5 kD。不同种动物的MIF蛋白质分子的氨基酸序列同源性大于80%，同源性最高的为大鼠和小鼠的MIF蛋白质，仅差1个氨基酸，人和小鼠的同源性也高达90%。人和大鼠的MIF蛋白质三维结构基本相似，差别仅在于C末端的11氨基酸碱基上。
4 MIF的生物学功能
4.1 免疫调节功能：MIF是先天性免疫和获得性免疫的重要调节因子，是宿主抵抗致病微生物免疫防御系统和应激反应系统中不可缺少的成员。在免疫过程中，MIF不仅有抑制巨噬细胞游走、黏附、吞噬和聚集的功能，还促进其在炎症局部浸润、增生、激活及通过调节细胞信号转导，促进某些细胞因子的表达，分泌细胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ，同时使NO释放增加和磷脂酶A2的表达增强，产生促炎作用[4~5]；而抗MIF中和性抗体则对过度炎症反应具有显著的保护作用；反义MIF可以下调Toll蛋白样受体4-LPS受体复合物的信号转导分子，减少Gˉ细菌LPS诱导的TNF-α产生，同时负性调节NF-κB调节的相关细胞因子基因的转录。
4.2 对肿瘤的作用：有报道发现肺癌、鼻咽癌、膀胱癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、结肠癌、食管鳞状细胞癌、胃癌以及颅咽管瘤等细胞上有MIF mRNA及蛋白表达，并且多数呈高表达[6]。进一步研究可证实转移生长因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor， PDGF）均可上调MIFmRNA及蛋白表达，说明MIF可直接或通过协助其它生长因子而间接地促进肿瘤细胞生长。近期又有发现，抗MIF抗体可有效地抑制肿瘤细胞在淋巴细胞系和血管内皮细胞系中的生长及新血管的形成，从而有效地减慢肿瘤的生长速度。另外，有研究提示，癌细胞的MIF高表达可能影响了肿瘤细胞间的黏附性，使肿瘤细胞更加容易相互分离移动，并向周围邻近组织侵袭，从而促进恶性肿瘤的浸润转移。目前，关于MIF促进肿瘤发生发展的机制还不清楚，有研究认为MIF对抑癌基因P53的抑制作用可能与其致癌作用有关[7，8]。另外，MIF也可以通过促进基质金属蛋白酶MMP-9的表达增加，从而促进癌细胞向淋巴结的转移。
4.3 神经内分泌功能：MIF作为垂体激素和糖皮质激素的一种负反馈调节剂。某些促甲状腺素垂体细胞通过下丘脑-垂体-肾上腺轴起始宿主应答时伴有MIF的释放，在下丘脑切除的裸鼠里注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）后发现垂体细胞释放MIF的量与血清中MIF的量基本接近。在下丘脑-垂体-肾上腺轴受刺激后，垂体以“激素样”方式分泌MIF。MIF可能是一种对糖皮质激素起负调节作用的细胞因子。
4.4 酶学功能：MIF能催化互变异构反应和氧化还原反应，具有3种催化活性作用[9]：为多巴色素异构酶；羟苯丙酮酸互变异构酶，能催化羟苯丙酮和羟苯丙酮酸的酮基-烯酸的互变异构；谷光甘肽（GSH）和二羟酯酰胺作为MIF生理性氧化还原底物，并且它还作为一种新型蛋白质-巯基氧化还原酶参与氧化还原反应。但MIF明确的生理和病理生理功能与催化特性间的关系并未确定。
4.5 损伤修复功能：有研究发现在角膜损伤的愈合过程中，伴随着角膜细胞浸润和内皮细胞的分化，MIFmRNA的表达水平也相应增加。随后发现，在小鼠皮肤损伤愈合过程中，MIF表达有增加趋势，而应用抗MIF抗体可推迟损伤的愈合。近期Mitchell 等发现内源性、外源性MIF均可刺激NIH/3T3成纤维细胞的增殖，MIF的这种促增殖效应与P44/P42有丝分裂原激活的蛋白激酶的活性有关。此外，他们还发现MIF可通过蛋白激酶A来调节胞质中磷脂酶的活性；而外源性增加的rMIF还可逆转糖皮质激素对胞质中磷脂酶A2的抑制作用，
5 MIF与VM
VM是临床较常见的疾病之一，患病率达21.83/10万，且年龄越小，发病率越高。病毒感染后所致的心脏炎症可累及心肌细胞、间质组织、血管成分及心包，而导致急性、亚急性和慢性病变。VM急性期可引起心衰、心律失常等症状，极少数患者因严重心律失常、心力衰竭和心源性休克而死亡。部分患者由于急性期后炎症持续，转为慢性心肌炎，出现进行性心脏扩大、心功能减退、顽固性心律失常，经过数年或更长时间后死于并发症。引起VM的病原体有20余种，但最常见的为柯萨奇病毒B组（coxsackievirus B，CVB），有50%以上的VM与之有关，其次为腺病毒（adenovirus，ADV）。VM的发病机制至今尚未完全阐明，目前多数认为是病毒直接损害和免疫变态反应所致。目前临床上VM常采用支持治疗、中药、抗心力衰竭和抗病毒药物、免疫抑制剂等治疗方法，但疗效欠佳，部分预后不良[10]。因此，深入研究该病的发病机制，阐明其病理生理过程，寻找有效的药物治疗和生物治疗靶点，成为国内外学者研究的热点和难点。
近年来VM发病率呈增长趋势，现已知CVB是VM的主要病原，并认为CVB诱导的心肌炎可能在感染过程中依赖细胞因子的释放，细胞因子在VM发病机制中占有主导地位。MIF是新发现的一种多效型细胞因子，是一种重要的前炎症因子，由单核巨噬细胞、激活的T细胞、角质细胞等产生，其主要作用为抑制巨噬细胞的游走移动，促进巨噬细胞在炎症局部浸润、聚集、增生、活化，增强其黏附、吞噬作用，此外，还能促进IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等多种细胞因子的生成，从而间接增强巨噬细胞的功能，参与机体炎性反应和免疫应答。最近，MIF在心肌炎中的作用受到广泛关注。Matsui等[11]在实验性自身免疫性心肌炎中发现，心肌组织MIF mRNA和蛋白水平明显增加，此外，血清MIF浓度也显著升高，而通过MIF中和抗体阻断MIF的表达则可以明显减轻心肌的病变程度，以及降低心肌中VCAM-1（血管细胞间黏附分子）、IL-1β、TNF-α的表达。同样，Shioji等[12]在研究自身免疫性巨细胞性心肌炎时发现，当注射MIF中和抗体后，心肌炎症病变也显著减轻。郭富强等[13]的研究亦发现，MIF在柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心肌表达上调，与心肌损害程度密切相关。张小佛等[14]报道急性VM患儿血清MIF水平明显升高，并与CK-MB呈正相关。这些研究提示，MIF可能与VM的形成有密切关系，有望成为治疗和预防VM的一种关键靶分子。
6 展望
MIF作为机体的一种多效性的细胞因子，在炎症应答、免疫调节、神经内分泌和细胞增殖中发挥作用，近年来其在VM发生中的致病作用倍受人们关注。尽管目前对其致病机制还不完全清楚，但MIF的中和抗体已经在动物实验和临床上取得较好的疗效，另外，其他拮抗MIF的药物也相继被发现，如维生素E和西替利嗪等。因此，随着研究的深入，针对MIF的干预治疗将为临床治疗VM提供一个新的思路和方法。
参考文献：
[1] Metz CN，Bucala R.Cytokine Ref [M].San Diego:Academic Press，2000.703.
[2] Leng L，Metz CN，Fang Y，et al. MIF signal transduction initiated by binding to CD74[J]. J Exp Med，2003，197(11):1467.
[3] Swope MD，Sun HW，Klockow B， et al.Macrophage migration in-hibitory factor interactions with glutathione and 5-Hexylgluthione[J]. J Biol Chem，1998，273(24):14877.
[4] Abe R，Peng T，Sailor S，et al.Regulation of the CTL response by macrophage migration inhibitory factor[J].J Immunol，2001，166(2):747.
[5] Aeberli D，Leech M，Morand EF. Macrophage migration inhibitory factor and glucocorticoid sensitivity[J].Rheumatology，2006，45(8): 937.
[6] 卞丽娟，李 智.巨噬细胞移动抑制因子与肿瘤[J].国际肿瘤学杂志，2006，33(9):661.
[7] Sun B，Nishihira J，Yoshiki T，et al.Macrophage migration inhibitory factor promotes tumor invasion and metastasis viaRho-dependent pathway[J]. Clin Cancer Res，2005，11(3):1050.
[8] Fingerle RG，Petrenko O，Metz CN，et al. The p53-dependent effects of macrophage migration inhibitory factor revealed by gene targeting[J]. Proc Natl Acad Sci Usa，2003，100(16):9354.
[9] Pennock JL，Wipasa K，Gordge MP，et al.Interaction of macrophage migration inhibitory factor with haematin [J].J Biol Chem， 1998， 273(2)：905.
[10] Magnani JW，Dec GW. Myocarditis:current trends in diagnosis and treatment[J].Circulation，2006，113(6):876.
[11] Matsui Y，Okamoto H，Jia N，et al.Blockade of macrophage migra-tion inhibitory factor ameliorates experimental autoimmune my-ocarditis[J]. J Mol Cell Cardiol，2004，37(2):557.
[12] Shioji K，Kishimoto C，Sasayama S. Fc receptor-mediated inhibitoryeffect of immunoglobulin therapy on autoimmune giant cell my-ocarditis: concomitant suppression of the expression of dendritic cells[J]. Circ Res，2001，89(7):540.
[13] 郭富强，于小华，李双杰，等. 巨噬细胞移动抑制因子在病毒性心肌炎小鼠心肌中表达[J].临床儿科杂志，2007，25(10):818.
