【摘要】目的细胞培养是现代生物技术中最核心、最基础的技术。目前细胞生物学实验课程对原代细胞分离培养技术培训不足。因此文章设计了实验以进一步提高医学生细胞培养技能。方法分离4～6周龄雄性ICR小鼠骨髓细胞，在体外使用含有巨噬细胞集落刺激因子的RPMI1640培养液培养七天，于第三天更换培养液一次，第七天通过乳胶珠吞噬实验检测细胞吞噬能力。结果小鼠原代骨髓单核细胞经巨噬细胞集落刺激因子诱导一周后，分化为巨噬细胞，同时该细胞具有吞噬能力。结论通过实验，学生掌握了相关实验技能；加深对相关理论课程的理解；科研能力及综合素质得到有效提升。
【关键词】细胞生物学；课程设计；细胞原代培养；小鼠骨髓巨噬细胞；细胞分化；细胞吞噬
细胞培养是现代生物技术中最核心、最基础的技术，已成为医学院校学生未来从事临床或科研工作的必备技能之一[1-2]。目前，我系已在长学制临床专业及基础医学专业的细胞生物学实验课程中开设了“细胞培养”实验课程。通过该实验，学生学习、掌握了细胞培养技术的基本知识。但目前，实验课程中开展的细胞培养实验主要针对已建系细胞的传代培养，对原代细胞分离、培养技术培训相对不足。为了进一步提高医学生原代细胞培养技能，在充分考虑本科生的知识水平和实验操作能力、以及我校实验教学中心具备的实验教学条件后，我们设计了“小鼠骨髓巨噬细胞分离培养及细胞吞噬能力检测”综合性实验，于体外分离培养小鼠骨髓单核细胞，使用巨噬细胞集落刺激因子诱导单核细胞分化为巨噬细胞，并检测巨噬细胞的吞噬能力。通过本实验，希望可以使学生学习和掌握无菌操作技术；学习和掌握骨髓单核-巨噬细胞细胞原代培养的基本方法；了解细胞原代培养的一般方法与步骤；掌握细胞分化、细胞吞噬的基础知识。
1材料与方法
1.1实验动物与主要试剂
普通ICR雄性小鼠1只，4~6周龄；RPMI1640培养液（9mL）；PBS缓冲液（10mL）；青霉素/链霉素（5000U/mL，0.1mL）；胎牛血清（1mL）；巨噬细胞集落刺激因子（100μg/L）；乳胶珠（直径3μm，10μL）。
1.2仪器设备
超净工作台（泰斯特，CJ-2D）；37℃、体积分数5%CO2细胞培养箱（Thermo，HERAcell150i）；显微镜（Olympus，CKX41）。
1.3实验教学程序
本实验为综合性实验，共持续两周。其中，第一周实验内容为小鼠骨髓单核-巨噬细胞的分离及纯化；第二周实验内容为巨噬细胞吞噬能力的检测。将学生分为两人一组进行实验操作。具体教学程序设计如下：
1）每次课前安排学生预习任务。在课前要求学生复习并熟悉细胞培养基本知识及操作，了解巨噬细胞、细胞吞噬相关基础知识，从而进一步巩固学生相关理论知识，为实验课程的开展打下良好基础。同时，可适当安排预习作业，由教师指导学生查阅与本实验课程内容相关的文献，通过教师和学生的共同分析、讨论后明确巨噬细胞分离纯化、细胞吞噬能力检测的方法。
2）结合学生预习情况，教师将实验基本原理、实验目标、实验内容、时间安排等对学生做总体介绍。使学生明确不同实验阶段需进行哪些实验操作，达到哪些目标，取得哪些结果。为达到最佳教学效果，于第一周着重介绍原代细胞培养、巨噬细胞相关知识；第二周讲解细胞吞噬的检测方法。
3）小鼠骨髓巨噬细胞的提取、纯化及诱导分化。ICR小鼠经颈椎脱臼法处死后，分离双侧下肢骨，将骨髓用PBS缓冲液冲至15mL离心管中，1200r/min离心5分钟，弃上清，沉淀用PBS缓冲液洗两次，最终获取的骨髓细胞用含体积分数10%胎牛血清、体积分数1%青霉素/链霉素、100μL巨噬细胞集落刺激因子的RPMI1640培养液重悬，并按3×106个/皿接种于直径60mm的细胞培养皿中，置于细胞培养箱中培养，于培养第三天更换细胞培养液一次，第七天进行后续实验[3]。同时，将未加入巨噬细胞集落刺激因子培养的细胞作为对照组，比较诱导分化及未诱导分化的小鼠单核-巨噬细胞形态。
4）巨噬细胞吞噬实验。取第一周制备的小鼠骨髓原代巨噬细胞，于显微镜下观察细胞状态。每皿加入10μL乳胶珠，37℃孵育1小时，弃培养上清，使用4%多聚甲醛固定细胞，自来水洗去未吞噬的乳胶珠后，于显微镜下观测巨噬细胞对乳胶珠的吞噬，并通过细胞计数计算吞噬乳胶珠的细胞比例。
5）讨论与总结。全部实验结束后，要求学生撰写实验报告一份，并与教师进行讨论。要求内容详实，结果部分需包括原代细胞的形态及细胞吞噬能力检测相关结果。分析讨论中需根据实际情况记录在实验过程中遇到的问题及解决方法，以培养学生独立思考、发现问题、解决问题的能力。
2结果
2.1可获得的实验结果
小鼠原代骨髓单核-巨噬细胞贴壁生长，经巨噬细胞集落刺激因子诱导后，细胞呈梭型，并伸出大量伪足，符合巨噬细胞形态，表明小鼠骨髓单核细胞分化为巨噬细胞。同时，可见细胞内有大量被吞噬的乳胶珠，表明小鼠原代骨髓巨噬细胞具有吞噬能力，见（图1）。
2.2对学生能力的培养
通过本实验，学生将掌握小鼠原代骨髓单核-巨噬细胞的制备及纯化方法；掌握细胞吞噬的检测方法；加深对相关理论课程的理解；科研能力及综合素质得到有效提升。
3讨论
3.1开展本实验课程的必要性
如前文所述，细胞原代培养技术是现代生物学技术的重要组成部分，已成为医学生未来从事科研工作的必备技能。而目前的细胞生物学实验课程体系中，由于条件所限，对相关技能培养较少。而本实验的开展将对学生的科研能力、创新能力以及综合素质的培养具有重要作用。首先，通过本实验课程，既可提高学生的细胞培养技术水平，也对学生掌握相关理论课程知识具有良好的促进作用，调动学生参与科研工作的积极性。其次，本实验课程共为时两周，实验内容环环相扣，任何一个环节的失误都有可能导致实验的失败，因此可在本课程中培养学生在长期实验中的耐性和专注度、及严谨、认真、负责的科研精神。最后，在本实验课程的实施过程中，由教师指导学生查阅相关研究领域最新研究进展，并通过充分的讨论分析确认实验方案，通过这一过程，可培养学生查阅汇总文献信息、发现问题、解决问题的能力；并且，教师可在此过程中向学生适时介绍我国科学家在相关领域的重大发现，使学生们认识到人类在科技探索中所展现出的毅力与热情，更重要的是展现我国改革开放以来医学领域的巨大进步与变化，增强学生的民族自信心。本实验的开展也将帮助学生进一步加深相关理论知识的理解。巨噬细胞是机体免疫系统的重要成员之一，包括游离于血液中的单核-巨噬细胞以及定植于体腔和各种组织器官内的巨噬细胞。成体内的单核-巨噬细胞主要起源于造血干细胞，在骨髓中分化发育。最终，骨髓单核细胞在巨噬细胞集落刺激因子等多种生长因子的诱导下分化为成熟巨噬细胞。在体内，巨噬细胞主要通过吞噬、清除异物或衰老损伤的细胞以及分泌炎症因子，发挥呈递抗原、抗感染、抗肿瘤、免疫调节等重要的病生理功能。近年来，巨噬细胞在肿瘤、组织损伤及纤维化、代谢相关疾病、自身免疫病等多种疾病过程中的作用越来越受到人们的重视，已成为相关领域研究者的重要研究课题之一[4-7]。细胞吞噬是巨噬细胞重要的基本生理活动之一，巨噬细胞主要通过该过程发挥清除外源病原体、受损细胞和细胞碎片的作用。细胞吞噬即细胞内吞外源性颗粒物的过程，是受到精密调控的复杂细胞行为，该过程包括细胞对吞噬颗粒物的识别、细胞内信号的转导、细胞骨架重塑、细胞膜变形、溶酶体消化外源性颗粒物等。因此，在细胞生物学理论课教学过程中，在细胞膜、细胞骨架等多个章节的教学内容均会涉及细胞吞噬的相关知识。因此，本实验的开展也将为学生今后的科研工作打下坚实理论基础。
3.2可行性分析
我系与我校实验教学中心相配合，已在多年的教学工作中成功开展了细胞培养实验[8]，有扎实的前期工作基础，在实验条件上无困难。同时，参与本实验的教师均受过良好的细胞生物学、分子生物学教育及训练，具有扎实、丰富的相关理论知识和实验技能，在多年的教学工作中积累了大量的经验，可以圆满完成本实验的教学工作。
综上所述，在本科生教学过程中设计“小鼠骨髓巨噬细胞分离培养及细胞吞噬能力检测”综合性实验，使学生原代细胞培养技能得到进一步提高，也增强了学生对巨噬细胞、细胞分化发育、细胞吞噬等相关细胞生物学基础理论知识的深入理解。通过本综合性实验课程，教师可提高学生发现问题、解决问题的能力，开阔学生思维，培养学生正确的科研价值观和科研素养，同时本实验课程的开展也为学生今后开展临床、基础科研工作奠定了坚实基础。
作者：李丽英 常娜 单位：首都医科大学基础医学院