蛋白酶抑制剂范文1
[关键词] 细胞周期蛋白激酶抑制剂；肿瘤；细胞周期
[中图分类号] R979.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）13-44-04
[Abstract] As normally accepted， the cell proliferation is regulated through cell cycle and the occurrence of tumor may lie in deregulation of cell cycle， directly resulted from the abnormal of the complex of cyclin dependent kinase（CDK）.It has become one of the most effective strategies to inhibit the activity of the complex for dealing with tumors.Thus，the study on CDK/Cylclin complex inhibitors is one of hot focuses in antitumor drug discovery.This thesis mainly discusses the types of CDK/Cyclin inhibitors and their clinical issues.
[Key words] Inhibitor；Cancer；Cell cycle
细胞周期的调控过程是在检查点的监视下，各种调控因子依次激活或灭活，从而启动细胞完成DNA复制，分裂为2个子代细胞的过程。在诸多细胞周期调控因子中，细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）是处于核心位置，其与细胞周期蛋白Cyclins、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKIs）等组成细胞周期调控的网络系统[1]。CDKs是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，目前有13种包括CDK1～13，分别在细胞周期调控CDKs（1～6）和转录调控CDKs（7～13）起作用。细胞周期的调控事实上就是检查点的调控，其中以G1/S调控点最为重要。细胞周期受到外界信号如生长因子等刺激时，催化亚基CDK4/CDK6与调节亚基CyclinD结合后，CDKs残基被磷酸化/去磷酸化修饰而被激活，CDKs激活后催化Rb蛋白使之磷酸化，Rb基因（retinob lastoma gene）又称为视网膜母细胞瘤基因，是第一个被克隆的抑癌基因，其蛋白磷酸化后与转录因子（如E2F）形成复合物的能力丧失，E2F在细胞周期调控中起重要作用，能诱导CyclinE和CDK2的表达并形成CyclinE/CDK2复合体，后者进一步使Rb蛋白磷酸化，充分释放E2F，随后E2F进入核内激活一系列细胞周期进入S期的必须基因的表达。在S期内DNA复制晚期，CDK2被cyclinA激活，使转录因子E2F及时失活，阻止了由持续激活的E2F导致的细胞凋亡[2-3]。
1 CDK/Cyclin抑制剂的种类
研究统计显示，有超过90%的人类癌症中CDK、Cyclin、CKI和Rb途径中相关基因发生了变异，其中CDK和其相应的调节亚基Cyclin的失常最为频繁[2-3]。此外，细胞周期的波动促进了化疗的抗性，降低了化疗的效果。因此恢复细胞周期正常的CDK/Cyclin活性调控是治疗肿瘤的策略之一。药物研究人员已经把寻找不同类型CDK和Cyclin抑制剂作为前沿的抗肿瘤药物的重点研究方向。目前CDK抑制剂主要有内源性的和外源性的两种。
1.1 内源性小分子抑制剂
1.1.1 小分子量蛋白 内源性小分子抑制剂中最大的一类是低分子量蛋白质，根据结构功能的差异分为两大类：一类称双重特异家族INK4，包括p15，p16，p18，p19，该蛋白家族可抑制cyclin D相关激酶的活性，其抑制作用依赖蛋白与相应的游离CDK4结合，从而阻断CDK4与相应cyclin D结合形成具有催化功能的二聚体复合物。另一类叫Kip家族，包括p21，p27，p57，该蛋白家族可以和cyclin E/CDK2与cyclinA/CDK1组成的二聚体复合物再组成三聚体，通过封闭二聚体的催化活性中心从而发挥其抑制作用这些内源性抑制因子与激酶复合物结合后，可特异性地调节其活性，从而精确调节细胞由G1期向S期的转化过程，内源性CDK调节剂的存在不仅提示细胞本身的分裂、增殖具有精密的调控机制，而且也反应了该信号转导系统在细胞周期调控中的重要作用与地位[1-5]。研究表明，多种肿瘤的发生、发展过程与CDKs/cyclins的过度表达或其内源性抑制因子表达下降有关，如p16的缺失与小细胞和黑色素瘤、肺癌、乳腺癌和结直肠癌的发生密切联系[4-7]；p27蛋白的缺失常见于乳癌，前列腺癌，结肠癌以及消化道肿瘤[8-12]。因此，内源性CDKs抑制因子的缺失或基因突变是肿瘤诊断的重要参考指标。
1.1.2 非编码小RNA 内源性小分子抑制剂还有一类是近年来发现的一类重要的非编码RNA――microRNA，MicroRNA是一种长度在21～23nt的非编码RNA，通过与靶基因mRNA 3’UTR区的靶位点区域相互结合而快速有效地降解mRNA或抑制蛋白的翻译，将蛋白控制在生命活动所需的较低或最佳的水平上。已发现的参与细胞周期调控的microRNA已有10余种，其中miR-1-2与miR-34分别靶向CDK4，细胞周期被停滞于G1期，近而抑制肿瘤细胞增殖[13-15]；miR-22靶向CDK6细胞周期停滞于G1期，诱导乳腺癌细胞衰老。在不同的生物学过程中，这些miRNA通过靶向E2F、CDK、cyclin、p21、p27、DNA多聚酶α等促进或阻滞细胞周期的关键调节因子，进而调控细胞周期的进程。
1.2 外源性小分子抑制剂
外源性的抑制剂包括反义核酸、抗体、小分子RNA干扰（siRNA）和小分子化合物四种。小分子化合物是最主要的一类外源性CDK抑制剂。
1.2.1 小分子化合物 近几年来，由于对晶体结构的了解允许人们进行分子模拟研究，在设计开发高效、有选择性的CDKs化学抑制剂的研究方面取得了突破性进展，可以说这类化合物每天都有新的成员在增加[15-17]。目前小分子CDK抑制剂可分为以下13类：（1）嘌呤类（Roscovitine and Olomoucin）、（2）嘧啶类（PD-033299）、（3）黄酮类（Flavopiridols）、（4）噻唑类（SNS-03）、（5）吲哚类及其衍生物（SU951）、（6）哌酮类（Paullones）、（7）咪唑并吡啶、吡唑并吡啶类（AZ703），（8）吡嗪类（AT751）、（9）丁酸内酯类（butyrolactone-1），（10）十字苞碱类（UCN-01）等13种，其中发展较快的为嘌呤类、嘧啶类、氨基噻唑类、黄酮类、吲哚咔唑类似物、Paullones、靛玉红及其衍生物和吡嗪类。已有13个小分子抑制剂进入临床实验阶段。它们都是平面杂环的小分子化学物，与ATP竞争性地结合在CDK激酶的ATP结合位点上。如Seliciclib[CYC202，（R）-roscovitine]是一个2，6，9-三元取代的嘌呤类似物，选择性抑制CDKs/Cyclins，尤其是对CDK2/cyclinE的抑制作用最强。在体外对激酶活性的影响IC50值分别为CDK1/cyclinB（2.69μM）、CDK2/cyclinA（0.71μM）、CDK2/cyclinE（0.10μM）、CDK4/cyclinD1（14.21μM）、CDK7/cyclinH（0.49μM）、ERK-2（1.17μM）、PKA>50μM、PKC>100μM和SAPK>20μM。在体外，CYC202对多种人肿瘤细胞株的增殖有抑制作用，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌等。IC50值范围是7.9～30.2μM，在24h，达到80%凋亡率时，CYC202浓度是20μM。对正常细胞的毒性明显低于对癌细胞的毒性，IC50在22.2～100μM这个范围。CYC202能抑制凋亡抑制基因的表达，通过抑制MDM2的表达，阻滞p53的降解，诱导肿瘤细胞周期停滞G1/S与G2/M期，降低pRb的磷酸化水平，诱导细胞周期各个时相的细胞凋亡。体内实验表明，CYC202耐药性好，口服生理活性良好，对由人结肠癌、子宫癌细胞接种裸鼠体内的实体瘤有明显的抑制作用。CYC202正在进行2个Ib期剂量增加的临床实验，在Ib期研究中发现，10例患有卵巢癌的患者服用CYC2024个月以上，肿瘤没有增加和严重的治疗相关的副作用，其中1个患者的肿瘤缩小了30%以上，治疗1年以上的患者病情稳定。Ⅱ期临床研究发现，CYC202单独应用效果稍差，与其他化疗药物联合应用治疗效果显著。CYC202联合卡培他滨治疗乳腺癌，联合2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷或顺铂治疗肺癌、鼻咽癌的IIb期临床实验也在进行[18-24]。
1.2.2 小分子RNA干扰 小分子RNA干扰技术的发展和应用，使特异性的干预靶分子的基因表达的研究成为可能，有不少科学家开始从基因水平干预CDK/Cyclin的合成。Lima等[25-26]将靶向CyclinE的siRNA转染到肝癌细胞Hep3B、HepG2、SNU449（CyclinE过表达），HuH7（CyclinE没有过表达）后发现，在过表达CyclinE的细胞中，CyclinE的表达下降了90%，DNA合成明显下降，细胞发生凋亡。Galimberti等[27]将分别靶向CyclinE、CDK2、CDK1的siRNA转染鼠肺癌细胞HOP-62、H-522、H-23后，发现CyclinE/CDK2能引起细胞凋亡，抑制肺癌细胞的增殖，而CDK1siRNA对细胞凋亡无影响。CDK1 siRNA干扰导致的CDK1表达降低只引起细胞期阻滞，细胞增殖减慢；而CDK1和CDK2 siRNA的共同干扰作用导致的CDK1、CDK2表达同时降低，引起细胞周期S期和G2/M期的阻滞，同时诱导了细胞的凋亡。曹银芳等[28]成功将靶向CDK2/CyclinE的siRNA重组表达载体转染肝癌HepG2细胞后，发现CDK2和CyclinE mRNA表达显著下降，细胞周期停滞于S期发生阻滞，G1期细胞明显增多，Caspase-3活性增强，HepG2细胞发生了凋亡，并且细胞周期的改变与转染后HepG2细胞体外增殖力下降是一致的。
2 问题与展望
CDK1，CDK2，CDK4，CDK6是热门的抗癌靶标，但由于激酶ATP结合位点高度的保守性，选择性小分子抑制剂的设计与开发是一个公认的难题。因激酶结构的保守性而产生的耐药性和毒副作用，严重阻断了化疗药物的抗肿瘤效应，限制和影响了治疗的效果。研究发现CDKs/Cylcins抑制剂的临床应用出现的最大问题是肿瘤的耐药性导致了肿瘤的复发，疗效明显降低。其抗性的产生与该致癌激酶基因的扩增、补充途径及信号通路的反馈调节相关。此外，其抗性还与药物靶点的单一或群体突变有关，导致了药物与靶点的亲和性差。
siRNA药物诱导的RNAi具有特异性和高效性，是对成瘾性致癌基因实施靶向治疗的理想选择。研究发现，化疗药物与siRNA联合作用于肿瘤细胞，具有协同作用，基因治疗可作为化学治疗药物外的补充途径。Wang等[29]发现，用livin-siRNA表达载体转染肿瘤细胞导致livin基因沉默后，可激活caspase-3并增加肿瘤细胞对紫外线等其他促凋亡刺激信号的敏感性。用RNAi技术下调bcl-2或XIAP基因表达，可增加人乳腺癌细胞MCF-7依托泊苷及阿霉素的敏感性，表现为肿瘤细胞的数量与活性下降、凋亡率增加，较单一化疗药物处理组活性细胞数目明显减少。Chistiane等[30]将针对多药耐药基因MDR1编码的P-gp-siRNA转染人胰腺癌细胞EPP85-181RDB和人胃癌细胞EPG85-257RDB，发现上述细胞对柔红霉素的耐药性分别下降了89%和58%。具有MDR特性的K562细胞经上述siRNA处理后，也观察到类似效果。因此，siRNA干扰技术可能是解决临床上药物抗性的主要手段之一。
CDK及其相关蛋白表达异常与肿瘤的发生和发展密切相关。不少外源性或者是内源性的CDK抑制剂在抑制CDK后，都能很好的抑制肿瘤的发生和发展。然而单独CDK抑制剂治疗，会有肿瘤逃逸的现象，而无法根治肿瘤。因此与其他治疗手段联合的治疗方式，将是CDK抑制剂研究的方向之一。
[参考文献]
[1] Yao G，Lee TJ，Mori S，et al.A bistable Rb-E2F switch underlies the restriction point[J].Nature Cell Biology，2008，10（4）：476-482.
[2] Garrett MD and Fattaey A.CDK inhibition and cancer therapy[J].Current Opinion in Genetics & Development， 1999，9（1）：104-111.
[3] Lapenna S， Giordano Antonio.Cell cycle kinases as therapeutic targets for cancer[J].Drug Discovery，2009，8（1）：547-566.
[4] Shapiro GI.Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment[J].Journal of Clinical Oncology，2006，24（11）：1770-1783.
[5] Malumbres M，Barbacid M.Cell cycle，CDKs and cancer：a changing paradigm[J].Nat Rev Cancer，2009，9（3）：153-166.
[6] Malumbres M，Barbacid M.Mammalian cyclin-dependent kinases[J].Trends Biochem Sci，2005，30（11）：630-641.
[7] Vermeulen K，Bockstaele DRV，Berneman ZN.The cell cycle： a review of regulation， deregulation and therapeutic targets in cancer[J].Cell Prolif，2003，36（3）：131-149.
[8] Senderowicz AM.Targeting cell cycle and apoptosis for the treatment of human malignancies[J].Current Opinion in Cell Biology，2004，16（6）：670-678.
[9] Fleming IN，Hogben M，Frame S，et al.Synergistic inhibition of ErbB signaling by combined treatment with seliciclib and ErbB-targeting agents[J].Clin Cancer Res，2008，14（13）：4326-4335.
[10] Dent P，Curie DT，Fisher PB，et al. Synergistic combinations of signaling pathway inhibitors：Mechanisms for improved cancer therapy[J].Drug Resist Updat，2009，12（3）：65-73.
[11] Jung YJ，Lee KH，Choi DW.Reciprocal expressions of cyclin E and cyclin D1 in hepatocellular carcinoma [J].Cancer Letters，2001，168（1）：57-63.
[12] Green SR，Frame S，Watt K，et al.Identification of pharmacodynamic biomarkers for CYC202 （R-roscovitine），a cyclin dependent kinase inhibitor[J].Proc Amer Assoc Cancer Res，2004，45（1）： 1442-1451.
[13] Keyomarsi K，O'Leary N，Molnar G，et al.Cyclin E，a potential prognostic marker for breast cancer [J].Cancer Research，1994，54（1）：380-385.
[14] Hwang HC，Clurman BE.Cyclin E in normal and neoplastic cell cycles[J].Oncogene，2005，24（1）：2776-2786.
[15] Freemantle SJ，Liu X，Feng Q.Cyclin Degradation for cancer therapy and chemoprevention[J].Journal of Cellular Biochemistry，2007，102（2）：869-877.
[16] Bettayeb K，Oumata N，Echalier A，et al.CR8，a potent and selective， roscovitine-derived inhibitor of cyclin-dependent kinases[J].Oncogene，2008，27（1）：5797-5807.
[17] Misra RN.Clinical progress of selective cyclin-dependent kinase（CDK）inhibitors[J].Drugs of the Future，2006，31（1）：43-52.
[18] 翟德忠，黄强.细胞周期蛋白依赖性激酶cdc2与恶性肿瘤发生发展的研究[J].肿瘤，2006，26（5）：489-491.
[19] Noble MEM，Endicott JA，Johnson LN.Protein kinase inhibitors：insights into drug design from structure[J].Drug discovery，2004，303（5665）：1800-1805.
[20] Hsieh WS，Soo R，Peh BK，et al.Pharmacodynamic effects of seliciclib，an orally administered cell cycle modulator，in undifferentiated nasopharyngeal cancer[J].Clin Cancer Res，2009，15（4）：1435-1442.
[21] Mcclue SJ，Blake D，Clarke R，et al.In Vitro and in Vivo antitumor properties of the cyclin dependent kinase inhibitor CYC202 （R-Roscovitine）[J].International Journal of Cancer，2002，102（5）：463-468.
[22] Meijer L，Raymond E.Roscovitine and Other Purines as kinase inhibitors.From starfish oocytes to clinical trials[J].Accounts of Chemical Research，2003，36（6）：417-425.
[23] Aldoss IT，Tashi T，Ganti AK.Seliciclib in malignancies[J].Expert Opinion on Investigational Drugs， 2009，18（12）：1957-1965.
[24] Appleyard MVCL，Neill1 MAO，Murray KE，et al. Seliciclib （CYC202，R-roscovitine） enhances the antitumor effect of doxorubicin in vivo in a breast cancer xenograft model[J].International Journal of Cancer， 2009，124（2）：465-472.
[25] Lima RT，Martins LM，Guimaraes JE，et al.Specific downregulation of bcl-2 and xIAP by RNAi enhances the effects of chemotherapeutic agents in MCF-7 human breast cancer cells[J].Cancer Gene Therapy，2004，11（1）：309-316.
[26] Li K，Lin SY，Brunicardi FC，et al.Use of RNA Interference to Target Cyclin E-overexpressing Hepatocellular Carcinoma[J].Cancer Research，2003，63（1）：3593-3597.
[27] Galimberti F，Thompson SL，Liu X，et al.Targeting the Cyclin E-Cdk-2 complex represses lung cancer growth by triggering anaphase catastrophe[J].Clin Cancer Res，2010，16（1）：109-120.
[28] 曹银芳，关泽红，刘新风.靶向CDK2、cyclinE的siRNA对HepG2细胞周期及凋亡的影响[J].内蒙古 医学院学报， 2009，3l（3）：191-194.
[29] Wang R，Lin F，Wang X，et al.Silencing Livin gene expression to inhibit proliferation and enhance chemosensitivity in tumor cells[J].Cancer Gene Therapy，2008，15（1）：402-412.
蛋白酶抑制剂范文2
关键词： 组蛋白乙酰化； 曲古抑菌素A； 肿瘤
中图分类号： R73-3 文献标识码： A 文章编号： 1009-8631（2012）09-0121-02
肿瘤已成为当今世界危及人类生命的常见而严重的一种疾病，自上世纪70年代开始人们就致力于癌症的研究，虽然在癌症的发生和发展机制上有了一些了解，但仍不能从其本质上认清。现今人类基因组计划（human genomepr0ject，HGP）基本完成，人们对以癌症的研究转到基因表达调控上。最近的一些研究发现，基因的表达不仅取决于其本身，不改变基因序列的表观遗传修饰也起到一定的作用。表观遗传是指基因表达或蛋白表达的改变不涉及DNA序列变化，但又可以通过细胞分裂和增殖而稳定遗传。表观遗传修饰对于癌症的发生、发展、诊断和治疗具有重要意义[1]。异常的表观遗传修饰将导致基因的不正常表达，从而引起代谢紊乱、疾病的发生甚至致癌。表观遗传修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑和非编码RNA，其中DNA甲基化和组蛋白修饰是主要的，而目前研究最多的是组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂[2]。迄今已开发出的一系列结构不同的HDAC抑制剂药物，主要有羟肟酸衍生物、环状四肽类、氨基甲酸酯类衍生物、苯甲酰胺类衍生物及酮类。羟肟酸类、短链脂肪酸类、环状四肽类、苯甲酰胺类、亲电酮类和其他类。
1 蛋白质去乙酰化酶抑制剂TSA
组蛋白去乙酰化酶抑制剂是一种新的肿瘤诱导分化剂，能够有效抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，促进组蛋白及非组蛋白的乙酰化修饰，在转录和翻译后修饰水平调控肿瘤靶蛋白及凋亡相关蛋白的表达和降解，活化凋亡信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡[3]。曲古抑菌素A（也称制滴菌素） （Trichostation A简称TSA），是众多HDAC抑制剂中的一种，属于羟肟酸类，是链霉素代谢产物，其作用效果是非竞争性可逆的。TSA主要通过调节组蛋白的乙酰化状态来改变染色质结构，进而影响相关基因转录，使高度酰基化的组蛋白积累，肿瘤细胞的形态和功能发生改变，最终导致细胞增殖抑制、诱导分化、凋亡以及端粒酶活性抑制等一系列效应。是目前国际上公认的研究酰基化对细胞影响的可靠模式。
2 肿瘤的发生
肿瘤发生是多方面的，其中细胞周期调控异常是其重要机制。细胞内存在一系列能确保细胞周期的各个事件按正常顺序进行的检查点（checkpoint），当DNA受到损伤或细胞分裂出现异常时，可以适时终止细胞周期，同时启动修复机制。如果这些损伤过于严重而无法修复，则发生细胞凋亡。否则，细胞将发生癌变。
人们研究发现，基因的表达调控与核心组蛋白的乙酰化和去乙酰化密切相关，染色质基因转录活跃则其乙酰化水平高，而在非活跃区则偏低。染色质的主要结构单元是核小体，它是由H2A、H2B、H3、H4各两个形成的一个八聚体，还有位于核小体外部，约占核心组蛋白总量二分之一的H1蛋白。核心组蛋白和缠绕在其上的DNA共同组成了染色质，其氨基末端富含赖氨酸，带正电荷呈碱性。核心组蛋白与DNA紧密结合，通过其氨基末端带正电荷的碱性氨基酸的乙酰基修饰来改变DNA的构象，从而在基因表达过程中起到重要作用。因此，组蛋白的乙酰化和去乙酰化修饰与基因的表达调控有着密切的关联，而组蛋白的乙酰化和去乙酰化状态由两种功能相互拮抗的蛋白酶起作用决定：即组蛋白乙酰化转移酶（histone acetyltransferases，HAT）和HDAC，两者之间的动态平衡控制着染色质的结构和基因的表达。HAT和HDAC活性失衡与肿瘤的发生密切相关，肿瘤细胞中通常发生由于染色体重塑而导致的基因转录调节异常。
总之，HAT对组蛋白的乙酰化可中和组蛋白电荷，使DNA结构更加松散、开放。而HDAC的作用相反，它可通过对组蛋白去乙酰化，使DNA结构更加紧密，从而抑制某些基因的转录表达，影响细胞分裂。
3 TSA的相关实验研究
TSA是目前所知的最有效的HDAC抑制剂，在体外抗肿瘤的研究中发现，纳摩尔（nmo1）浓度的TSA就具有较高活性，呈时间和剂量依赖性方式显著抑制肿瘤细胞增殖。而且发现TSA对所有作用的HDAC都具有相似的Ki（平衡常数），作用是可逆的。TSA在体外对多种肿瘤细胞起作用，包括实体细胞瘤乳腺癌、口腔鳞癌、膀胱癌、胃腺癌、鼻咽癌、肺腺癌、人唾液腺癌、人脑胶质瘤细胞等和血液系统疾病如白血病均表现出良好的杀伤效果，经处理后这些细胞出现明显的细胞凋亡、增殖抑制、细胞周期阻滞。
在乳腺癌细胞系MCF-7、T-47D、ZR-75-1等的体内实验中，Vigushin等发现TSA抗肿瘤作用在500μg/kg～5mg/kg（皮下注射）存在剂量依赖性，并且未见明显毒副作用，同时可显著诱导乳腺癌细胞中组蛋白H4被高度乙酰化[4]。
在口腔鳞癌细胞系Tca-8113细胞研究中，韩斯琴高娃[5]等人通过MTY比色法结果表明，TSA呈时间剂量性抑制Tca-8113细胞的生长，1.2？g/mL的TSA作用72h后细胞生长明显抑制，抑制率可达到80%。端粒酶活性检测实验和蛋白免疫印迹法实验结果表明，它也能降低端粒酶活性及hTERT蛋白表达的变化趋势，这些结果提示TSA能够抑制Tca-8113细胞的增殖，进而下调细胞端粒酶活性及hTERT蛋白表达，这可能是TSA抗肿瘤作用机制之一。该结果与国外Nakamura等人发现肝癌细胞经HDAC抑制剂TSA处理后细胞增殖受抑制及端粒酶活性明显降低的结果相似。
在胃腺癌SGC-7901细胞株的研究表明，TSA处理后细胞变得扁平，呈单层生长，细胞数量呈时间剂量下降，以1.5？mol/L浓度处理最为明显。RT-PCR检测它也能显著抑制端粒酶hTERT-mRNA的表达，且呈剂量依赖关系[6]。
在体外培养的膀胱癌BIU-87细胞株研究中，TSA在纳摩尔级浓度即能有效抑制细胞增殖，在1250nmol/L作用24h时调亡率达到了46.82%。流式细胞术（FCM）结果表明，TSA能显著诱导细胞发生凋亡且主要诱导G1期细胞发生凋亡而出现凋亡峰。RT-PCR结果显示TSA处理能显著诱导p21WAF1mRNA表达，且都呈现出明显的时间-剂量关系[7]。
鼻咽癌CNE2细胞研究，RT-PCR分析表明不同浓度的TSA对CNE2细胞有明显的生长抑制作用，同时TSA可降低CNE2细胞S期激酶相关蛋白2（Skp2）的基因表达，且都表现与剂量有一定关系。此研究初次发现TSA诱导的组蛋白去乙酰化酶抑制与S期激酶相关蛋白2的表达相关[8]。
肺腺癌A549细胞株的研究，张淳珂等发现，TSA作用后A549细胞凋亡率明显增高，呈时间-剂量依赖性。近年来对细胞周期的研究表明，细胞周期中存在G1/S和G2/M期两个重要的调控点。实验显示，应用TSA处理效应细胞后，G1期细胞率未见增高，G2/M期细胞率增高，且呈浓度依赖性，Western blot检测证实，TSA诱导了A549肺腺癌细胞caspase-8、caspase-9裂解活化，随着TSA作用时间延长，其蛋白着色深度逐步升高。提示TSA 具有调控G2/M期检测点的能力，可通过调节细胞周期进程，诱导细胞凋亡而有效抑制肿瘤细胞的生长[9]。
对腺样囊性癌细胞ACC-2的研究，周荣睿等发现TSA能使细胞形态发生明显改变，并能有效抑制ACC-2细胞的增殖，对其具有有杀伤作用，作用呈明显的浓度和时间依赖性。RT-PCR结果显示，TSA处理ACC-2细胞2～16h后，p16INK4a基因启动子区甲基化消失；处理2～24h后，p16INK4a mRNA表达显著增高；但随着作用时间的延长，药效的降低，p16INK4a mRNA的表达也随着降低[10]。
在对脑胶质瘤U251细胞的研究中，MTF法比色检测U251细胞的生长活性受到抑制；流式细胞仪检测显示G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例略有降低，表明发生G0/G1阻滞，随用药剂量的增加还伴有明显的G2/M阻滞；RT-PCR检测显示加入不同浓度TSA后，NDRG2的mRNA和蛋白表达水平明显增高，组蛋白H4的乙酰化水平也明显增强[11]。
在血液系统疾病的研究中，TSA在体外培养体系中对HL-60和K562细胞呈时间计量依赖的生长抑制作用，集落抑制试验结果显示，TSA在与生理剂量的ATRA联用后，集落抑制能力明显增强，表明TSA具有与ATRA体外协同抑制HL-60增殖的作用[12]。
4发展前景
随着人们对肿瘤和抗肿瘤药物研究深入，抗肿瘤治疗的目标是特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞无杀伤力或是极少。众多的研究表明，HADCi是靶向抗肿瘤药物，主要通过抑制HDAC的作用，改变染色质核心组蛋白的乙酰化和去乙酰化水平，从而达到调控基因表达。这类药物通过诱导肿瘤细胞的生长阻滞、分化和凋亡，来达到治疗肿瘤的目的。HDACIs因其多途径、特异、高效的抗肿瘤效果，已经进入抗肿瘤治疗的临床一期或二期研究。研究表明，HDACI和放射性治疗、传统的化学试剂治疗以及新兴分子位点复合物联合使用效果最佳，而且也更安全。更重要的是，HDACI具有逆转肿瘤细胞对其他抗癌药物抗性的作用。
与传统化疗药物相比，HDACi调控多种靶蛋白的表达及稳定性，活化多条信号转导通路，从而诱导细胞凋亡。多项研究表明HDACi与其他化疗药物联合使用时，也能显著降低肿瘤细胞的耐药性，表现出协同治疗的效果，提高化疗药物的杀伤效果。研究表明治疗初期应用TSA，能够增加肿瘤细胞对靶标DNA或拓扑异构酶Ⅱ的化疗药物鬼臼乙叉甙的敏感性。因此，作为一种新的抗肿瘤药物，在应用上我们应当考虑联合使用药物。
通过对TSA大量的研究表明，TSA可诱导多种肿瘤细胞生长阻滞、分化和凋亡，但对其作用机理并不十分明确。在TSA抑制肿瘤细胞机制的研究中，有的表明与端粒酶活性和hTERT蛋白表达有着密切的联系，可能影响hTERT启动子，从而下调hTERT-mRNA的表达。但已知有许多的转录因子可与hTERT启动子结合，如SP1和c-myc，而TSA对能与hTERT启动子结合的哪种转录因子产生作用及其作用机制还不清楚。HDACi可以通过调节细胞周期蛋白和细胞周期蛋白激酶抑制物的表达，诱导肿瘤细胞发生G1和/或G2期停滞。李向臣TSA对滩羊成纤维细胞作为供体细胞的作用的研究中表明，不同浓度TSA处理细胞24h后，细胞周期被明显抑制在G0/G1期，乙酰化水平增高。TSA具有调控G2/M期检测点的能力，可通过调节细胞周期进程，诱导细胞凋亡而有效抑制肿瘤细胞的生长。同时也有研究表示TSA可以提高NDRG的表达水平，NDRG具有抑制细胞增殖的作用，那么NDRG是否与组蛋白乙酰化有关，TSA是否通过NDRG发挥其抗肿瘤的机制，这也是值得思考的问题[13]。S期激酶相关蛋白2（Skp2），Skp2是细胞从G1期进人S期的必需因子，发现TSA诱导的组蛋白去乙酰化酶抑制与S期激酶相关蛋白2的表达相关。TSA能明显抑制ACC-2细胞的生长，结合TSA使p16INK4a mRNA表达升高，从而影响细胞周期的研究结果，推测可能是TSA抑制ACC-2细胞生长的原因之一，也有报道在非小细胞肺癌细胞中，TSA不能诱导p16INK4a蛋白的表达。p16INK4a是作用于细胞周期的重要抑癌基因，其表达的p16INK4a 蛋白是细胞周期G1/S期调控点的重要调控者，通过抑制周期素依赖性激酶4 （Cyelindependent kinase4，CDK4），从而阻止细胞从G1期进入S期，抑制细胞分裂、增殖。综合多数研究说明TSA对肿瘤细胞生长的抑制可能是通过多种途径。
虽然有相关的HDACIs已经进入抗肿瘤治疗的临床一期或二期研究，但关于TSA在动物体内临床试验的研究报告还是相当的少，而有关于其毒副作用及用药情况有待于进一步研究。
近年来人们关于克隆及核移植的研究并不少。目前，对于供体细胞核移入去核的卵母细胞后，所经历的重编程过程的研究主要集中在重构胚的构建、处理及其发展水平上。有研究显示TSA处理的成纤维细胞周期同期化显著，乙酰化水平明显升高，同时重构胚胎发育水平明显提高。用TSA处理供体细胞，能够提高核移植胚胎的发育。TSA可以产生有效变化使得供体细胞更容易重构，而没有副作用。这也许将使TSA成为核移植胚胎处理水平上的一种新药物。
现有的大多HDAC抑制剂治疗癌症生物利用度低、代谢快、不可逆分化并且对癌细胞没有选择性，研究不同HDAC的各种功能和HDAC底物的范围，依据不同HDAC的生物学作用，研制有效的选择性HDAC抑制剂，具有重要的临床意义。HDAC抑制剂TSA的深入研究将有助于药物的合理设计，最终开发出有效的创新药物。虽然目前HDAC抑制剂属于研究的初始阶段，但它将为人类最终战胜肿瘤开辟了新的思路，HDAC抑制剂的研究是一种全新的肿瘤治疗途径。HDAC抑制剂的开发有着极大的临床和社会价值。
参考文献：
[1] Jones PA，Baylin SB.The epigenomics of cancer[J].Cell，2007，
128（4）：683-692.
[2] Miremadi A，Oestergaard MZ，Pharoah PD，et a1.Cancer geneticsof epigenetic genes[J].Hum Mol Genet，2007，16（1）：28-49.
[3] 汪秀伟.组蛋白乙酰化与肿瘤的相关研究[J]. 国际检验医学杂志，2011，32（10）：1100-1101
[4] 朴松山，金铁峰，金虎日.曲古抑菌素A抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和诱导其凋亡的作用[J].中国临床医学，2010，17（1）：136-138.
[5] 韩斯琴高娃，毛立民，张冰，等.TSA对Tca-8113细胞抑制作用及端粒酶的影响[J].现代口腔医学杂志，2010 ，24（2）：117-120.
[6] 刘立玺，石巍，廖爱军，等.曲古抑菌素A对人胃腺癌SGC-7901细胞株增殖及其端粒酶hTERT—mRNA表达影响的研究[J].美国中华临床医学杂志 ，2005，7（2）：132-134.
[7] 李功成，张旭，李龙承，等.曲古抑菌素A对膀胱癌细胞的抑制作用及其机制[J].中国现代医学杂志，2005，15（7）：993-996.
[8] 杨小丽，刘晓春，覃蒙斌，等.曲古抑菌素A对CNE2鼻咽癌细胞增殖及凋亡的影响[J].山东医药，2010，50（27）：39-40.
[9] 张东，刘长庭，于晓妉，等.曲古抑菌素A对人肺腺癌细胞A549的生长抑制作用[J].中国医学科学院学报，2010， 2：167-170.
[10] 周荣睿，田臻，黄枫豪，等.曲古抑菌素A对腺样囊性癌细胞ACC-2增殖及p16^INK4a启动子区甲基化、mRNA表达的影响[J]. 中国口腔颌面外科杂志， 2008， 6（3）：194-199
[11] 洪杨，尚超，桑猛，等.FUBP1基因在脑胶质瘤中的表达及其对U251细胞凋亡的影响[J].现代肿瘤医学，2011，19（8）：1525-1527.
蛋白酶抑制剂范文3
【摘要】
目的建立一种能够检测不同分子大小（尤其是低分子量）蛋白酶抑制剂的电泳方法。方法根据特异蛋白酶抑制剂抑制靶蛋白酶活性的原理，借助明胶-Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，胶板经蛋白酶水解后，以考马斯亮蓝染色。结果小分子量的胃蛋白酶抑制剂与较大分子量的BBI均能在该方法中显示出活性带，并且利用该方法检测到山合欢种子中含有一种胰蛋白酶抑制剂。结论该方法能够满足不同分子大小、不同类型蛋白酶抑制剂检测的需要。山合欢胰蛋白酶抑制剂的发现对山合欢进一步的研究和综合开发有重要意义。
【关键词】 山合欢 Tricine系统 蛋白酶抑制 电泳
Abstract：ObjectiveTo establish an detecting method for protease inhibitors， especially for low-molecular-weight inhibitors. MethodsInhibitor samples were separated on a gelatin-SDS-PAGE in a Tris-Tricine buffer system. After electrophoresis， the gel was incubated with the target proteases to hydrolyze the background gelatin. The inhibitor bands， which were undigested by the target proteases， were stained.ResultsLow-molecular-weight inhibitor (pepstatin A) and larger inhibitor (soybean Bowman-Birk inhibitor) were demonstrated by this method and showed clear blue inhibitor bands in the white background. By this method， a trypsin inhibitor was detected from the seeds of Albizzia kalkora (Roxb.) Prain. ConclusionThis method not only fit for inhibitors with different molecular mass， but fits for inhibitors with various species. Moreover， the trypsin inhibitor found in Albizzia kalkora is important for further research and overall exploration.
Key words：Albizzia kalkora (Roxb.) Prain； Tricine buffer system； Protease inhibitor; Electrophoresis
蛋白酶抑制剂是一类可以抑制靶蛋白酶水解活性的功能多肽，参与体内许多重要生理过程的调节，广泛存在于豆科、禾本科及葫芦科等植物的种子及块茎中［1］。此外，动物的血液、精液、胰脏中以及酵母菌、链霉菌属等微生物中亦有蛋白酶抑制剂的存在［2］。蛋白酶抑制剂具有抗炎抗感染的能力，已被广泛用于治疗急性胰腺炎，烧伤后休克及产后大出血等疾病［3］。更重要的是许多临床前研究发现蛋白酶抑制剂具有降糖、抗辐射、抑制因不良环境因素引起的癌转化过程、抑制肿瘤细胞生长的作用，有可能开发出新型的治疗糖尿病、抗癌药物［4～6］。因此寻找及利用蛋白酶抑制剂是极具研究意义的。由于蛋白酶抑制剂属于小分子多肽，有些蛋白酶抑制剂的分子量甚至小于1 000，为了能从材料中寻找新的蛋白酶抑制剂，建立适合于低分子量蛋白酶抑制剂的检测方法十分必要。我们采用Tricine系统，在分离胶中加入明胶，电泳分离样品后，胶板以特定蛋白酶水解，最后用考马斯亮蓝染色的方法，建立了一种满足不同分子量大小、不同类型的蛋白酶抑制剂检测需要的电泳方法。
1 仪器与材料
TU-1901紫外分光光度计(北京普析)；Mini Protein III垂直板电泳槽（美国BioBrad公司）；山合欢Albizzia kalkora (Roxb.) Prain的成熟种子采自西南交通大学峨眉校区；Acrylamide、Bisacrylamide、胰蛋白酶、甘氨酸、Tris、Tricine、胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin A，分子量为685 Da)为Amresco.产品；胃蛋白酶、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(BBI，分子量为8800 Da)为Sigma产品；其余试剂均为国产分析纯。
2 方法与结果
2.1 山合欢蛋白酶抑制剂粗提物制备按Genov等［7］的方法略加修改。山合欢种子(20 g)打磨成粉，加入200 ml去离子水，室温搅拌提取2 h，离心(6 000 ×g，20 min， 4℃)，沉淀再用100 ml去离子水抽提1次，离心(6 000 ×g，20 min，4℃)，合并2次上清液。加固体硫酸铵至35%饱和度，4 ℃静置过夜，离心(6 000 ×g，20 min，4 ℃)收集上清液。上清液加入固体硫酸铵至55%饱和度，4 °C放置2 h，离心(6 000 ×g，20 min，4℃)，收集沉淀，用少量去离子水溶解，对去离子水充分透析，离心(10 000 ×g，10 min，4℃)，所得上清液即为山合欢蛋白酶抑制剂粗提物，置-20 °C下储存。
2.2 合欢蛋白酶抑制剂粗提物抑制活力的测定蛋白质浓度的测定采用Bradford法［8］，以牛血清白蛋白为标准蛋白。抑制活力按照Erlanger等人的方法［9］，以实验条件下，与不加抑制剂的样品的吸收值比较，每降低0.1个A410 nm的吸收值为一个抑制活性单位。
实验结果：由20 g山合欢种子可以制备得到14 ml粗提物，用Bradford法测定蛋白质含量为0.5 mg·ml-1，测定对胰蛋白酶的抑制活力为202 单位/mg蛋白。实验结果表明山合欢粗提物中含有胰蛋白酶抑制剂。
2.3 明胶-SDS-PAGE明胶-SDS-PAGE采用Hanspal等［10］的方法略加修改，分离胶浓度12%(pH 8.8)，分离胶中含有0.2% (W/V)明胶。样品处理液配方：6% SDS，300 mM Tris-HCl，pH 8.0，50%甘油，0. 05%溴酚蓝。样品与样品处理液按2∶1比例混合。电极缓冲液为25 mM Tris，250 mM甘氨酸 (pH 8.3)，0.1% SDS。电泳完毕后，胶板经去离子水冲洗3次，置于2.5% Triton X-100溶液中复性25 min（两次）。用去离子水冲洗胶板多次，将含有BBI和山合欢粗提物的电泳胶条置于胰蛋白酶酶解缓冲液中，另将含有Pepstatin A的电泳胶条置于胃蛋白酶酶解缓冲液中，37 °C水浴保温30 min，再用考马斯亮蓝R-250染色40 min，10%乙酸-10%乙醇脱色过夜。胰蛋白酶酶解缓冲液配方为100 mM Tris-HCl，pH 8.0缓冲液(内含50 μg/ml胰蛋白酶)。胃蛋白酶酶解缓冲液配方为0.2% NaCl，HCl，pH 3.0缓冲液(内含50 μg/ml胃蛋白酶)。结果见图1。
2.4 明胶-Tricine-SDS-PAGE采用Schagger等人建立的Tricine系统［11］并略加修改，分离胶为12%(W/V)丙烯酰胺，0.32%(W/V)双丙烯酰胺，0.2%(W/V)明胶，10%(W/V)甘油，0.75 M Tris-HCl，pH 8.45，0.1% SDS。浓缩胶为5%(W/V)丙烯酰胺，0.13%(W/V)双丙烯酰胺，0.33 M Tris-HCl pH 6.8。样品处理液配方及样品的处理与明胶-SDS-PAGE方法相同。电泳时，以0.2 M Tris (pH 8.9)缓冲液为阳极缓冲液，以0.1 M Tris，0.1 M Tricine，0.1% SDS (pH 8.25)缓冲液为阴极缓冲液，电流大小为1 mA/孔，当溴酚蓝迁移至凝胶底部时停止电泳。电泳完毕后，胶条的处理过程与明胶-SDS-PAGE相同。结果见图2。
3 讨论
明胶-SDS-PAGE是根据Laemmli系统而建立的检测蛋白酶抑制剂的常用电泳方法［10］。该方法适合于检测较高分子量的蛋白酶抑制剂，如BBI在明胶-SDS-PAGE中能观察到清晰的抑制活性带(图1a)。然而在传统Laemmli系统中，小分子短肽的浓缩是较困难的，因为小分子短肽与SDS形成的复合体具有与SDS本身类似的电荷和大小，会出现短肽-SDS复合物与SDS颗粒共迁移的现象，导致分子量小于1 kDa的短肽无法取得较好的分离效果［11，12］。如图1c中，含有Pepstatin A的电泳胶条未发现有抑制活性带的出现。
Schagger等［11］报道了一种改进的Laemmli 法， 用Tris-Tricine体系代替Tris-glycine体系后可很好地分离分子量在1～100 kD的蛋白质。该方法降低了分离胶的pH值(pH 8.45)，使蛋白质的移动速度变慢，提高了电泳分辨率；其次，采用不连续的电极缓冲体系和使用Tricine替代甘氨酸作为慢迁移离子，解除短肽-SDS复合物与SDS颗粒的共迁移效应，改善小分子量短肽的电泳效果［11］。我们首先考察该方法的灵敏度，结果发现500 ng的BBI在明胶-Tricine-SDS-PAGE中能观察到清晰的抑制活性带(图2a)，其电泳迁移率要低于明胶-SDS-PAGE，表明该方法具有很高的灵敏度。更为重要的是Pepstatin A在明胶-Tricine-SDS-PAGE中能够观察到一条清晰的抑制活性带(图2c)。以上结果表明该方法的优点在于灵敏度高，能够检测不同类型、不同分子大小的蛋白酶抑制剂，弥补了明胶-SDS-PAGE无法检测低分子量蛋白酶抑制剂的缺陷，从而为大量样品的筛选工作提供了有效、快捷的技术手段。
山合欢Albizzia kalkora属豆科含羞草亚科乔木。近年来发现山合欢皮具有镇静安神、抗抑郁等功效［13， 14］，是一种极具开发价值的药用植物。但一旦山合欢皮被使用后，会损坏树木，破坏生态环境。山合欢种子一般在秋天结果后作为废料任其自然消失，未充分加以利用。因此，在应用山合欢皮时，应同时开发山合欢种子，一可充分利用自然资源，二可保护环境。我们分别利用明胶-SDS-PAGE和明胶-Tricine-SDS-PAGE检测了山合欢粗提物，结果均发现只有一条抑制活性带(图1b，图2b)，说明山合欢种子只含有一种胰蛋白酶抑制剂。迄今未见国内外有关山合欢胰蛋白酶抑制剂的报道。因此，本实验结果对山合欢进一步的研究和综合开发具有重要意义。对此我们将进一步分离纯化这种胰蛋白酶抑制剂，并进行抑制肿瘤细胞实验。 参考文献
［1］Laskowski Jr M， Qasim MA. What can the structures of enzyme-inhibitor complexes tell us about the structures of enzyme substrate complexes［J］.Biochim Biophys Acta， 2000， 1477: 324.
［2］王竞，康庄，廖海，等. 白菜型油菜种子胰蛋白酶抑制剂纯化及部分性质研究［J］.天然产物研究与开发，2005，17(3): 275.
［3］贾 洪，张宁. 胰蛋白酶抑制剂研究进展［J］.中华医学实践杂志， 2003， 2(10): 126.
［4］Lippman SM， Matrisian LM. Protease inhibitors in oral carcinogenesis and chemoprevention［J］.Clinical cancer research， 2000， 6: 4599.
［5］Witschi H， Esiritu I. Development of tobacco smoke-induced lung tumors in mice fed Bowman-Birk protease inhibitor concentrate (BBIC)［J］.Cancer Lett， 2002， 183: 141.
［6］郭瑞华，王和平，刘正猛，等. 永川豆豉胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其降糖活性研究［J］.时珍国医国药， 2007， 18(2)：291.
［7］Genov N， Goshev I， Nikolova D， et al. A novel thermostable inhibitor of trypsin and subtilisin from the seeds of Brassica nigra: amino acid sequence， inhibitory and spectroscop ic p roperties and thermostability［J］.Biochim Biophys Acta， 1997， 1341: 157.
［8］Bradford MM. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding［J］.Anal Biochem， 1976， 72: 248.
［9］Erlanger BE， Kokowsky N， Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin ［J］. Arch Biochem Biophys， 1961， 95: 271.
［10］Hanspal JS， Bushell GR， Ghosh P. Detection of protease inhibitors using substrate-containing sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis［J］. Anal Biochem， 1983， 132:288.
［11］Schagger H， Jagow V. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of protein in the range from 1 to 100 kDa［J］.Anal Biochem， 1987， 166: 368.
［12］Marcelo F， Claudia L. Electrophoretic analysis (Tricine-SDS-PAGE) of bovine caseins［J］.Acta Farm Bonaerence， 2002， 21: 57.
［13］李洁. 合欢皮与山合欢皮镇静催眠作用的比较研究［J］.时珍国医国药， 2005， 16(6): 488.
蛋白酶抑制剂范文4
摘 要：探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米对小鼠树突状细胞的免疫调节作用，从而促使其更加广泛应用于抗肿瘤治疗。方法：制备小鼠骨髓来源的树突状细胞，用CCK-8法检测硼替佐米对DC的抑制作用，流式细胞术检测DC表面共刺激分子的表达，ELISA法检测DC培养上清及MLR上清液中的细胞因子表达。结果：硼替佐米能够以时间、剂量依赖方式抑制DC的生长。结论：作为蛋白酶体抑制剂，硼替佐米是能够对小鼠树突状细胞产生一定的影响。
关键词：蛋白酶体抑制剂；硼替佐米；树突状细胞；免疫调节
硼替佐米是一种蛋白酶体抑制剂，经体内外实验研究证实，对多种肿瘤细胞系均有抑制作用，现已成为多发性骨髓瘤治疗的一线用药，对套细胞淋巴瘤也有良好的治疗效果.Prog Drug Res,2003,60(2):59.
蛋白酶抑制剂范文5
[关键词] 基质金属蛋白酶-1；基质金属蛋白酶抑制剂-1；舌癌
[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）08（c）-0014-03
Effect of MMP-1 and TIMP-1 in tongue cancer with invasion and metastasis ZHANG Peng JI Liang SHEN Lei LI Jingping WANG Yan ZHANG Cuixiang SHA Feng
Department of Anatomy, Qiqihar Medical University, Heilongjiang Province, Qigihar 161006, China
[Abstract] Objective To detect the expression of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 (TIMP-1) in mucosa lamina propria tissue of tongue cancer, in order to reveal the role of MMP-1 and TIMP-1 in the invasion and metastasis of tongue cancer. Methods The immunological localization and expression of MMP-1 and TIMP-1 in tongue cancer specimens and normal tissues were detected by immunohistochemical staining methods (ABC method). Results Positive expression rate of MMP-1 and TIMP-1 between tongue cancer tissues and normal tissues was significantly different (P < 0.01). The expression of TIMP-1 and MMP-1 in tongue cancer tissues had no relationship with the size of tongue cancer (P > 0.05), but it had significantly differences compared with differentiation degree, metastasis and pathological grade of tongue cancer (P < 0.05 or P < 0.01). Conclusion The expression of MMP-1 and TIMP-1 in mucosa lamina propria tissue of tongue cancer can contribute to judge the invasion, metastasis and pathological grade of tongue cancer.
[Key words] Matrix metalloproteinase-1; Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1; Tongue cancer
基质金属蛋白-1（matrix metalloproteinases，MMP-1）属于胶原酶，可降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中的胶原纤维成分。基质金属蛋白酶抑制剂-1（Tissue Inhibitor of Metalloproteinases，TIMP-1）对MMP-1活性有抑制作用，二者之间的平衡可维持ECM中胶原纤维合成和分解的稳定，并与肿瘤的发生、浸润和转移密切相关[1]。肿瘤的浸袭和转移机制研究已经成为热点，目前，对于舌癌如何突破ECM造成浸润转移尚无定论。本实验对舌癌的MMP-1、TIMP-1的表达及关系进行研究，以解决舌癌浸润转移的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
实验组选择本课题组2006～2008年使用二甲基苯并蒽（DMBA）涂抹金黄地鼠舌体建立的舌癌模型存档标本，其中涂抹4、8、12、16、20、24周各为一组，每组5例，共计30例；将上述标本切片行HE染色，在显微镜下观察。确定原位癌11例，进展期舌癌19例（包括浸润癌13例，转移癌6例）；有淋巴结转移者17例，无淋巴结转移者13例。每例均按癌巢大小取取癌中组织（肿瘤中心区）、癌周组织（肿瘤边缘区）；对照组取上述组织块中的正常组织各1块，共计30例。
蛋白酶抑制剂范文6
关键词 骨化三醇 角质形成细胞 中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂 serpin B1 银屑病
中图分类号：R977.24； R758.63 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2016）09-0028-07
Calcitriol inhibits keratinocyte proliferation by upregulating the expression of leukocyte elastase inhibitor serpin B1
LI Hui1，2*， GUO Zhili2， GU Jun2**
（1. Department of Dermatology， General Hospital of Urumuqi Military Region， Urumuqi 830000， China；
2. Department of Dermatology， Changhai Hospital， Second Military Medical University， Shanghai 200433， China）
ABSTRACT Objective： To evaluate the role of calcitriol and serpin B1 in human keratinocyte cell line HaCaT proliferation. Methods： Calcitriol was added at 1×10-8 mol/L into the culture of HaCaT cell in a calcitriol group while only serum-free Dulbecco’s modified Eagle’s medium instead in a control group. Whole proteins were extracted by freeze-thawing method after cells were incubated in the dark for 48 h and were separated by two-dimensional differential gel electrophoresis. The differences for protein expression were analyzed by ImageMaster 2D Platinum 5.0 and the identification of proteins was performed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry. The overexpression of serpin B1 was confirmed by reverse transcription polymerase chain reaction and Western-blotting assay. The effect of serpin B1 on HaCaT proliferation was analyzed by RNA interference experiments， methyl thiazole tetrazolium assay and flow cytometry. Results： The expression of serpin B1 was upregulated in the calcitriol group. Calcitriol could inhibit HaCaT proliferation at 1×10-9 ～ 1×10-6 mol/L. HaCaT proliferation could be promoted and its inhibitory effect could be offset by interfering serpin B1. Conclusion： The expression of serpin B1 can be upregulated when calcitriol is added into the culture of HaCaT cells， which may play an important role in the inhibition of calcitriol to the proliferation of HaCaT cells.
KEY WORDS calcitriol； keratinocytes； leukocyte elastase inhibitor； serpin B1； psoriasis
胞增殖和表皮内的中性粒细胞浸润[1-2]。骨化三醇及其类似物已被证实可有效治疗轻、中度寻常型银屑病[3-4]，其机制被认为是骨化三醇能抑制角质形成细胞的增殖并促进角质形成细胞的分化[5]。
银屑病患者的活动性皮损及外周血中的中性粒细胞数常增多，且随之产生的氧化压力与银屑病的严重程度相关[2，6]。中性粒细胞颗粒蛋白酶虽能直接杀伤吞噬的病原体，但在慢性炎症性疾病中，其之过度释放也可导致组织损伤以及凋亡细胞的清除障碍[7-9]。蛋白激酶的调节在表皮的屏障功能及炎症性皮肤病的发病过程中起着重要作用[10]。作为蛋白激酶家族成员，中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase， NE）是活化的中性粒细胞释放的主要物质，在银屑病引起的组织破坏中起着重要作用。NE在银屑病患者的组织和血清中表达过度并在银屑病的发病中起着重要作用[11]。NE的水平与银屑病的活动性相关，且被认为是诊断银屑病和随访其严重程度的一种很好的监测指标[12]。此外，既往研究显示，NE在银屑病皮损中高表达，且可刺激角质形成细胞的增殖[13]。NE也可促进人角质形成细胞株HaCaT细胞的增殖及银屑病器官培养模型的transwell迁移[14]。NE和内源性蛋白酶抑制剂间的失衡已被公认为是银屑病的病因之一。一些NE的抑制剂、包括源自皮肤的抗白细胞蛋白酶[15]和α1-抗胰蛋白酶[16]都已被证实与银屑病相关。蛋白水解失衡与银屑病的进展相关[2]。
丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类具有独特的三级结构并通过自杀式底物抑制机制中和靶蛋白酶的蛋白家族[17]，其成员serpin B1又被称为多形核中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂和胞浆丝氨酸蛋白酶抑制剂[18]。serpin B1是中性粒细胞颗粒内的一种以自杀式底物抑制机制作用的快反应型NE、蛋白激酶3和组织蛋白酶G的抑制剂[10]。丝氨酸蛋白酶抑制剂已被认为与银屑病和其他常见的炎症性皮肤病相关[13，19-20]，但serpin B1与银屑病的相关性尚未见有报告。
本研究的目的是证实骨化三醇能上调HaCaT细胞中的serpin B1表达且其有抑制HaCaT细胞增殖的作用。
1 实验方法
1.1 细胞培养
实验组：将永生化的HaCaT细胞（上海生化和细胞生物研究所产品）用添加了10%胎牛血清（法国Biowest公司产品）的Dulbecco改良的Eagle培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium， DMEM）（法国Biowest公司产品）于5% CO2、37 ℃下常规培养。待80%的细胞融合后，再加入1×10-8 mol/L的骨化三醇（美国Sigma公司产品）。
阴性对照组：将HaCaT细胞于未添加胎牛血清的DMEM中培养。
1.2 双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis， 2DE）法和质谱分析
采用反复冻融法提取骨化三醇组和阴性对照组中的HaCaT细胞全蛋白，用Bradford法测定蛋白浓度，然后通过2DE法分离蛋白。总上样量为100 μg，第一向固相等电聚焦电泳采用17 cm长的pH为3 ～ 10的非线性固相pH梯度凝集胶条、按程序化的电压梯度进行电泳。主动水化50 V、14 h，温度为17 ℃，依次经250 V、30 min，500 V、1 h，1 000 V、1 h，升压至10 000 V、5 h，聚焦10 000 V达总量60 000 Vh。聚焦结束后，胶条先后经2%二硫苏糖醇和2.5%碘乙酰胺平衡，然后进行第二向电泳，采用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）法，10 mA、50 V、50 min，50 mA、250 V、至溴酚蓝指示剂到底部边缘。电泳结束后，采用快速银染法染色蛋白点位。
银染后的凝胶用UMAX PowerLook 2100XL扫描仪进行图像扫描光密度分析。使用ImageMaster 2D Platinum 5.0软件对2DE图谱进行匹配分析，筛选出存在差异的蛋白质点。切取符合质谱分析法浓度要求的10个有差异的蛋白质点并进行胶内酶解，然后通过基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪对蛋白质点进行氨基酸序列分析，依据酶解肽片断的质量，通过Mascot软件查询SWISS-PROT蛋白数据库，经软件自动运算得出Mascot得分，进而确定被测蛋白的可能属性及名称。数据分析及蛋白鉴定由中科院上海生物研究所蛋白质组学研究中心完成。
1.3 反转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction， RT-PCR）法
用Trizol试剂（美国Invitrogen公司产品）抽提预处理后的HaCaT细胞的总RNA，然后按照操作试剂盒（立陶宛MBI Fermentas公司产品）反转录合成cDNA。serpin B1引物的序列如下：前向引物，5′-AGGAACAGTTGACTTTGGAA-3′；反向引物，5′-AAAGAGATCCTGCACACCTA-3′。RT-PCR法采用标准的SYBR Green PCR试剂盒（日本TOYOBO公司产品）进行，聚合酶链式反应的特异性扩增在ABI 7300仪器（德国Applied Biosystem公司产品）中进行。serpin B1、磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase， GAPDH）的相对量采用2-ΔΔCt法计算。
1.4 Western-blotting法
提取的HaCaT细胞全蛋白经SDS-PAGE法分离后转移到硝酸纤维素膜（德国Millipore公司产品）上，用serpin B1抗体（美国Santa Cruz公司产品）和GAPDH抗体（美国Bioworld公司产品）孵育，之后孵育羊抗兔二抗，最后用化学发光法（美国Pierce公司产品）显影。
1.5 细胞转染
设计并合成3对serpin B1的siRNA（委托上海吉玛制药技术有限公司完成），序列分别为：serpin B1-homo-491 sense为5′-CGGGCAUGGUUGAUAACAUTT-3′，antisense为5′- A U G U U A U C A A C C A U G C C C G T T- 3′；s e r p i n B 1 - h o m o - 9 3 s e n s e为5′-GGCGUUGAGUGAGAACAAUTT-3′，antisense为5′- A U U G U U C U C A C U C A A C G C C T T- 3′；s e r p i n B 1 - h o m o - 8 1 3 s e n s e为5′-GUGGACUAAACCUGAGAAUTT-3′，antisense为5′-AUUCUCAGGUUUAGUCCACTT-3′。采用Lipofectamin 2000（美国Gibco公司产品）转染法转染HaCaT细胞，阴性对照siRNA作为空白对照。以RTPCR法验证转染及干扰效率。
1.6 噻唑蓝实验分析细胞增殖
铺96孔板，使HaCaT细胞在24 h内融合达70%左右，然后分为3组，分别加入骨化三醇、NE和无胎牛血清的DMEM，培养48 h后，再每孔加5 mg/ml噻唑蓝20μl，37 ℃、5% CO2下孵育4 h。吸弃每孔内培养基上清液，再每孔中加入二甲基亚砜150 μl，振荡10 min。用酶联免疫检测仪测定550 nm下的各孔光吸收值。
1.7 流式细胞仪检测细胞周期
用6孔板培养HaCaT细胞，然后分别用阴性对照siRNA、空白对照、serpin B1 siRNA、阴性对照联合骨化三醇（1×10-8 mol/L）和空白对照联合骨化三醇（1×10-8 mol/L）处理细胞。48 h后收集细胞，加入70%乙醇，30 min后再用冰磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution， PBS）清洗。在冰上加入含RNase（1∶100）的PBS重悬细胞，然后用碘化丙啶染色，用流式细胞仪（美国BD Biosciences公司产品）进行分析。
1.8 统计分析方法
本研究计量资料以（均数±标准差）表述。两组样本间的均数比较用两样本均数的t检验。P
2 结果
2.1 骨化三醇上调serpin B1表达
建立了HaCaT细胞全蛋白的2DE图谱，发现重复性好，并共检测出3 000余个蛋白位点，见图1A。与对照组相比，骨化三醇组共有22种蛋白出现表达差异，其中一些蛋白的位点已在图1A中用圈和数字标示。22种蛋白中有5种表达下调，17种表达上调。共鉴定出4种有表达差异的蛋白，分别为serpin B1、fascin同系物-1、干扰素调控因子-4和gi 158256364。在图1A中用箭头标示的即是serpin B1，其在骨化三醇组表达上调。图1B、1C和1D展示了serpin B1的鉴定过程。
如图2A所示，RT-PCR法结果显示，与对照组相比，骨化三醇组在4、8、12、24和48 h时间点，serpin B1的表达分别上调了1.99、2.41、3.28、3.46和3.31倍（均P
2.2 serpin B1抑制HaCaT细胞增殖
如图3所示，骨化三醇在1×10-9 ～ 1×10-6 mol/L浓度时能抑制HaCaT细胞的增殖。为明确serpin B1对HaCaT细胞增殖的影响，对HaCaT细胞转染serpin B1 siRNA并设阴性对照。用RT-PCR法验证serpin B1的干扰效率，发现如图4A所示，serpin B1-homo-93可显著降低serpin B1的表达，抑制率达83%；如图4B所示，serpin B1 siRNA可较阴性对照和空白对照显著促进HaCaT细胞的增殖（均P
此外，如图4B所示，与阴性对照组相比，阴性对照联合骨化三醇组的HaCaT细胞增殖受到抑制，提示骨化三醇可抑制HaCaT细胞增殖。而当干扰serpin B1后，骨化三醇对HaCaT细胞增殖的抑制作用消失，提示serpin B1在骨化三醇抑制HaCaT细胞增殖过程中起着至关重要的作用。
如图5A、5C和5F所示，对细胞周期的研究结果也证实了serpin B1 siRNA的细胞增殖促进作用：serpin B1 siRNA组和阴性对照组的G1期细胞占比分别为（40.36±3.07）%和（47.04±2.15）%、S期细胞占比分别为（50.41±4.33）%和（35.49±4.30）%（均P
3 讨论
骨化三醇及其类似物已被证实可有效治疗轻、中度寻常型银屑病，其作用机制也已被证实是骨化三醇可抑制角质形成细胞增殖并促进其分化[3-4]。然而，骨化三醇促使角质形成细胞分化正常化的分子机制尚未被完全阐明。一项研究采用基因表达组学方法研究了1， 25-二羟维生素D3对角质形成细胞基因表达的影响，结果发现可诱导角质形成细胞serpin B1的表达[21]。同时，该研究还展示了一个包括维生素D受体配体在内的维生素D相关的细胞分化调控网络。本研究通过蛋白组学方法研究发现，骨化三醇可改变包括serpin B1在内的HaCaT细胞的多种蛋白表达。尤其是serpin B1，其表达的改变已为进一步的实验所证实，且其抑制HaCaT细胞增殖的作用也得到了进一步的研究。本研究揭示，骨化三醇可改变HaCaT细胞中的一些蛋白表达，这为银屑病治疗提供了新的作用靶点。本研究还显示，serpin B1在角质形成细胞中有表达，且其表达会在骨化三醇存在时上调。
serpin B1在中性粒细胞胞浆中高表达[22]。近来发现，除中性粒细胞、巨噬细胞和肥大细胞外，serpin B1在支气管和腺上皮细胞中也有表达[23]。serpin B1调控初始免疫，可在慢性炎症中通过中和蛋白激酶而减少组织损伤。在小鼠细菌感染模型中，serpin B1也与中性粒细胞的内稳定相关[24-26]。有研究显示，在小鼠慢性铜绿假单胞菌感染模型中，serpin B1可降低细菌数和减少炎性细胞的浸润[27]。对多种感染模型的研究还显示，serpin B1与病原菌清除及维持免疫功能所必需的正常中性粒细胞的储备有关[28-29]。因此，serpin B1被认为是最有效的NE抑制剂之一[29-31]。通过抑制NE，serpin B1可能在银屑病、慢性阻塞性肺疾病、纤维囊性病和溃疡性结肠炎等慢性炎症性疾病以及感染性疾病的发病过程中发挥至关重要的作用。
本研究也发现，serpin B1和骨化三醇均可抑制HaCaT细胞的增殖。serpin B1 siRNA可促进细胞周期由G1期向S期转化，而骨化三醇则抑制由G1期向S期转化。如果骨化三醇诱导的serpin B1对其产生细胞增殖抑制作用至关重要，那么干扰serpin B1将使骨化三醇对细胞增殖的影响消失。为验证该假设，对阴性对照联合骨化三醇组和serpin B1 siRNA联合骨化三醇组进行了比较研究，发现在serpin B1扰后，骨化三醇也不能产生细胞增殖抑制作用了。即：骨化三醇是通过上调serpin B1的表达而产生抑制HaCaT细胞增殖作用的。serpin B1可能是骨化三醇治疗银屑病的有效作用靶点。
本研究仍存在不足，尚需进一步研究serpin B1对HaCaT细胞分化和凋亡的影响。此外，需进行serpin B1与银屑病相关性的体内研究。
总之，本研究显示，serpin B1在角质形成细胞中有表达，且其表达会在骨化三醇存在时上调。serpin B1可抑制角质形成细胞增殖，在骨化三醇治疗寻常型银屑病中起着重要作用。
参考文献
[1] Lowes MA， Bowcock AM， Krueger JG. Pathogenesis and therapy of psoriasis [J]. Nature， 2007， 445（7130）： 866-873.
[2] Rocha-Pereira P， Santos-Silva A， Rebelo I， et al. The inflammatory response in mild and in severe psoriasis [J]. Br J Dermatol， 2004， 150（5）： 917-928.
[3] Murphy G， Reich K. In touch with psoriasis： topical treatments and current guidelines [J]. J Eur Acad Dermatol Venereol， 2011， 25（Suppl 4）： 3-8.
[4] Sch？n M， Denzer D， Kubitza RC， et al. Critical role of neutrophils for the generation of psoriasiform skin lesions in flaky skin mice [J]. J Invest Dermatol， 2000， 114（5）： 976-983.
[5] Rizova E， Corroller M. Topical calcitriol ― studies on local tolerance and systemic safety [J]. Br J Dermatol， 2001， 144（Suppl 58）： 3-10.
[6] Wiedow O， Wiese F， Christophers E. Lesional elastase activity in psoriasis. Diagnostic and prognostic significance [J]. Arch Dermatol Res， 1995， 287（7）： 632-635.
[7] Reeves EP， Lu H， Jacobs HL， et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux [J]. Nature， 2002， 416（6878）： 291-297.
[8] Birrer P. Proteases and antiproteases in cystic fibrosis： pathogenetic considerations and therapeutic strategies [J]. Respiration， 1995， 62（Suppl 1）： 25-28.
[9] Vandivier RW， Fadok VA， Hoffmann PR， et al. Elastasemediated phosphatidylserine receptor cleavage impairs apoptotic cell clearance in cystic fibrosis and bronchiectasis[J]. J Clin Invest， 2002， 109（5）： 661-670.
[10] Benarafa C， Remold-O’Donnell E. The ovalbumin serpins revisited： perspective from the chicken genome of clade B serpin evolution in vertebrates [J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2005， 102（32）： 11367-11372.
[11] Terui T， Ozawa M， Tagami H. Role of neutrophils in induction of acute inflammation in T-cell-mediated immune dermatosis， psoriasis： a neutrophil-associated inflammation-boosting loop[J]. Exp Dermatol， 2000， 9（1）： 1-10.
[12] Orem A， De？er O， ？imsit G， et al. Plasma polymorphonuclear leukocyte elastase levels and its relation to disease activity in psoriasis [J]. Clin Chim Acta， 1997， 264（1）： 49-56.
[13] Meyer-Hoffert U， Wingertszahn J， Wiedow O. Human leukocyte elastase induces keratinocyte proliferation by epidermal growth factor receptor activation [J]. J Invest Dermatol， 2004， 123（2）： 338-345.
[14] Yang X， Yan H， Zhai Z， et al. Neutrophil elastase promotes proliferation of HaCaT cell line and transwell psoriasis organ culture model [J]. Int J Dermatol， 2010， 49（9）： 1068-1074.
[15] Kuijpers AL， Zeeuwen PL， de Jongh GJ， et al. Skin-derived antileukoproteinase （SKALP） is decreased in pustular forms of psoriasis. A clue to the pathogenesis of pustule formation？[J]. Arch Dermatol Res， 1996， 288（11）： 641-647.
[16] Barszcz D， Zarebska Z， Gliska-Ferenz M， et al. Alpha1-proteinase inhibitor in psoriasis： reduced activity in symptomfree patients and during flare [J]. Arch Dermatol Res， 1988， 280（4）： 198-206.
[17] Gettins PG. Serpin structure， mechanism， function [J]. Chem Rev， 2002， 102（12）： 4751-4804.
[18] Remold-O’Donnell E. The ovalbumin family of serpin proteins [J]. FEBS Lett， 1993， 315（2）： 105-108.
[19] Meyer-Hoffert U. Reddish， scaly， and itchy： how proteases and their inhibitors contribute to inflammatory skin diseases[J]. Arch Immunol Ther Exp （Warsz）， 2009， 57（5）： 345-354.
[20] Sun LD， Cheng H， Wang ZX， et al. Association analyses identify six new psoriasis susceptibility loci in the Chinese population [J]. Nat Genet， 2010， 42（11）： 1005-1009.
[21] Lu J， Goldstein KM， Chen P， et al. Transcriptional profiling of keratinocytes reveals a vitamin D-regulated epidermal differentiation network [J]. J Invest Dermatol， 2005， 124（4）： 778-785.
[22] Benarafa C， Cooley J， Zeng W， et al. Characterization of four murine homologs of the human ov-serpin monocyte neutrophil elastase inhibitor MNEI （SERPINB1） [J/OL]. J Biol Chem， 2002， 277（44）： 42028-42033 [2016-02-15]. http：// /content/277/44/42028.full.pdf+html.
[23] Yasumatsu R， Altiok O， Benarafa C， et al. SERPINB1 upregulation is associated with in vivo complex formation with neutrophil elastase and cathepsin G in a baboon model of bronchopulmonary dysplasia [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2006， 291（4）： L619-L627.
[24] Gong D， Farley K， White M， et al. Critical role of serpinB1 in regulating inflammatory responses in pulmonary influenza infection [J]. J Infect Dis， 2011， 204（4）： 592-600.
[25] Benarafa C， LeCuyer TE， Baumann M， et al. SerpinB1 protects the mature neutrophil reserve in the bone marrow [J]. J Leukoc Biol， 2011， 90（1）： 21-29.
[26] Benarafa C， Priebe GP， Remold-O’Donnell E. The neutrophil serine protease inhibitor serpinb1 preserves lung defense functions in Pseudomonas aeruginosa infection [J]. J Exp Med， 2007， 204（8）： 1901-1909.
[27] Woods DE， Cantin A， Cooley J， et al. Aerosol treatment with MNEI suppresses bacterial proliferation in a model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection [J]. Pediatr Pulmonol， 2005， 39（2）： 141-149.
[28] Rees DD， Rogers RA， Cooley J， et al. Recombinant human Monocyte/Neutrophil elastase inhibitor protects rat lungs against injury from cystic fibrosis airway secretions [J]. Am J Respir Cell Mol Biol， 1999， 20（1）： 69-78.
[29] Uchiyama K， Naito Y， Takagi T， et al. Serpin B1 protects colonic epithelial cell via blockage of neutrophil elastase activity and its expression is enhanced in patients with ulcerative colitis [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2012， 302（10）： G1163-G1170.
