摘要:组织工程是以细胞生物学和材料科学为基础，在体内或体外构建组织或器官的新兴学科。组织工程主要研究种子细胞和支架材料，支架材料为种子细胞提供三维立体空间结构，并且可以为细胞的气体交换、营养物质获取等提供通路，本文将针对一种具有良好安全性、可生物降解性等的天然材料—海藻酸钠(SA)的性质及在组织工程中的应用进行综述。
关键词:组织工程;种子细胞;支架材料;海藻酸钠
组织、器官缺损是危害人类健康的主要原因，修复组织、器官及其功能恢复是目前临床上的一个重大医学难题。目前主要采用自体移植或异体移植等方法，但自体移植主要采用“拆东墙补西墙”的方式，对自体创伤比较大，恢复困难;同样，采用异体移植时，主要存在供体来源有限、免疫排斥等问题。组织工程由美国科学基金会在1987年生物工程会议上提出，1988年正式定义为:应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科［1］。研究领域主要包括骨和软骨组织工程［2］、血管组织工程［3］、神经组织工程［4］、皮肤组织工程［5］、口腔组织工程［6］、肌腱韧带组织工程［7］、眼角膜组织工程［8］和肝［9］、胰［10］、肾［11］、泌尿系统组织工程［12］等。组织工程主要研究种子细胞的获取、生物支架材料和构建组织或器官的方法和技术，以及组织工程的临床应用。作为一门生物高新技术学科，具有良好的发展前景以及广阔的应用市场。支架材料为细胞的存活提供适宜的条件，为体外构成组织或器官提供必要条件，本文将针对天然支架材料海藻酸钠(sodi-umalginate，SA)在组织工程中的应用进行介绍。
1SA的性质
SA是一种天然多糖，是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，其分子由M单元(β-D-甘露糖醛酸，β-D-mannuronic)和G单元(α-L-古洛糖醛酸，α-L-guluron-ic)组成，具有良好的稳定性、溶解性、黏附性、安全性，还具有降血糖、抗氧化、增强免疫活性等作用［13］。SA因含有大量的羧基，而具有明显的pH敏感性［14］。在中性条件下，其水溶液具有一定的黏附性，可以作为应用于皮肤黏膜等药物的载体;在酸性条件下，SA电离度降低，大量的-COO－转变为-COOH，水溶性降低;随着pH的增加，-COOH转变为-COO－，亲水性增加。G单元上的Na+可以与二价阳离子如Ca2+等发生离子交换，导致G单元大量堆积，形成三维立体网络结构，可快速形成水凝胶。SA形成水凝胶的条件温和，可以避免敏感药物、蛋白质、酶等的失活，因此在医药领域得到了广泛的研究。此外，以SA为主要载体制备的植入剂在国外已经上市出售，可见其具有足够的安全性。SA在食品工业和医药领域得到了广泛应用［15］，早已被收入美国药典及英国药典等药典。
2SA在组织工程中的应用
2．1SA在骨组织工程中的应用
理想的支架材料能够为细胞的生长提供充足的营养和交换气体，支持细胞进行代谢排泄，可生物降解等。将细胞支架复合物注射到骨缺损的地方，随着生物材料的逐步降解，大量的种子细胞转变为骨组织，从而达到修复骨损伤的目的。Zhu等16］研制了一个连续的分层注射支架，可注射SA/BG(生物玻璃，bioglass)复合水凝胶和可注射SA/AG(琼脂糖，agarose)热敏水凝胶层，将这些连续的分层构建体注射到大鼠的骨软骨缺损中后，其改善了透明软骨和成熟的软骨下骨的形成，新形成的组织与周围正常组织之间的整合也得到改善。结果表明，这种结构和功能仿生支架在骨软骨缺损再生中具有很大的应用潜力。SA在支架的分层结构中创建了一个连续的阶段，因此生物支架模拟了天然骨软骨结构。在连续的分层中，包括不同的种子细胞和生物活性材料，进一步使构建物在功能上具有仿生性。Catanzano等［17］开发出具有多孔和良好互连结构的大孔藻酸盐泡沫(MAF)，可用于增强人间充质干细胞(hMSCs)的生长和成骨分化。以碳酸氢钠作为发泡剂，通过内部凝胶化法得到SA水凝胶，具有多孔、三维立体结构，能够很好地维持促进细胞进行气体以及营养物质的交换。孙磊等［18］人采用SA凝胶复合异种骨的方法，构建骨组织工程载体，搭载BMSCs，再复合去抗原牛松质骨(xenograftbone，X)，于两侧股部肌袋中植入BMSCs-SA-X复合体，结果表明，以SA-X构建的载体可以促进BM-SCs的生长，能够使X以较高的浓度定位排列生长，在体内成骨效率较高。此外，与PLA、PGA等生物材料相比，SA具有更高的亲水性，有利于细胞黏附生长，SA在体内经过酶降解途径分解的产物无毒。Wu等［19］研制了一种多孔组织链(pTSs)，将SA致孔剂与人脂肪来源的干细胞混合，并加载到管状SA胶囊中，然后使胶囊去交联。成功地完成了创伤后应激综合征的软骨形成和成骨作用，表明创伤后应激综合征能更好地支持高代谢性活性组织的再生。在此系统中，SA作为致孔剂制备的SA胶囊，留在创伤后应激系统内，提供了一条营养和氧气灌注通路，维持周围几百微米以内距离的细胞灌注营养物质与空气的交换，具有潜在形成血管的空间结构，进一步加强细胞在组织移植过程中的活力及生存能力。pTSs具有促进人类干细胞分化为不同谱系的能力，可能为组织工程应用开辟一条新的途径，尤其是在需要时可扩展的特定于患者的组织。SA作为载体能够保证搭载较多的细胞，较好的黏附性、在体内经酶降解产物无毒等，具有作为骨组织工程载体的巨大应用价值。
2．2SA在血管组织工程中的应用
血管组织工程是指利用血管壁的正常细胞和生物可降解材料来制备、重建和再生血管替代材料的科学。Sapir等［20］探索了新的磁性SA复合支架，以提供对细胞的物理刺激性。在交替磁场的刺激下，具有磁响应的的SA支架可以促使细胞组织进入早期血管样结构，结合化学信号(即生长因子)，可能导致体外产生一个有效地、可在体内进行移植和有效整合的血管前组织结构。Wilkens等［21］采用逐层沉积的方法，采用明胶，SA和壳聚糖以构建不同部分，该系统能够控制直径为0．5～6mm的腔的尺寸以及1～400μm厚的各个层。在此系统中，采用0．2%的SA制备的仿生血管支架具有结构统一，中段、尾部差异无统计学意义，且能够保证内皮细胞(HUVECs)附着、存活甚至是增殖，该研究证明了自动化系统的广泛多功能性和可扩展性，可以轻松快速地制造复杂的细胞化多层血管移植物，其结构配置类似于天然血管。Munarin等［22］开发了一种胶原蛋白-SA微球支架，用于局部释放药物和生长因子。用固定在胶原-SA微球支架的胶原相中的HUVECs进行的体外血管形成测定显示，即使在没有生长的情况下，HUVECs也遵循微球的三维模式形成网络。SA微球在三维胶原支架中的固定化允许治疗药物的空间控制释放，最终将宿主内皮细胞招募到植入物的位置。总之，这些结果表明胶原蛋白—藻酸盐微球支架是可行的、可调节的用于在缺血事件后指导工程化组织和心脏中的新血管形成的治疗方法。SA作为构建人工血管的天然材料，具有生物相容性好、无免疫排斥反应等优点，有待进一步的开发研究。
2．3SA在神经组织工程中的应用
周围神经损伤后的再生和功能恢复仍然是一个重要的临床问题。天然多糖材料如SA、壳聚糖等，因为其具有支持细胞和作为药物载体的能力，但其机械性能差，所以将SA和壳聚糖这两种多糖结合起来制备成一种水凝胶，从而改善力学性能和细胞相互作用。Salehi等［23］采用SA-壳聚糖水凝胶(alg/chit)进行嗅鞘间充质干细胞(OE-MSCs)移植，促进周围神经再生。从嗅黏膜活检组织中分离出OE-MSCs，并用不同的细胞表面标志物和分化能力进行评价。在大鼠模型中建立坐骨神经损伤模型后，用制备的SA-壳聚糖水凝胶将OE-MSCs移植到损伤区，并对其进行了表征。结果表明，与未使用OE-MSCs的SA-壳聚糖水凝胶相比，使用OE-MSCs对坐骨神经缺损进行修复可增强再生能力。为了实现实验室与手术室间神经细胞、胶质细胞和待植入干细胞的安全转移，Miller等［24］利用界面聚电解质络合法(IPC)制备了水凝胶纤维对细胞进行包封，将水溶性壳聚糖(WSC)与含有SA的细胞连接，形成成束排列的静电纺纤维、纺制IPC水凝胶纤维。研究表明，初级神经元和星形胶质细胞能够以很好的存活率被包裹在IPC水凝胶纤维中，且SA在IPC水凝胶纤维中可以有效延长原代神经元细胞的轴突，提高其滞留率及存活率，IPC水凝胶技术可能是将神经细胞和其他细胞封装在电纺纤维支架上的一种有用工具。SA作为神经组织工程支架材料，首先，能够完全降解吸收、无毒，其次，能够诱导和促进轴突生长、良好的渗透性等优点，是较好的神经组织支架材料，有待进一步开发利用。
2．4SA在其他组织工程中的应用
组织工程皮肤是一种较为完善的组织工程化组织，是将真皮成纤维细胞与细胞外基质替代物混合制成人工皮肤;或单纯使用多孔的细胞外基质替代真皮植入创面，上面移植上皮细胞覆盖或待自身上皮覆盖取代病损的皮肤。SA具有良好的亲水性和生物降解性，采用冷冻干燥法制备复合材料支架，形成覆盖烧伤创面的多孔微结构，提供良好的伤口愈合环境和调节组织形成。Yang等［25］为了模拟细胞外基质的自然结构，采用冷冻干燥法制备了一种新型丝素/透明质酸/SA复合支架(SF/HA/SA)。对大鼠全厚度烧伤模型的伤口愈合效果进行了评估，结果显示，SF/HA/SA支架可改善再上皮化，增强细胞外基质重塑，SF/HA/SA支架可以为皮肤修复提供一种潜在的创面敷料。Solovieva等［26］也采用冷冻干燥方法制备了一种适合皮肤生物工程和移植治疗的促血管生成支架材料，SA-纤维蛋白原复合海绵支架，用凝血酶促进纤维蛋白/丝素蛋白的转化，用ε-氨基己酸(εac)作为抗纤维蛋白溶解组分，以Ca2+和Mg2+离子为交联剂，可使支架生物降解速率减慢。研究结果表明，凝血酶修饰的SA海绵可以作为促进皮肤愈合和再生的移植材料，也可以作为三维生物等效结构的支架。SA多孔支架在皮肤组织工程中，一般多由冷冻干燥法制备，具有开放、贯通的多孔结构，利于细胞生长和物质传输。Sondermeijer等［27］研制了一种多孔的、生物相容的、三维立体SA支架，用合成的环状rgdfk(arg-gly-asp-d-phe-lys)肽共价修饰。可促进人和啮齿动物细胞的体外存活和体内新生血管生成;植入人间充质前体细胞(hMPCs)，并修补到梗死心肌心外膜表面可诱导心肌新生血管生成并显著改善心功能，可作为一种将细胞运送到心肌的方法，改善梗死区新生血管和心功能。另有研究报道称，在可注射心肌组织工程中，SA与Ca2+交联成水凝胶，注射到心梗区域，用于预防或逆转患者的不良左心室重构和ST段抬高心肌梗死后功能障碍，且已经进入一期临床试验［28］。SA凝胶在体外能模拟ECM，可以为细胞提供良好的生存环境，提高细胞的移植率和存活率。细胞移植修复组织缺损是一种很有前途的新的治疗策略，SA在其它领域中还有诸多应用，期待其在组织工程中的进一步开发利用。
3展望
随着组织工程的深入研究，SA作为一种高效的生物黏附剂，来源易得、价格便宜，具有良好的生物相容性和无免疫原性，但天然材料都存在力学性能差等缺点，需要与其他材料合用，或者进行改性研究等，此外，SA在组织工程中的应用几乎均处于研究阶段，但已有SA作为支架材料进入临床试验，期待其在该领域产品的开发与利用。为了使SA向智能化、仿生化方向发展，仍需对其进行进一步的研究开发，必将使其在组织工程领域以及其它领域发挥更大作用。
作者:战海鹤 高亚男 纪宏宇 吴琳华 单位:哈尔滨医科大学附属第二医院药学部 哈尔滨医科大学药学院 黑龙江省高校重点实验室 海南医学院