海藻面膜范文1
海藻颗粒面膜用法：
敷面膜前用洗面奶洁面，敷完后用清水洗即可；敷海藻前，应该把脸拍擦干，脸上有水时敷海藻面膜容易往下滑；海藻最好用温水调制，夏天可以用冷水来调，骨胶元更多，加一点芦荟汁和鲜奶可有助于美白，油性皮肤可以加一点蜂蜜和蛋清，干性皮肤可以加一点蛋黄；敷完后的海藻面膜加水，可以恢复到第一次的状态，并继续用来敷手、脖子、脚；敷完后擦适量隔离霜，有利于锁水。
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海藻面膜范文2
1、可能是由于水加的过多或者是姿势不对，海藻面膜会由于重力的作用经常往下掉，所以敷海藻面膜时娿注意其调配的比例，一般海藻颗粒与水的最佳比例为1:4，可以保证海藻面膜的黏稠度，敷在脸上之后不会轻易掉落。
2、海藻面膜是能够为肌肤补水保湿的一个最常见的自制面膜，海藻颗粒能够为皮肤补充充足的水分，而且能够改善脸部干燥的状态，在敷海藻面膜之前应当保持脸部干爽，不用涂任何护肤品，这样可以保证脸部干燥并有极佳的摩擦力，这样海藻面膜在敷的时候就不容易滑落。
3、另外敷海藻面膜的时候最佳姿势是仰躺，避免海藻面膜因为自身的重力原因而滑落。海藻颗粒在遇水之后会变得很粘稠，所以一定要掌握好加水的比例，否则因为海藻面膜太稀也达不到敷面膜的粘性。海藻颗粒在加水之后需要一定的时间让海藻出胶，所以可以等15分钟，还可以手动搅拌来辅助出胶。
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海藻面膜范文3
这款面膜面膜布厚度0.1MM，吸水性好，一片足足30g精华液，材质是进口天丝，包含深海藻、螺旋藻、小球藻等，补充水分，收缩毛孔，促进营养吸收，消炎舒缓，敏感肌肤也不怕。这个秋天那么干，每晚一片刚刚好。
首先我不知道为啥这个面膜眼睛那里做的有点小，可能我眼睛大。其次这款面膜精华很多，手脚脖子涂完还能在分一点在脸上。敷在脸上就是感觉精华很多啊，不粘洗完脸滑滑的，可以不用洗，平价代替RAY，同样这个价格要和RAY一模一样的感受的话我也很无奈，毕竟人家RAY价格比这贵一倍
最后感受就是，这个价格能有这效果已经非常不错了，很多100的面膜可能都比不上这一款
好了解说完毕，反正我用完会想要继续囤着过冬
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海藻面膜范文4
关键词：海藻酸及其衍生物；医药；化妆品；食品；组织工程
早在1881年，苏格兰化学家Standford E.C.C.首先从褐藻中分离提取了一种物质，当时称之为Algin（褐藻胶）；当向其中加入酸则可形成凝胶，故又称之为Alginic Acid（褐藻酸），并且对此提交了专利申请。但是由于当时社会对海藻酸的认识还不够全面，且提取技术不够娴熟，因此当时海藻酸还没有得到广泛的应用。一直到1929年，美国才大规模生产海藻酸。到了20世纪30年代，日本等国相继研发和生产海藻酸。我国对海藻酸的提取和纯化方面的研究起步比较晚，一直到20世纪50年代，我国才开始进行开发和生产海藻酸。
1 海藻酸及其衍生物的应用
海藻酸吸水性强，不溶于水和非极性溶剂，且海藻酸中含有游离羧基，性质活泼，当其与一价以上金属离子结合后转化为海藻酸盐。海藻酸的盐类衍生物具有止血效果，其抗凝血作用与肝素相似。海藻酸与钙离子接触时很容易形成海藻酸钙的凝胶，胶体的稳定性极高。基于其优异的理化性质，海藻酸及其衍生物在医药、化妆品、食品、组织工程等方面具有广泛的应用。
1.1 海藻酸及其衍生物在医药领域的应用
海藻酸的盐类衍生物具有安全有效的止血效果，其抗凝血作用可媲美肝素。用海藻酸的盐类衍生物制成止血纱布，能止住压迫和包扎大动脉引起的出血；而海藻酸钠与葡萄糖、氯化钠、枸缘酸等配成代血浆，可很好地治疗失血性或中毒性休克、烧烫伤等；同时，海藻酸钠能与锶、镉形成不溶物从消化道中排泄出，从而减少放射性锶、镉在消化道的吸收；海藻酸与等分子的药物苯丙胺制成的药物含剂可抑制食欲，达到减肥的目的；另外，海藻酸经口服对欧利希氏（Ehrlich）固形癌有抑制效果，并对Metha固形肿瘤也有预防作用，它们与抗癌剂不同，对正常细胞无伤害作用[1]。袁 [2]用海藻酸钙制成敷料可明显减轻混合痔术后的创面疼痛，缩短愈合时间。
1.2 海藻酸及其衍生物在化妆品领域的应用
海藻酸钠分子中含有大量羟基，因此与水的亲和力很强，在与钙离子接触时很容易形成海藻酸钙的凝胶，并具有极高的胶体稳定性，可用作皮肤用膏剂的增稠剂；海藻酸盐应用于洗涤剂、无油脂乳化剂和牙膏中，可以促进油污的去除作用，生成的物质很容易用水除去；在肥皂中加入海藻酸钠，可以增强其起泡和稳泡性能，并且对乳化性能和表面张力不会产生不良影。海藻酸钠还能形成坚韧的纤维状或薄膜状的固形物，且海藻酸钠亲水性好，利用这些特性可制成面膜材料。
1.3 海藻酸及其衍生物在食品领域的应用
海藻酸盐大分子内的多聚古罗糖醛酸具有抑制放射性物质――90Sr的能力，因此，海藻酸盐可作为食品添加剂添加于各类食品和饮料中，长期服用这些食品和饮料能预防由放射性物质引起的疾病；将海藻酸盐和植物蛋白在氯化钙溶液中纺丝，可形成高弹性的短纤维，口感类似于动物肉筋的蛋白纤维，可替代饮食纤维；经过处理的海藻酸盐在肠内可富集胆固醇，并能阻止脂肪的吸收，其能力比天然粗纤维要强得多，因此，可用海藻酸盐制成保健食品[3]。海藻酸及其衍生物常用交联剂进行自交联后制备可降解膜或与其他天然高分子材料复合制备可降解膜，用于食品的保鲜或包装。刘邻渭[4]等将褐藻酸与环氧氯丙烷进行交联后制备褐藻酸膜，用于高湿食品保护膜；吴成业[5]等将褐藻酸钠与明胶混合制成可降解膜，用于鱼类的保鲜。
1.4 海藻酸及其衍生物在组织工程领域的应用
海藻酸钠水溶液在钙离子的作用下发生侧向交联由液体变为凝胶体，所形成的藻酸钙水凝胶呈现开放的网状结构，包埋在水凝胶中的细胞可进行营养和代谢物质的交换。虽然海藻酸钙的强度不足，但由于在生物相容性、可降解性、细胞-材料界面、三维立体多孔结构和可塑性等方面，海藻酸钙都有利于种子细胞的接种和生长，因此是理想的组织工程基质材料，可应用于骨、软骨组织工程等方面[6]。
2 结束语
海藻酸及其衍生物由于来源丰富，有一定的食品、医疗保健价值，目前在医药、食品、化妆品及组织工程领域均有广泛的应用。总的来说，近几年，关于海藻酸及其衍生物在医药、食品、化妆品及组织工程领域的应用仍会成为全球范围内的研究热点。随着人们生活水平的提高，对绿色健康的食品及医疗保健的需求也随之增加，因此，对海藻酸及其衍生物的更全面的开发利用有着重要的市场价值。
参考文献
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海藻面膜范文5
【摘要】 为研究人血小板冻干前负载海藻糖技术与方法，筛选出最佳负载海藻糖实验条件并进一步研究血小板在温度37℃条件下、 负载海藻糖4小时后的平均体积、体外激活程度和聚集反应性的变化，绘制血小板胞内海藻糖负载效率及浓度随温度、时间、胞外海藻糖浓度变化曲线，筛选合适的负载条件，分别以凝血酶、ADP、胶原、瑞斯托霉素4种物质作为血小板激活诱导剂，用血小板聚集仪分别检测血小板负载海藻糖前后的聚集反应性，用流式细胞仪检测分析血小板负载海藻糖前后其膜表面糖蛋白分子CD62p、PAC-1的表达率，加可逆性激活抑制剂PGE-1、腺苷后血小板激活被抑制的程度。结果表明：海藻糖负载效率与孵育时间（2小时后）、温度（30-40℃）呈良好线性关系，在37℃条件下经4小时孵育后负载效率可达60%，载入到胞内海藻糖浓度随胞外海藻糖浓度（＜50 mmol/L﹚的升高而递增；同负载前相比较，血小板平均体积（MPV）、血小板对4种激活诱导剂的最大聚集率均无显著性差别（P>0.01），经4小时负载海藻糖后血小板膜表面CD62p表达率升高，但联合添加可逆性激活抑制剂PGE-1、腺苷后CD62p表达率显著下降。结论： 37℃、4小时、胞外海藻糖浓度小于50 mmol/L为合适负载条件，添加可逆性血小板激活抑制剂后，冻干前负载海藻糖过程对血小板的体外激活和聚集活性没有显著影响。
【关键词】 海藻糖
Process of Human Platelets Loaded with Rehalose before Lyophili-zation
Abstract The aim of this research was to study the technology and methods of loading lyoprotectant-trehalose into cytoplasm of human platelets before lyophilization，to optimize experimental conditions of loading trehalose，to investigate the changes of platelets response to agonists and activation after incubation of platelets for 4 hours at 37℃ in the presence of lyoprotectant-trehalose，to protract the figures of loading efficiency and intracellular trehalose concentration versus incubation time，temperature and external trehalose concentration，to optimize loading parameters. The response of platelets to different agonists — thrombin，ADP，collagen and ristocetin were measured respectively by APACT2 aggregometer before and after loading trehalose into platelets；the expressions of CD62p and PAC-1 on platelet membranes in the presence and absence of reversible platelets activation inhibitors were measured by flow cytometry respectively before and after loading trehalose into cytoplasm of platelets. The results showed that the loading efficiency was linear to incubation time (2 hours later) and incubation temperature (rang from 30℃ to 40℃)，respectively. The loading efficiency almost reached 60% when the platelets were incubated at 37℃ for 4 hours. The intracellular trehalose concentration was higher with the increase of the extracellular trehalose concentration（＜50 mmol/L﹚. Compared to untreated groups，the values of MPV and aggregation to different agonists in treated groups showed no significant difference，respectively (P>0.01). After incubation of platelets for 4 hours，the expression of CD62p increased to some extent，however，the expression of CD62p decreased again when the reversible platelets activation inhibitor PGE-1 and adenosine were added to the incubation buffer. It is concluded that 37℃，4 hours and the extracellular trehalose concentration
Key words trehalose；freeze dried platelets；Platelets activation；Aggregation；reversible activation inhibitors
血小板有效负载海藻糖至胞内是血小板冻干保存的重要环节［1］。冻干保护剂海藻糖是一种分子量较大的非还原性二糖，血小板胞膜对其是非渗透性的［2，3］，如何克服细胞膜的非渗透性而有效将海藻糖载入到血小板胞内是目前国内外学者研究的重点和热点，Wolkers等［2］发明了一种简便有效的将海藻糖负载到血小板胞内的方法——液相内吞方法。本研究在此实验方法的基础上作了进一步的探讨和研究，筛选出负载海藻糖技术的最适实验条件，同时附带实验研究了血小板冻干前负载海藻糖过程对其体外聚集反应性和激活程度的影响。为此，我们既做了反映血小板主要功能活性的实验——聚集实验，同时也做了反映血小板体外激活程度的实验——流式细胞术测定血小板膜糖蛋白分子表达实验。现将血小板冻干制备必经步骤——胞内海藻糖负载技术的系列实验研究结果报告如下。
材料和方法
浓缩血小板来源
全部标本均来自解放军总医院输血科2004年1月至2005年8月间无偿献血者200毫升全血中分离的新鲜富含血小板血浆（FPRP）。
主要试剂及仪器
海藻糖(广西南宁中诺生物科技有限公司)、负载缓冲液A(100 mmol/L NaCl、 10 mmol/L KCl、 10 mmol/L EGTA、 10 mmol/L咪唑、10 μmol/l 前列腺素-E1，pH 6.8)、80%甲醇溶液、硫酸蒽酮试剂、4种血小板聚集反应诱导剂： 凝血酶、ADP、胶原、瑞斯托霉素，荧光标记抗血小板表面糖蛋白单克隆抗体（2-8℃保存）：CD62p-PE、CD61-Percp、PAC-1-FITC、RGDS(PAC－1阻断剂)，含1% 多聚甲醛及0.1%叠氮钠的PBS（pH 7.2）固定液，可逆性血小板激活抑制剂PGE-1和腺苷（Sigma公司产品）。酶标仪、恒温水浴箱、抽真空干燥器、可调温度孵育箱、超声清洗器、分析天平，Nihonkohden(MEK-6108K)血细胞自动分析仪。兰波APACT2血小板聚集仪（美生实业有限公司），FACS流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司），一次性12mm×75mm Falcon试管（Becton Dickinson公司）、CaliBRITE Beads/FACSComp软件（FACS仪器校正，预设获取条件）、CellQuest软件（实验数据获取和分析软件）、微量加样器和加样头。
血小板的洗涤
将富含血小板血浆320×g离心8分钟，移去红细胞和白细胞，上清液用负载缓冲液A溶液离心洗涤2次（480×g离心22分钟，480×g离心15分钟），用血细胞自动分析仪计数并调整血小板浓度在（1-2）×109/ml之间。
血小板负载海藻糖方法及胞内海藻糖浓度的计算
将调整好浓度在（1-2）×109/ml范围间的血小板置负载缓冲液A中负载不同浓度海藻糖（浓度范围： 0-80 mmol/L），在不同的孵育温度范围（4-37℃）和不同的孵育时间范围（0.5-4小时）条件下孵育，观察并记录海藻糖载入到血小板胞内的效率及浓度与孵育温度和时间的关系。经孵育之后的血小板溶液用负载缓冲液A洗涤2次（20 000×g台式离心机离心20秒，20 000×g离心45秒），留取血小板沉淀，用80%甲醇提取载入到血小板胞内的海藻糖，80℃条件下加热30分钟。用硫酸蒽酮反应定量载入到血小板胞内的海藻糖，用酶标仪测定用甲醇提取后的海藻糖溶液的吸光度值。绘制6-300 μg/ml范围内的海藻糖的标准曲线。通过与标准曲线核对检测的每个标本的吸光度值，换算成负载到每个血小板胞内的海藻糖摩尔数，海藻糖摩尔数/血小板平均体积的一半即胞内海藻糖的浓度。海藻糖的负载效率（取均值）＝负载到胞内的海藻糖浓度/初始胞外海藻糖浓度×100％。
血小板负载海藻糖前后平均体积的变化
用血细胞分析仪分别测定。
血小板聚集反应
用APACT2型血小板聚集仪分别测定血小板在负载海藻糖前后对诱导剂凝血酶(1 U/ml)、胶原(2 μg/ml)、ADP(20 μmol/L)、瑞斯托霉素(1.6 mg/ml)的聚集率，调整血小板计数为250×109/L，取调整好的FPRP 250 μl，加入25 μl诱导剂，记录最大聚集率。
流式细胞术检测血小板膜表面糖蛋白分子的表达
流式细胞术检测海藻糖负载前后血小板表面激活指标CD62p（磷脂酰丝氨酸，Ps）、PAC-1（活化的gpⅡb/Ⅲa复合物）的表达率，添加可逆性激活抑制剂PGE-1和腺苷后CD62p、PAC-1的表达率，表达用“＋”表示，未表达用“－”表示。实验设阴性对照管：取新鲜血小板，调整细胞数在（1 000-2 000）×109/L，取5 μl加PE同型对照（IgG1 PE）、CD61-PerCP、PAC-1 FITC、RGDS各5 μl；阳性对照管:取血小板5 μl加入2 μl凝血酶充分激活，再加1 μl GPRP (Gly-Pro-Arg-Pro)（防止血小板聚集），在试验管中加入3种抗体各5 μl和血小板5 μl后，轻轻混匀，室温暗处孵育15-20分钟，各管中加入05 ml冷的固定液 (2-8℃)，充分混匀，在2-8℃阴暗处放置30分钟。上机获取数据： 开机后，打开CellQuest，顺序放置对照管和试验管。获取数据： 调出，获取条件、FSC和SSC选择Log方式；获取条件为CD61 PerCP阳性，使用对照管调整FL1和FL2的PMT，使阴性群体位于FL1 vs FL2点图左下角，分别使用PAC-1 FITC / IgG1 PE / CD61 PerCP和PAC-1 FITC+ RGDS / CD 62P PE / CD61 PerCP调整FL2-FL1和FL1-FL2补偿，获取各管的试验数据。结果分析：在CD61 vs SSC点图中找出CD61 PerCP阳性的血小板群 (单个血小板和黏附在白细胞上的血小板)设门。门内做PAC-1 FITC vs CD62P PE点图的双参数分析，统计结果。
统计学处理
将不同时间、温度、胞外海藻糖浓度对应的胞内海藻糖浓度的多个均数进行配对t检验，胞内海藻糖的浓度以x±SD表示，用CHISS统计软件录入数据进行统计学分析处理。
结
果
胞内海藻糖浓度及负载效率与不同孵育温度（℃）的关系
在胞外海藻糖浓度50 mmol/L、4小时孵育后，负载到血小板内部的海藻糖浓度（ mmol/L）及负载效率（%）与不同孵育温度（℃）的关系见表1。在25℃以下，胞内浓度及负载效率很低，且差别不大；当负载温度超过30℃以后，胞内浓度及负载效率急剧增加；37℃时，负载效率可达35％；37℃以后，负载效率维持在一平稳水平。Table 1. Relationship between intracellular trehalose concentration，loading effeciency and incubation temperature (略)
胞内海藻糖浓度及负载效率与不同孵育时间的关系
在胞外海藻糖浓度为25 mmol/L、孵育温度37℃条件下负载到血小板胞内海藻糖浓度（ mmol/L）及负载效率（%）与不同负载时间(分钟)的关系见表2。孵育2小时之前，胞内海藻糖浓度及负载效率较低，2小时后，胞内海藻糖浓度及负载效率随时间的延长呈线性增加的趋势，4小时后维持在一平衡水平。Table 2. Relationship between intracellular trehalose concentration，loading effeciency and incubation time (略)
血小板胞外海藻糖浓度与胞内海藻糖浓度的关系在37℃孵育、经4小时负载后，不同胞外海藻糖浓度（mmol/L）与负载到血小板胞内海藻糖浓度（mmol/L）的关系见表3。从表3可以看出，在37℃条件下，随胞外海藻糖浓度（＜50 mmol/L）的升高，其胞内海藻糖的浓度也随着升高，但当胞外浓度＞70 mmol/L时，胞内海藻糖的浓度反而降低。在4℃条件下，胞内海藻糖的浓度一直维持在一较低水平。Table 3. Relationship between original extracellular trehalose concentration and intracellular trehalose concentration at 4 and 37℃ after incubation for 4 hours (略)
血小板胞内海藻糖的载入效率（%）随孵育时间、孵育温度及细胞内海藻糖浓度的关系
血小板胞内海藻糖的载入效率（%）随孵育时间，孵育温度的关系曲线如图1、图2所示。在37℃和4℃温度条件下载入到细胞内海藻糖浓度与不同胞外海藻糖浓度的关系曲线如图3所示。由图1可见，孵育4小时后负载效率高，可达60%，但4小时后负载效率并不随孵育时的延长而明显增加。图2表明，37℃时负载效率较高，可达35%，但负载效率并不随孵育温度升高而明显增加。图3显示，37℃孵育4小时细胞内海藻糖浓度明显高于4℃孵育4小时时。细胞外海藻糖浓度为50 mmol/L时细胞内海藻糖浓度最高，而细胞外海藻糖浓度高于50 mmol/L时，细胞内海藻糖浓度却下降。
海藻糖负载前后血小板MPV(fl)的变化
检测结果表明：负载前MPV为6.3±1.10fl，负载后MPV为6.7±1.23 fl，负载前后比较，t=1.084，P=0.285（＞0.05），差别无统计学意义，故负载过程不影响MPV变化。
海藻糖负载前后血小板对4种诱导剂的最大聚集率
结果见表4。由表4可见，血小板负载海藻糖过程对血小板聚集反应性无显著影响。Table 4. Comparion of platelets Aggregation rates（％） caused by 4 different agonists before and after loading with trehalose（略）
海藻糖负载前后、加和未加可逆性激活抑制剂PGE-1（10ug/ml）、腺苷（5 mmol/L）后血小板膜表面糖蛋白磷脂酰丝氨酸（CD62p）、PAC-1的表达率
流式细胞术检测结果见表5。从表5可见，在孵育溶液中加了可逆性血小板激活抑制剂PGE-1和腺苷后，CD62p的表达明显抑制，而PAC-1的表达保持稳定。Table 5. Expression of platelet membrane glycoprotein（CD62p）and PAC-1 before and after loading with trehalose (%) (略)
讨 论
通过与血小板胞膜第二相变温度（30－37℃）有关的液相细胞内吞途径，血小板可将胞外海藻糖有效载入到细胞内部。海藻糖在干燥状态下维持玻璃化状态，有着独特的保护大分子蛋白质和细胞膜的作用［4］。图1所示血小板负载海藻糖可在37℃条件、短短几小时时间内顺利完成，仅经4小时孵育，海藻糖负载效率可达50%以上，表明有限几小时时间内，胞内海藻糖跟胞外海藻糖的浓度便达到了化学平衡。实验结果显示，血小板从开始孵育起到2小时内对海藻糖的吸收速率较慢，但2小时后，细胞内海藻糖的含量增加很快，这表明吸收后的海藻糖均匀分布在血小板胞质内，而非仅仅局限在几个有限细胞器内［5］。Tablin等［1］ 和Wolkers等［6］利用一种分子量类似海藻糖的荧光染料(LYCH)作为标记也验证了上述观点的正确性，即荧光染料起初在内吞囊泡，短暂时间后，荧光染料便均匀分布在血小板胞质中，其确切机制有待进一步研究和探讨。图3所示在胞外海藻糖浓度0-30 mmol/L范围、37℃条件下，吸收到胞内海藻糖浓度与胞外海藻糖浓度呈现良好线性关系。但在胞外海藻糖浓度超过50 mmol/L，经过4小时孵育后，血小板体积变大，肿胀，且血小板聚集实验也验证其对包括凝血酶在内诱导剂的聚集反应性降低，吸收到胞内海藻糖浓度也开始降低。血小板细胞膜有两个相变温度范围，第一相变范围为膜磷脂相变范围，温度为15-18℃，第二相变范围为细胞膜结构域包括胆固醇在内的相变范围，温度为30-37℃。图2显示，在第一相变点15℃时，海藻糖只能少量缓慢吸收，当在第二相变点37℃时，海藻糖却被快速有效吸收，吸收效率可达35%。负载海藻糖后的血小板经冻干、再水化后，通过扫描电镜、流式细胞仪 、聚集实验等发现，其细胞膜的完整性、血小板的回收率、血小板同诱导剂的聚集反应性，与新鲜血小板相比，没有显著性差别［2］。海藻糖经液相内吞途径负载到血小板胞内来稳定冻干过程中膜脂、大分子蛋白质等物质的机制和原理不仅适宜于无核细胞如红细胞，也适宜于有核细胞如造血干细胞，海藻糖的细胞内有效负载是血细胞以及其他生物体冻干保存的生物物理学及生物化学基础［7］。
通过液相内吞途径，血小板可成功负载海藻糖到胞内［8-10］。这一过程大约需4小时，在这一时间间隔内，血小板平均体积并未因这一处理过程而发生改变，在胞外海藻糖浓度小于50 mmol/L情况下，血小板并未发生膨胀或皱缩等渗透性物理改变，但当胞外海藻糖浓度达到70 mmol/L以上时，细胞体积会发生明显膨胀，MPV变大，且当胞外海藻糖负载浓度大于50 mmol/L时，其负载到胞内海藻糖浓度反而降低。负载海藻糖之后的血小板对4种诱导剂的聚集反应性同负载前比较，虽略微降低，但无统计学意义 ［11］，这表明明冻干前预处理血小板过程不影响反映血小板主要功能的指标——对诱导剂的聚集反应性。因可逆性激活抑制剂PGE-1和腺苷的添加会干扰聚集实验的检测，故做聚集实验时，未添加可逆性激活抑制剂PGE-1和腺苷。用流式细胞仪检测反映血小板激活指标——膜表面糖蛋白CD62p、PAC-1的表达率实验中，血小板负载海藻糖4小时后CD62p表达率高于负载前，加入可逆性激活抑制剂后，其表达率显著下降，与负载前比较，无显著性差别。而PAC-1的表达率在血小板负载海藻糖前后、加和未加可逆性激活抑制剂条件下，均未发生显著性改变。CD62p是反映血小板激活后期一个最为灵敏的指标，而PAC－1（活化的 gpⅡb/Ⅲa复合物）是反映血小板激活早期的一个灵敏度不太高的指标。本研究显示，PAC－1的表达一直维持在一恒定水平，可能与试剂PAC－1－FITC的灵敏度有一定关系，其灵敏度比CD62p-PE略显不足，具体原因尚待进一步查明。实验结果表明，血小板负载海藻糖前，事先在负载缓冲液中添加一种或几种可逆性激活抑制剂（如PGE-1、腺苷等），可有效防止血小板在冻干前预处理过程中体外过度激活［12，13］，血小板在37℃、孵育4小时条件下负载海藻糖后其体外激活程度和聚集反应性未发生显著改变。
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海藻面膜范文6
【摘要】 人红细胞冰冻干燥保存在临床应用中具有重要意义。一些糖类，特别是海藻糖，能提高一些低等生物或细胞对干燥环境的耐受性，但如何将糖类导入细胞内又是一个挑战。本研究探讨人红细胞对糖类摄取的规律性。于不同温度（4、25和37℃）、不同浓度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol/L）及不同培育时间（1、3、5、7、9小时）条件下检测了红细胞对海藻糖和葡萄糖的吸收率及游离血红蛋白量，并测定了红细胞变性指数。结果表明：随着温度的上升和细胞外糖浓度的增加，红细胞的糖吸收率也随之上升，细胞内的海藻糖和葡萄糖浓度分别可以达到30 mmol/L和40 mmol/L以上。但孵育时间对海藻糖和葡萄糖的吸收率影响不同，随着时间的延长，细胞内海藻糖浓度呈先升高而后降低的趋势，而葡萄糖吸收率则呈稳定上升的趋势。但是糖吸收过程对红细胞的游离血红蛋白和变形性产生不利的影响，尤其是海藻糖，这主要来源于渗透压伤害。结论:红细胞的糖吸收率与孵育温度、外源糖浓度和孵育时间的关系密切，而且在一定条件下的糖吸收效率也较高，但此过程对红细胞有一定的伤害，这可能会影响糖类在红细胞冰冻干燥保存研究中的应用前景。今后的研究工作应集中于如何处理细胞伤害和糖吸收效率的关系。
【关键词】 人红细胞
Regularity of Sugar-Uptake in Human Red Blood Cells
Abstract
Lyophilization of human red blood cells has important significance in clinical application. Some sugars，especially trehalose，can be more tolerant of some organism or cells to dry environments，But，how to bring sugars into cells is a challenge. This study was aimed to investigate the regularity of sugar-uptake in human red blood cells. The absorption rate of trehalose and glucose in red blood cells，free hemoglobin level and erythrocyte deformation index were determined at different incubation temperature (4，25 and 37℃)，different sugar concentration (0，0.2，0.4，0.6，0.8 and 1 mol/L) and different incubation time (1，3，5，7 and 9 hours). The results showed that with increase of temperature and extracellular sugar concentration，the uptake of sugar in red blood cells also increased，the intracellular trehalose and glucose concentrations were over 30 mmol/L and 40 mmol/L respectively. The effects of incubation time on uptake of trehalose and glucose were different. With prolonging of incubation time，the uptake of trehalose showed firstly increase and then decrease，however，the uptake of glucose showed a constant increase. But the loading process had side-effect on free hemoglobin and maximum deformation index (MAXDI) of red blood cells，especially for trehalose，which mainly come from high osmotic pressure. It is concluded that the uptake of sugars in red blood cells is closely dependent on incubation temperature，extracellular sugar concentration and incubation time. In certain condition，the efficiency of sugar uptake is very high，but this process also damages red blood cells so as to affect the application of sugars in lyophilization of red blood cells. The research in the future should focus on how to deal with the relation between cell injury and uptake efficiency of sugar in red blood cells.
Key words
human red blood cells; trehalose; glucose; lyophilization
与传统的血液保存方法相比，红细胞冰冻干燥（冻干）保存具有很多优势：可以室温保存，重量轻，便于运输。这些优势使冻干保存更适合于战争和突发灾害等特殊环境［1，2］。尽管红细胞冰冻干燥保存具有重要的意义，但这项研究仍然面临着巨大的困难。通常人们认为在20世纪80年代以前的研究中没有获得一个结构完整的红细胞［3］。从20世纪90年代开始，许多研究者开始专注于此项研究，并获得一些让人振奋的结果［3-8］。然而，这些研究都面临着一个巨大的挑战：溶血问题。 一些研究表明，高浓度的上清游离血红蛋白主要是由于冻干和再水化过程中细胞膜的损伤引起的。 红细胞没有核，因此如何保护细胞膜是红细胞保存中的一个关键［1，2］。
近年来，糖类，包括海藻糖、蔗糖、麦芽糖以及葡萄糖等，在提高动物细胞或脂质体等细胞模型的耐干燥的效果引起了人们的关注。这些糖类，特别是海藻糖，可能为如何更好地保护细胞膜提出一个新思路。
研究表明，小分子糖类，如海藻糖、蔗糖和麦芽糖在稳定干燥细胞方面有特殊的效果［9］。Crowe等［10，11，12］详细讨论了海藻糖提高哺乳动物细胞对干燥或脱水耐受性的机制。Crowe［10］认为，海藻糖能代替大分子外的水膜，从而阻止干燥损伤。另外，海藻糖具有较高的玻璃态转变温度 (Tg)，能使干燥后的样品在室温下保持稳定的玻璃化状态。
Wolkers等［9］发现，血小板可以通过液相内吞作用吸收海藻糖，他采用这个方法冻干保存血小板取得成功，而且再水化后，血小板能在诱导剂的诱导下发生聚集反应。
然而，一些研究者认为对于红细胞的冻干保存而言，单糖，主要是葡萄糖的效果可能较好。Goodrich等［4］采用大分子物质羟乙基淀粉（HES）和葡萄糖作为主要保护剂冰冻干燥保存红细胞取得部分成功。我们的前期工作也证明，采用聚乙烯吡咯烷酮和葡萄糖作为主要保护剂冰冻干燥保存红细胞是可行的［1］。Crowe等［10］认为，尽管葡萄糖的Tg很低，但它能有效地降低冻干样品的熔融温度（Tm）；而大分子物质对Tm没有影响，但却具有较高的Tg，因此采用大分子物质和葡萄糖联合作为保护剂冻干保存红细胞是可能的。
本研究没有进行红细胞的冻干保存实验，而只是系统地研究了红细胞对海藻糖和葡萄糖的吸收规律，并对红细胞在此过程中受到的损伤进行了初步探讨，最终的目的是对葡萄糖和海藻糖在红细胞冻干保存中的应用效果进行评估，从而为今后更好地将糖类应用于红细胞的冻干保存打下基础。
材料和方法
试剂与溶液
如果没有特殊声明，所有的试剂均是分析级。海藻糖从Sigma公司购买。所有溶液均用超纯水配制。PBS (300 mOsm，pH 7.4) 包含 154 mmol/L NaCl，1.06 mmol/L KH2PO4，5.6 mmol/L Na2HPO4 和2 mmol/L 腺嘌呤。海藻糖或葡萄糖溶液为包含一定浓度海藻糖或葡萄糖的PBS缓冲液，pH 7.4。
红细胞的处理
全血取自解放军307 医院血库，加CPDA 抗凝。全血在4℃下600×g 离心10分钟去除白细胞和血小板。然后红细胞于相同条件下用PBS(300 mOsm，pH 7.4)离心洗涤3次。每次离心去除上层细胞，最后的浓集红细胞于4℃保存备用。
红细胞对海藻糖的吸收
红细胞对海藻糖的吸收率用改进的蒽酮比色法［14］测量。在整个试验中红细胞压积为22％。在温度试验中，红细胞于不同温度(4、 25 及 37℃)下在0.8 mol/L海藻糖溶液中孵育3小时。在浓度试验中，红细胞在不同浓度(0.2、0.4、0.6、0.8 及 1 mol/L)的海藻糖溶液中孵育3小时，温度为37℃。在时间试验中，37℃下红细胞在0.8 mol/L海藻糖溶液中孵育0，1，3，5，7小时。孵育后离心去上清，再在细胞中加入PBS（1 460 mOsm，pH 7.4），在相同条件下洗3遍。 在最后的细胞中加入80％甲醇混匀，在85℃下处理60分钟以完全破坏红细胞。然后取1 ml上清和2 ml蒽酮试剂混合均匀，在100℃下反应3分钟，然后在-20℃下降温。最后于分光光度计测量光吸收值，根据标准曲线求细胞内海藻糖浓度，波长为620 nm。
红细胞对葡萄糖的吸收
除了细胞内葡萄糖检测方法不同外，其它的操作步骤与红细胞对海藻糖的吸收步骤相同。红细胞对葡萄糖的吸收率用葡萄糖氧化酶法测定，检测试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司。
游离血红蛋白
红细胞和海藻糖或葡萄糖溶液在一定条件下孵育后，离心取上清，用苯息丁法［1］测定游离血红蛋白浓度。
红细胞变形性
红细胞与海藻糖或葡萄糖缓冲液共孵育后，40 μl细胞悬液和0.8 ml 15% 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) (分子量约为40 kD)混合均匀，在LG-B-190 EKTACYTO METER ( GTM - Steellex Instrument Co Ltd)变形仪上测量最大变形指数（maximum deformation index，MAXDI）。
统计学分析
细胞内海藻糖或葡萄糖浓度、游离血红蛋白和变形性（MAXDI）用One-Way ANOVA 和LSD multiple comparison (SPSS软件)分析。 P
结 果
孵育温度对红细胞糖吸收的影响
由图1A可以看出，随着孵育温度的升高，红细胞对海藻糖和葡萄糖的吸收率均呈上升的趋势，但红细胞对葡萄糖的吸收率要高于海藻糖。我们认为，这主要是由于葡萄糖分子较小，更易于进入红细胞。当温度为4℃时，无论是海藻糖还是葡萄糖，细胞内糖浓度只有5 mmol/L左右，显著低于25℃和37℃时的糖吸收率。当温度为37℃时，细胞内海藻糖浓度为25 mmol/L左右，而葡萄糖的吸收率则更高，达到将近40 mmol/L。但是从图1B、C可以发现，随着温度的升高，红细胞的MAXDI下降，而游离血红蛋白则呈上升的趋势，这说明糖吸收过程对细胞造成一定伤害。同时海藻糖孵育对红细胞变形性的损伤要高于葡萄糖。随着温度的上升，吸收葡萄糖的红细胞的游离血红蛋白浓度不到0.05 g/L，显著低于海藻糖处理组（P
细胞外糖浓度对红细胞糖吸收的影响
由图2A看出，随着糖溶液浓度的上升，细胞内的糖浓度也随之增加，但葡萄糖吸收的增加幅度明显高于海藻糖，当葡萄糖浓度为1 mol/L时，葡萄糖的吸收率在30 mmol/L以上，而海藻糖的吸收率仅为20 mmol/L左右。另外，从图2B可以看出随着糖溶液浓度的升高，红细胞的MAXDI呈逐渐下降的趋势，其中海藻糖对细胞变形性的影响要大于葡萄糖，当糖浓度为0.8 mol/L时，吸收海藻糖的红细胞的MAXDI仅为0.25左右，吸收葡萄糖的红细胞的MAXDI却在0.40左右。从图1C可以看出，海藻糖和葡萄糖溶液对红细胞游离血红蛋白的影响差别很大，随着浓度的上升，海藻糖处理组红细胞游离血红蛋白呈显著上升的趋势，当海藻糖浓度为1 mol/L时，其游离血红蛋白在0.40 g/L左右，显著高于葡萄糖处理组（P
孵育时间对红细胞糖吸收率的影响
由图3A可以看出，红细胞对海藻糖的吸收率随孵育时间的变化不同于葡萄糖。随着孵育时间的延长，红细胞对葡萄糖的吸收率呈逐步上升的趋势，当时间为9小时时，细胞内葡萄糖浓度在45 mmol/L左右；而细胞内海藻糖浓度随时间延长呈先升高而后降低的趋势，当时间为3小时时，吸收浓度最高，仅为20 mmol/L左右，显著低于葡萄糖吸收率(P
讨 论
如何将糖类导入红细胞并达到一个相对较高的细胞内浓度将影响着糖类在红细胞的冰冻干燥保存研究中的应用前景。本实验检验了红细胞对寡糖（海藻糖）和单糖（葡萄糖）的吸收情况，同时对红细胞在糖吸收过程受到的伤害进行了评价，最终的目标是优化红细胞糖吸收过程，为进一步开展红细胞的冰冻干燥保存研究打下基础。
我们发现，红细胞主要通过简单扩散的方式吸收葡萄糖，即葡萄糖是沿着浓度梯度进入细胞；而海藻糖的吸收可能更复杂，因为在正常生理条件下，海藻糖由于分子较大而无法通过细胞膜。Satpathy［13］认为，海藻糖通过渗透压差异和膜相变的联合作用进入红细胞内。而渗透压差异是简单扩散的一个必要条件，所以简单扩散在海藻糖吸收中也可能扮演重要角色。协助扩散需要膜转运蛋白的协同作用，从本实验来看，协助扩散不可能起主要作用，因为协助扩散在较低的浓度下即可以达到较高的转运效率。从整个实验来看，葡萄糖的吸收效率高于海藻糖，这主要是由于葡萄糖分子小，更易于进入细胞内，而海藻糖分子较大，在相同的处理条件下，海藻糖进入细胞的速率较慢，所以红细胞对其吸收率也相应降低。
红细胞糖吸收率和温度、细胞外糖浓度以及孵育时间密切相关。图1A表明，随着温度的上升，红细胞对海藻糖和葡萄糖的吸收呈显著上升的趋势，这说明较高的温度可以提高糖吸收率。Wolkers等［14］发现，红细胞质膜在14℃时有一个低协同性相变，这个相变主要是由于磷脂的熔解而引起的，而另一个相变点在34℃左右，这主要是由于胆固醇和鞘脂类富集区的熔解而引起的。在本实验中，当孵育温度为37℃时，葡萄糖和海藻糖的吸收率最高，这表明膜磷脂相变，尤其是胆固醇和鞘磷脂的变化对糖吸收有重要影响。
另外，从图2A可以看出，随着糖浓度的升高，红细胞对糖的吸收效率也随之上升。而糖浓度的升高对应着渗透压的升高，所以较高的渗透压差能促进红细胞对海藻糖和葡萄糖的吸收率。另外在相同的浓度条件下，葡萄糖溶液的渗透压低于海藻糖溶液，所以红细胞对葡萄糖的吸收效率要高于海藻糖。
但是孵育时间对红细胞葡萄糖和寡糖吸收率的影响是不同的。随着时间的延长，红细胞对葡萄糖的吸收率也随之上升，但海藻糖的吸收率呈先升高而后降低的趋势（图3A），这和Satpathy等［13］的结果不同。Satpathy认为，细胞内海藻糖浓度随着孵育时间的延长而增加。我们认为红细胞在洗涤过程中受到了渗透压的伤害而造成细胞数的减少(数据没有提供)，因此随着时间的延长，海藻糖吸收率反而下降。
糖吸收过程对红细胞造成一定的伤害。随着温度的升高、细胞外海藻糖浓度和孵育时间的增加，红细胞的变形性和上清游离血红蛋白指标均逐渐变差。我们认为，这些损伤主要来源于渗透压的变化。在本实验中，我们发现海藻糖对细胞的伤害要高于葡萄糖，这主要是由于在相同浓度条件下，海藻糖溶液的渗透压要高于葡萄糖溶液，所以对细胞造成的伤害相应也较大。另外，尽管细胞膜相变能促进红细胞对糖的吸收，但也可能对细胞造成一定损伤。
总之，本实验表明红细胞可以通过简单扩散吸收海藻糖和葡萄糖，而且渗透压和膜相变对红细胞对葡萄糖和海藻糖的吸收也有一定的促进作用，其中红细胞对于葡萄糖的吸收效率要高于海藻糖。红细胞糖吸收效率的提高与细胞受到的伤害存在一定的协同关系，即在糖吸收率提高的情况下，红细胞受的伤害也相应增加。尤其是海藻糖对细胞的损伤更大。所以，今后如果要将糖类应用于红细胞的冰冻干燥保存中，必须要协调好提高糖吸收率和减少细胞损伤的关系。
参考文献
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