蛋白质的体外消化模型
蛋白质是食品的重要成分之一，涉及到的蛋白质消化酶及消化条件有比较好的研究基础，且相对明确，因此，针对蛋白质的体外消化模型研究的最早，相关的研究和应用报道也较多。
1.蛋白质体外消化模型建立的主要依据
消化蛋白质的酶主要是蛋白酶，食物经过口腔的咀嚼，经由咽、食管、进入胃、小肠中，在蛋白酶比较丰富的胃肠开始消化过程。体外实验中酶的浓度、反应温度、pH、时间及抑制剂、激活剂都是影响蛋白质消化的重要因素，且消化不同食物来源的蛋白质的酶种类不同，它们刺激肠胃产生的酶量不同、所需消化时间也不同。在模拟消化的过程中，一般模拟的部位主要是胃和小肠，在胃中水解蛋白质的胃液主要由胃蛋白酶和胃酸组成。小肠中的蛋白质消化相对复杂，由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和肽酶、羧肽酶 A、B 等组成，可将经胃消化所得的肽或蛋白质进一步水解为氨基酸和小肽。蛋白质体外消化模型一般以蛋白质的消化率为测定参数，消化率是动物从食物中所消化吸收的蛋白质占总摄入量的百分比，是评价食物营养价值的重要指标。Abdel-Aal[6]研究表明，蛋白酶的种类及酶作用顺序和过程会对蛋白质的消化率产生影响。他们用三种酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶、肽酶）同时消化蛋白质，对比两种酶（胃蛋白酶和胰液素）分两步消化蛋白质，就蛋白质的消化率而言，发现前者比后者高 39-66%。席鹏彬等[7]在研究菜粕的体外消化中也发现，如果用胰酶制剂代替胃蛋白酶-胰蛋白酶两步酶解过程中的胰蛋白酶可使菜粕干物质和粗蛋白质的消化率分别提高 5.2%和 11%。所以，复合酶体系更符合体内的消化状况[1]。另外，摄食的蛋白量增大会引起胰液素蛋白酶的分泌增多，同样地，淀粉和脂质的摄入量增加会分别引起唾液淀粉酶和酯酶分泌增多，即食物组成和摄入量的不同会引起相应的酶分泌增加或减少，建立体外消化模型时也需考虑这方面的因素。单酶法可用来预测单个物质的可消化性，例如，淀粉的消化主要用淀粉酶，脂质的消化主要用脂肪酶、蛋白质消化用蛋白酶[1]。单酶消化法要比运用复合酶消化更有利于消化模型的标准化，但实际上，食用物质中各种营养物质相互作用，彼此间相互影响，所以就实用性而言，复合酶体系占优势[2]。
2.体外消化模型在食物蛋白质研究中的应用
近十年来被用于蛋白质营养代谢、生理活性、过敏原检测等方面研究的体外消化模型中，主要以谷物类蛋白，奶制品中的蛋白质，以及水产品和一些果蔬中的蛋白质为研究对象。谷物类作为人们食物的主要来源，其蛋白质是主要研究对象，如对小麦蛋白[6]、大豆蛋白[8]、菜粕粗蛋白[9]等都有研究。在这些体外消化模型中，所采用的消化酶主要是胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰液素，牛奶作为膳食中蛋白质的主要来源之一也是蛋白质体外消化模型的主要研究对象，如对牛奶蛋白[10]、山羊奶蛋白[11]、牛乳清蛋白[12]、瑞士干酪[13]、β-乳球蛋白[14]的研究。上述体外消化模型因研究对象和目的不同，采用的消化酶组成和 pH 也不尽相同。例如在研究牛乳清蛋白时，研究者首先模拟胃部消化环境，在体外采用猪胃蛋白酶、牛科动物的凝乳蛋白酶、胃蛋白酶以及不同 pH 的小鼠胃液对牛乳清蛋白进行消化，结果表明在不同消化酶的作用下 α-乳白蛋白和牛血清白蛋白被水解了而 β-乳球蛋白在不同的消化酶和不同 pH 作用下都没能水解，可见加热变性的乳清蛋白包括 β-乳球蛋白都被胃蛋白酶彻底水解了。在进行体内试验时出现了与体外试验相同的结果，天然的 β-乳球蛋白在小鼠体内未能消化但是加热变性的 β-乳球蛋白却在小鼠胃内消化了，与胃部体外模拟实验结果一致。接着，研究者在体外模型和小鼠体内分别研究蛋白质在肠中的消化，在体外用胰液素去消化天然的和变性的 β-乳球蛋白，二者都被消化了，同时将在胃中不消化的天然的 β-乳球蛋白注射到小鼠胃内，这些天然的β-乳球蛋白进入小肠后也被消化了，这与体外结果也是一致的。这个实验表明体外建立模型模拟蛋白质的消化可以较好的反应体内真实的消化状况，将其作为蛋白质消化研究的方法和工具是可行的。
3.体外消化模型在活性寡肽研究中的应用
随着生物活性寡肽研究的深入，关于活性肽的消化研究也逐步展开。摄入蛋白质不仅是人体需要的营养物质氨基酸的重要来源，还扮演着生物活性肽的重要角色，体外模型对活性肽消化和活性的评价已有应用的先例。目前报道较多的是消化模型应用于 ACE 酶抑制活性肽的研究。有研究者在体外用 pH 在 2～3 之间的胃蛋白酶液和 pH 在 7～8 之间的胰液素消化瑞士干酪[15]，结果发现经消化后的蛋白产物的 ACE酶抑制活性发生了变化。高分子量的蛋白质消化后会产生一些新的活性肽，加强对 ACE 酶的抑制，而原本具有一定 ACE 酶抑制作用的 10ku 的肽却被消化了，这又降低了产物的 ACE 酶抑制活性，研究结果表明消化带来的蛋白和肽的结构变化，将与其体外活性测定的结果有所差别，高活性的物质也许经过消化后，其活性中心被影响，导致活性降低，而低活性的物质，经过消化后也许活性片段将暴露，活性反而更高。因此，传统的简单的体外活性筛选不能完全反应它们在体内经消化后的活性状况，结合消化模型对活性进行综合评价是十分必要的。同类研究还有用胃蛋白酶-胰液素联合消化大豆蛋白[10]或鲣鱼[16]蛋白，研究其产物的 ACE 酶抑制活性。体外消化模型也有用于抗氧化肽研究的报道，我国学者王兴等[17]人通过体外模拟部分胃、肠道消化过程，考察苦荞蛋白经胃、肠道消化后生成肽的组成及其抗氧化活性，揭示了苦荞蛋白质体内消化与抗氧化活性的关系。研究结果显示苦荞蛋白质经模拟消化 10h 后产生最高抗氧化活性多肽，凝胶分离出 5 个组分，其中分子质量为 900u 的肽具有最强的抗氧化活性。生物活性肽在人体内发挥着重要作用，活性肽进入人体后的消化产物是多样的，只有能在体内环境下保留某些特征结构或者释放特征结构的肽分子才会在人体内发挥重要功能。因而，采用体外消化模型进行活性肽的筛选和评价，不仅可以缩短研究时间，减少研究费用，同时也是更为准确和合理评价其活性所必需的，对于生物活性肽食品、药品的开发有重要意义。
4.体外消化模型在过敏原研究中的应用
蛋白质体外消化模型还被应用于过敏原等对人体有重大潜在危害的蛋白或肽类物质的检测中。如对猕猴桃过敏原[18]、鲤鱼过敏原[16]的研究。一些研究者通过模拟肠胃液消化试验，分析锯缘青蟹肌肉中过敏原（原肌球蛋白）的消化特性以及消化对过敏蛋白致敏性的影响，结果表明蟹类过敏蛋白相对于非过敏蛋白具有较高的消化稳定性，而且其高分子质量降解产物仍可能引起过敏反应[19]。试验采用模拟胃、肠液环境，以 SDS-PAGE 和Westernblot 进行分析，对青蟹原肌球蛋白和肌原纤维蛋白在体外模拟肠胃环境中的消化稳定性进行了测定。在模拟胃液反应中，非过敏原蛋白尤其是肌球蛋白重链和肌动蛋白可被胃蛋白酶快速降解，而过敏原蛋白原肌球蛋白在 60min 时仍未被完全分解。在模拟肠液反应中，相对于致敏蛋白，肌球蛋白重链、肌动蛋白等非过敏蛋白在较短的时间内被分解，原肌球蛋白尽管 120min 后几乎被完全分解，但会产生一些较稳定的蛋白降解片段，而且其中一些分子质量为 34ku 的原肌球蛋白降解产物仍具有过敏原性。体外模型的应用为过敏原的研究提供了简便实用的工具。除上述研究外，还有大量的应用体外消化模型对动植物蛋白进行研究的报道，如对海藻蛋白[20]、肌原纤维蛋白[21]、肉类蛋白[22]、抗高血压三肽[23]以及其它动物副产品蛋白的研究。由此可见，作为应用较早的体外消化模型，蛋白质体外消化模型已经开始在蛋白质的各类研究中发挥重要作用。#p#分页标题#e#
糖类的体外消化模型
糖类是人体最主要的供能物质，食物中糖类的消化主要受到淀粉酶的作用，在淀粉酶的水解作用下，淀粉转化为寡糖和单糖。从上世纪九十年代起就有关于在体外分析食物中碳水化合物可消化性的报道，但其中又有较大的不同，主要表现为消化模型采用的食物粉碎方式、在胃中的消化时间、淀粉水解酶种类等方面。研究表明食物的粉碎方式对淀粉的消化具有明显的影响[24]，另外，淀粉消化物粘度[22]也会影响消化率，但是在体外实验条件下很难准确地模拟人体的生理状态，所以目前一般不考虑粘度对淀粉消化速率的影响[24]。与蛋白质的体外消化模型一样，在建立糖类体外消化模型时主要考虑酶、食物成分、颗粒大小和 pH 的影响。与蛋白质体外消化模型不同的是，由于口腔中唾液淀粉酶的重要作用，糖类消化模型不能忽略口腔的消化作用。同时还发现，可能是由于口腔中唾液淀粉酶对淀粉有初步的消化作用，所以与部分蛋白质和脂质消化模型相比，体外模拟淀粉消化模型中胃蛋白酶和胰液素对淀粉的作用时间设置较短。目前有关糖类体外消化模型的研究主要用于分析食品中淀粉多糖、非淀粉多糖、抗性淀粉以及被 FAO 列为第七大营养素的膳食纤维。从已建立的糖类体外消化模型来看，大多数糖类主要模拟在口腔、胃和小肠三个部位中的消化过程，口腔中唾液淀粉酶的作用时间一般选取 6min，pH（7.0±0.2）即接近中性环境，胃中胃蛋白酶的作用时间在 0.5～2.0h，pH 在 1.5～2.0 之间，而在小肠中的消化时间就相对比较长在 3h 左右，pH 大约在 5 左右，小肠中消化糖类的酶有胰液素、淀粉转葡糖苷酶、转化酶等。一些研究针对抗性淀粉和纤维素含量较高的食物如豆科类植物还特别模拟了在大肠、回肠中的发酵过程[25]。近年来糖尿病等与碳水化合物摄入紧密相关的重大疾病越来越成为人们的困扰，血糖碳水化合物定义委员会建议通过建立可靠的、标准化的体外模型去模拟糖在体内的消化，但是目前这样的模型还不是很完善，所以限制了食品工业利用营养标记技术控制血糖的大规模应用[24,26]。同时，大量糖类生理活性物质的开发和利用也需要消化模型的支持，所以，研究糖的体外消化模型对食品、医药行业有重要的意义。
脂类的体外消化模型
食物中的脂类以多种形式存在，包括活性脂质、结构脂肪、脂质乳液等。然而，大多数的脂肪在口腔、胃或是小肠中受到机械应力或是表面活性剂和稳定剂的作用，分解为水包油乳化液[27]。因此，饮食摄入的脂肪，其消化是以水包油乳胶进行的[28]，这是脂质消化不同于其它物质的主要特点。影响脂质消化的因素有很多，Anette Mullertz 等人[29]在体外用胰脂酶对脂质进行水解以建立体外的脂质消化模型，此模型被用于难溶性亲脂性药物在可控速率下的溶解性研究。实验中用 1 M 的 NaOH 调节pH 至 6.5，温度设定 37℃，这时胰脂酶的活性最强，在消化液中加入纯水配制的胆汁盐和 Ca2+溶液，研究胆汁盐和 Ca2+浓度以及酯酶活性三个参数对脂质水解速率的影响，结果发现三个参数对脂质的初水解速率都有影响，且只有酯酶活性和 Ca2+浓度影响随后的水解速率，所以通过控制 Ca2+的添加浓度来控制脂质水解率从而建立一种脂质体外消化模型是可行的。与蛋白质和糖类消化不同的是胆汁盐对脂质消化也有影响，有研究表明足够的胆汁盐会解析脂质颗粒表面吸附的其它活性成分，使酯酶吸附到胆汁盐界面，从而提高脂质的消化[29,30]，因此研究中使用的脂质消化模型也多添加胆汁。脂质体外消化模型一个很重要的作用就在于对脂质制剂的筛选、评价及预测，在医药行业有很重要的应用。例如，我国的研究者根据脂质制剂肠消化吸收的特性，在体外脂解模型的基础上，引入肠吸收评价方法，建立了一种用于筛选评价脂质制剂的新型体外动态肠吸收模型，研究了葡萄糖、K+、Ca2+对肠道消化吸收脂质的影响。
维生素的体外消化模型
目前研究较多的还有多种维生素的体外消化模型，如来自蔬菜和水果中的维生素 C，维生素 E，维生素 A 的前体物质类胡萝卜素等[32]，这些活性物质在人体内有很重要的生物活性功能。在评价维生素对人类健康的作用时生物利用率是一个关键的概念，但是一些脂溶性的物质需形成胶微粒才会被人体吸收，所以其在人体内的生物利用率是经过估计得到的相对值[32]，基于此目的建立了简单、便利的体外消化模型来评价维生素在体内的生物利用率。维生素的消化率和生物利用率与多种因素相关，如食物基质、加工过程和显微组织成分等[33]。Emmanuellae[34]等人在体外模拟了蔬菜中维生素 E 和胡萝卜素的消化，他们建立的消化模型如下：食物与 0.9%的 NaCl 混合物均质 10min，调节 pH=4.0 并加入猪胃蛋白酶温育 30min，之后用磷酸氢钠调节 pH 至 6.0，并加入胆汁盐和胰液素，消化时间 30min，整个过程在 37℃的恒温震荡水浴中进行。他们利用 HPLC 检测了消化后胡萝卜素和维生素 E 的含量，并计算其生物利用率，发现体外和体内的生物利用率有较好的相关性，r=0.9，而与从健康人群中获得的生物利用率相比，相关性高达 0.98[35]。由此可以推断目前一些成熟的体外消化模型是较为准确的，可以在一些研究和实际应用中使用。此外，Amanda 等人[35]模拟了亲脂性的 β-胡萝卜素的肠道静态消化模型，图 2 是 Fernando 等[36]研究者模拟的橙子中叶黄素脂类和花椰菜中非脂化的类胡萝卜素与维生素 E 的体外消化模型。除脂溶性维生素外，水溶性维生素如维生素 C 的体外消化研究也开始的较早，AntonioPerez-Vicente 等人[37]于 2002 年第一次研究了石榴汁中维生素 C 在模拟的胃、肠中的消化状况，他们建立的体外消化模型中先用浓盐酸调 HCl-胃蛋白酶消化液的 pH 至 2.0、消化时间 2h，再用碳酸氢钠调节胰液素和胆汁盐消化液的 pH 至 7.5、消化时间 2h。消化后通过紫外-可见光谱从不同的酚类化合物中分辨出维生素 C，再用 HPLC 对维生素 C 进行分析，结果显示经模拟的胃肠道消化后在胃肠液中还存在一部分具有生物活性的维生素 C，而这部分维生素 C 对人体健康是很重要的。这些成功的研究经验将为今后食品维生素摄入基础和应用研究提供有力支持。
其它物质的体外消化模型
1.金属物质的体外消化模型
一些可食用物质中包含人体代谢所必需的金属元素以及有毒的重金属元素，如镉、铅等[38]。摄入的金属元素，一方面需要评价其在胃肠中的潜在利用率，另一方面，需要评估其对人体的风险。因此，有必要建立体外消化模型以分析金属元素摄入的利弊。Marise Intawongse 等人[32]总结了土壤和食物中的多种金属离子的体外消化情况，包括 Al、As、Cd、Ce、Cu、Pb、Zn 等。金属元素的体外消化模型条件如下，口腔：唾液、pH6.5，作用时间 2min；胃：HCl、胃蛋白酶，pH1.0-4.0，作用时间 3h；小肠：胰蛋白酶、胰液素、淀粉酶，胆汁，碳酸氢盐，pH4-7.5，作用时间 7 h。温度维持在 37℃，以保证所有的消化酶都发挥正常的催化效果。他们还对Cd、Pb、As、Fe 在体内做了生物利用率的相关试验，以证明体外消化模型的准确性，结果表明体内和体外测定的生物利用率具有良好的相关性。我国研究人员进行了基于体外消化模型的香蕉果肉中可溶性钙含量的分析，在分析过程中引入了人体外消化模型进行预处理，采用火焰原子吸收分光光度计测量 Ca 含量[39]。可见，在金属离子生物利用率测定方面体外消化模型已经开始发挥着重要作用。#p#分页标题#e#
2.评估食物中污染物生物利用率的消化模型
食物的摄入是污染物进入人体很重要的途径之一，这些污染物主要由工业、环境污染或者产品加工造成[40]。但是只有从食物中释放的那一部分污染物才可以发挥它们的毒性作用[41]，因此生物利用度是指从食物中摄取的污染物到达体循环并且其毒性作用能够起作用的部分。采用体外模型对有害物质的生物利用度进行合理的评估，将有利于一些工业产品有害物质残留标准的制定。在过去的几年中，应用体外消化模型研究了包括有害的金属元素、黄曲霉毒素 B1、赭曲霉毒素 A、小孩误吞的玩具等有害物质[42]摄入的危害。Oomen 等人[42]建立了相关的体外消化模型用来评价肠道中来自食物和土壤的有害物质的生物利用度，这些模型也是研究其它误食的有害物的消化模型建立的起点。还有一些研究者依据编织物中含有的偶氮苯、指甲油中的铅、玩具上的油漆、PVC 磁盘中的邻苯二甲酸盐的消化状况建立了四种污染物的体外消化模型[43]。
体内消化和体外消化模型的关系
体外消化模型和体内消化之间有紧密的联系，建立体外消化模型时必须以实际的体内消化情况为依据，但是目前这种体内消化数据比较缺乏[43]，这导致了科学家对不同物质的体外消化模型与体内实际消化情况的一致程度产生了争论，例如，As 和 Pb 已经有一些可靠的体内生物利用率数据[36]，一项研究模拟了土壤中 As 在胃和小肠中的体外消化，发现与幼猪的体内消化情况有很好的一致性[43]。因此，这种方法可以被用来在体外测量 As 的生物利用率。此外，Fatouros 等[44]的报告表明，体外脂质递送药物的溶解数据与体内具有良好的相关性。然而，其它体内喂养研究发现，乳化剂的类型不同，脂质通过肠道时的乳化微结构会产生很大的差别，目前的体外消化模型对此类物质还不能准确的模拟。因此，体外消化模型的研究仍需针对不同的摄入成分，有针对性的开展大量工作，不能忽视体内实际的消化情况，在建立和使用的过程中，注意与体内实际消化结果进行对比，不断完善体外消化模型。
展望
通过前面对体外消化模型的建立和使用的研究总结发现，食物成分的体外消化模型是一种非常重要的研究手段。体外消化模型可以快速模拟食物和药物在体内的消化吸收情况，对食品行业和制药行业的发展具有重要的意义。体外消化模型的建立同时也是一项非常困难的工作，尽管目前一些体外消化模型是依据人体胃肠道建立起来的，但是如果没有体内消化为依据很难判断哪个体外模型更加准确。所以建立体外消化模型面临的主要问题是：（a）体外消化模型与体内消化状况的一致性仍需大量实验完善和验证；（b）体外消化模型要兼顾针对性和通用性，即模型要针对特定的摄入成分，不断改进模型的各个环节，在此基础上可以尝试适用于多种食用物质的消化模型，以增加它的通用性，使之在更为广阔的领域发挥作用。针对第（a）个问题，我们需要在研究中注意体内实验的支持，不能盲目的建立和使用。第（b）个问题的解决需要我们长期研究的积累，在借鉴他人研究成果的同时，不断完善前人的研究方法和技术。可以预见，在不远的未来体外消化模型的建立和使用将成为食品、药品以及保健品等行业不可或缺的重要研究、检测和评价手段，在此之前需要我们共同的努力，互相借鉴，共同促进体外消化模型的完善和发展。
本文作者：张艳芳 董平 梁兴国 单位：山东青岛中国海洋大学食品科学与工程学院
