秦岭细鳞鲑(Brachymystaxlenoktsinlingensis)隶属于鲑形目(Salmoniformes)、鲑科(Salmonidae)、鲑亚科(Salmoninae),俗称梅花鱼、五色鱼,是典型的陆封型冷水性鱼类,是第四纪冰川时期自北方南移的残留种,地域分布范围狭窄,为中国特有种,是世界上分布最南的鲑科鱼类。20世纪60年代李思忠[1]将陕西太白山细鳞鲑定为一新亚种。目前秦岭细鳞鲑仅分布在中国黄河的渭河水系南、北部各支流上游和长江的汉水北侧支流湑子河、子午河上游,栖息的河流海拔为900～1300m,水流湍急、水质清澈、水底多为大型砾石[2]。秦岭细鳞鲑一般3～5龄达到性成熟,并于每年春、夏季(36月)溯河洄游至上游的各支流小溪中觅食并完成繁殖,秋末又由上游顺水向下游较大较深的河流迁移,或是河流两岸的深潭、石缝中越冬[3]。由于栖息地环境恶化、人类偷捕现象严重,导致秦岭细鳞鲑野生资源日益减少,1988年被中国政府列为国家二级重点保护动物[4]。鉴于秦岭细鳞鲑的濒危现状,陕西省政府在1997年先后在太白县和陇县建立秦岭细鳞鲑自然保护区,但是有关秦岭细鳞鲑的基础研究仍较为薄弱,2010年长江水产研究所、陕西省水产研究所和陕西省陇县秦岭细鳞鲑部级自然保护区三方合作首次取得其人工繁殖和幼鱼培育的成功[5],为秦岭细鳞鲑相关生物学和保护技术研究奠定了基础。本研究通过对秦岭细鳞鲑胚胎、仔鱼和稚鱼阶段发育的观察,了解秦岭细鳞鲑胚胎发育的规律,探讨相关孵化条件对其发育的影响,以期为秦岭细鳞鲑的人工繁殖和鱼种培育提供科学指导。 1材料与方法 1.1材料来源 2011年4月516日于陕西省陇县千河支流咸宜河(秦岭细鳞鲑保护区内)采用电捕方式(电压8~10V)捕获数对秦岭细鳞鲑性成熟亲鱼,采用氧气打包方式运回陕西省陇县秦岭细鳞鲑部级保护区咸宜关保护站基地(N34°52.939′,E106°38.921′)暂养1周左右,待亲鱼稳定后采用人工催产获得受精卵。 1.2实验方法 将受精卵静置至少20min,然后再缓慢地转入孵化池的孵化筐内,整个期间孵化过程采用TidbiTV2T型水温自动记录仪(美国OnsetHOBO公司生产,精度为0.001℃)记录水温,ProODO溶氧仪(YSI公司生产,精度为0.01mg/L)记录孵化水体溶解氧(每天4次)。 1.2.1样品采集与观察 每次采集样品8~10粒受精卵,自受精起0~12h内每隔0.5h取样1次,12~48h内每隔1h,48~84h内每隔2h,84~168h内每隔6h,168~240h内每隔12h,240h后到出膜期间每隔24h各采样一次。由于秦岭细鳞鲑的卵为沉性卵,无黏性,卵膜厚,卵径大,受精卵发育时间较长,直接观察比较困难,因此样品用体积分数为5%的甲醛溶液保存固定后剥膜观察。破膜后的仔稚鱼体质量用分析天平(型号JD2004;精度为0.0001g)称重,全长、体长用游标卡尺(精度为0.02mm)测量,每次测量5尾,受精卵在LEICA-Mz75(德国)解剖镜下剥膜重复观察记录并用LEICADFC300FX图像采集软件成像。 1.2.2孵化和养殖条件 孵化和养殖水源为山涧水和井水的混合水,其中山涧水的引水管道埋于地表下50cm左右,长度3km。孵化期间最低水温为9.31℃,最高水温为12.80℃,平均水温为11.3℃,DO范围为7.99~8.55mg/L;受精卵处于黑暗条件下;每天检查受精卵情况,并及时把死亡卵用吸管吸出,防止长水霉卵把坏卵与好卵连片导致局部受精卵缺氧死亡。仔鱼开口饵料为丰年虫(Artemiasalina),稚鱼长到20mm左右开始混合投喂剁碎的水蚯蚓(恩诺沙星浸泡灭菌)和鱼苗专用微粒子配合料No.2(山东升索渔用饲料研究中心,主要成分:粗蛋白质≥50%,粗脂肪≥8%,粗纤维≤3%,粗灰分≤16.5%),每天投喂3次(6:00、12:00和18:00),用聚维酮碘和食盐对养殖水体进行定期消毒。 1.3发育积温算法 胚胎发育特征的确定是以该批样品的50%以上的样本出现发育特征为标准,其中,各阶段积温(℃•d)的计算方法如下:各阶段积温K(℃•d)=N×T式中:N为各个阶段所需时间(d),T为该阶段的平均水温(℃)。 1.4数据处理与统计分析 采用MicrosoftExcel2003对所采集的实验数据进行整理和统计分析,结果用平均值±标准差(x±SD)表示,使用LEICADFC300FX图像采集软件和PhotoshopCS3处理图像。 2结果与分析 2.1秦岭细鳞鲑胚胎发育时序 秦岭细鳞鲑受精卵在9.31~12.80℃,(11.03±0.03)℃的水温条件下,整个胚胎发育过程历经408h,分为6个阶段26个时期(表1):受精卵阶段(2.5h),卵裂阶段(12.5h),囊胚阶段(34h),原肠胚阶段(70h),神经胚阶段(24h),器官形成至破膜阶段(264h)。 2.1.1受精卵 秦岭细鳞鲑的卵为端黄卵,成熟卵为圆球形,黄色(图版Ⅰ1),密度大于水,含大量的卵黄,未吸水时卵径为(3.81±0.06)mm,用生理盐水洗30s后卵径达到最大(4.25±0.05)mm,整个胚胎发育过程中卵径变化不明显。卵在吸水之后能清楚的看到卵黄与卵膜之间出现间隙,直至出膜一直保持这个状态。受精1h后,动物极的原生质开始聚集并逐渐隆起形成盘状胚盘即胚盘隆期起或是1细胞期(图版Ⅰ2),自此开始卵裂。 2.1.2卵裂阶段 秦岭细鳞鲑为盘状卵裂,受精后3.5h胚盘中部出现1条明显的分裂沟并逐渐加深,将胚盘分为2个近似相等大小的分裂球,第1次卵裂(经裂)标志着进入2细胞时期(图版Ⅰ3);在4.5h后出现与第1条分裂沟相垂直的分裂沟,将胚盘分成4个等大的细胞,此时进入4细胞期(图版Ⅰ4);5.5h后开始第3次卵裂,分裂沟与第1次平行,垂直与第2次,将胚盘分为8个相似的细胞,进入8细胞期(图版Ⅰ5);离受精7.5h时,胚胎发育进入16细胞期(图版Ⅰ6),形成具有4排16个细胞的胚盘,分裂球仍在一个平面上;受精10.5h后,分裂球进一步分裂,进入32细胞期(图版Ⅰ7);受精12h后形成具有64个细胞的胚盘,此时的细胞形状变小,进入64细胞期(图版Ⅰ8);随细胞的不断分裂,胚盘上隆起,细胞个数越来越多,分裂球也越来越小,而且大小不等,但界限还清楚,最后形成一个细胞团,此时进入多细胞期(图版Ⅰ9)。#p#分页标题#e# 2.1.3囊胚阶段 受精后16h,细胞继续分裂,细胞变得更小,细胞界限不清楚,有很多分裂球组成的囊胚层高举在卵黄囊上,胚盘的细胞堆积如帽,达到最高点,胚盘边缘与卵黄囊交界清晰,这个时期为囊胚早期(图版Ⅰ10);经过6h,囊胚层逐渐变矮、变平,分裂球已看不到界限,此期为囊胚中期(图版Ⅰ11);受精后43h,囊胚层继续下陷,变成扁状,囊胚层细胞向卵黄囊下包,约占整个胚胎的1/3,此时进入囊胚晚期(图版Ⅰ12)。 2.1.4原肠胚阶段 受精后50h,囊胚层细胞继续由四面向植物级下包,因受卵黄的阻碍,胚盘周缘形成一增厚的环带,即是胚环(germring),此时进入原肠早期(图版Ⅰ13);再过34h,胚环继续往植物极下包,并在胚环的一定部位(未来胚胎的后端),由于囊胚层细胞的集中和迁移而出现呈三角形的加厚结构,即为胚盾(embryonicshield),胚胎进入原肠中期(图版Ⅰ14);受精后96h,胚环下包到3/4,胚盾继续延伸,未被胚环包裹的卵黄之后形成“卵黄栓”,胚环则逐渐封闭形成胚孔,胚盾前部形成了稍稍膨大的脑泡原基,此时胚胎发育进入晚期原肠(图版Ⅰ15)。 2.1.5神经胚阶段 受精后120h,胚环逐渐变小并在胚体末端形成一个较大的圆形的胚孔(图版Ⅰ16),此时胚体成形,胚体前端比中末端较大,是之后脑部形成的地方;受精132h后,胚孔关闭,胚体前端呈柱状,神经板头端凸起,头部雏形出现,此期为胚孔关闭期(图版Ⅰ18)。 2.1.6器官形成到破膜阶段 受精后126h,胚体最前端的两侧呈一对肾形向左右略微突出,即为眼的原基(图版Ⅰ17);再过18h后,胚体前端开始分化为清晰的脑部的前、中、后三部分,进入脑部分化期(图版Ⅰ19);受精后162h,在胚体脑部后左右下方均出现两个小锥形盾状原点,即为胸鳍原基(图版Ⅰ20),再经过42h,胸鳍原基发育成能清晰可见的胸鳍雏形(图版Ⅰ22);受精后180h,胚体后端继续向后弯曲延伸,进入尾芽出现期(图版Ⅰ21);尾芽经过108h的发育,脱离了卵黄形成透明的鳍褶,进入尾鳍出现期(图版Ⅰ24),此时已经能看到胚体的心脏跳动[(69±2.1)次/min,n=5]和清晰的血管;受精后264h,眼原基已经发育到眼晶体阶段(图版Ⅰ23);受精后312h,眼囊中能清晰的看到黑色素,眼囊颜色逐步加深,此时为眼色素出现期(图版Ⅰ25),这个时期胚体摆动比较明显,卵膜逐渐变薄,为之后的破膜做好充分准备;受精后408h,第一批鱼苗破膜而出(图版Ⅰ26),经仔细观察发现,破膜的方式主要有2种,一是头部破膜而出,二是尾部破膜而出,经统计头部破膜而出高达95%,只是少部分是尾部破膜而出。刚出膜的仔鱼体色透明,肌节清楚,没有体色素,心率为(81.5±1.05)次/min(n=5)。出膜的仔鱼基本是先进行短时间的无方向的上下窜动后以静卧的方式躺在底部,此时卵黄囊还比较大,呈椭圆形。在出膜过程中发现有个别头部出膜到一半就死亡,或是出现弯曲状或是其他形状的畸形个体。 2.2秦岭细鳞鲑仔、稚鱼发育 由于鲑科鱼类对于仔稚鱼的分期尚无明确定论,因此本研究中将出膜至开始上浮阶段定为仔鱼期,将上浮阶段开始到幼鲑斑形成完毕定义为稚鱼期。秦岭细鳞鲑受精卵在9.31~12.80℃[(11.03±0.03)℃]的水温条件下历经408h出膜,刚出膜的仔鱼(图版ⅡA)体长(9.64±1.03)mm,体质量(0.0229±0.002)g,肛突明显,肌节清楚,卵黄囊血管分布密集,血色素明显,口已开启,胸鳍已经展开,尾鳍出现,背鳍雏形出现,脂鳍还未出现;第3天的仔鱼(图版ⅡB)体质量(0.0274±0.002)g,体长(11.21±1.11)mm,背鳍出现,臀鳍、腹鳍出现雏形,体表出现了少量的黑色素点(图版ⅡC);第5天的仔鱼(图版ⅡD)腹鳍和臀鳍界限分开明显,体表出现大量的黑色素点(图版ⅡE),第7天的仔鱼(图版ⅡF)体质量(0.0295±0.002)g,体长(14.21±1.59)mm,卵黄囊变小,背鳍,腹鳍和臀鳍基本成形,脂鳍雏形出现,部分仔鱼已上浮;出膜第12天的仔鱼(图版ⅡG)卵黄囊开始消失,开始由内源性转向外源性营养,以摄食外来饵料为主,直至卵黄囊全部消失,同时体表的黑色素逐步加深,各鳍条出现;第46天鱼体出现幼鲑斑(图版ⅡH),体形已经达到幼鱼阶段。 2.3秦岭细鳞鲑胚胎发育时间 秦岭细鳞鲑受精卵在9.31~12.80℃条件下历经408h孵出,总共所需要的积温为193.35℃•d,其中器官形成期到出膜期历时最长(122.74℃•d),占总时间的63.48%;其次依次为原肠期阶段(30.26℃•d),占15.65%;囊胚阶段(16.13℃•d),占8.34%;神经胚阶段(10.84℃•d),占5.61%;卵裂期阶段为(6.28℃•d),占3.25%;受精卵阶段最短(1.28℃•d),仅占0.66%。 3讨论 3.1秦岭细鳞鲑繁殖习性及胚胎发育特征 秦岭细鳞鲑是陆封型洄游鱼类,属典型的冷水性鱼类,需要在较低的水温环境下进行繁殖,每年春、夏季(36月)自主河道下游游至含有沙砾底质的上游主河道或是支流进行繁殖,911月自上游洄游到主河道的下游(含深潭或石缝)进行越冬[6]。秦岭细鳞鲑受精卵在9.31~12.80℃条件下历经408h出膜,所需的总积温为193.35℃•d,这比尖吻哲罗鲑(♀)(Huchotaimen)与细鳞鱼(♂)(Brachymystaxlenok)杂交种[7]、哲罗鱼[8]、高白鲑(Coregonuspeleol)[9]、西藏亚东鲑(Salmotrutta-farioL.)[10]和虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[11]等鲑科鱼类的孵化总积温要小,与尖吻细鳞鲑[12]相近(表2),可能是秦岭细鳞鲑孵化水温比较高,因此所需总热量就相对偏低,这体现了不同种的卵发育所需的总热量是不一样的。秦岭细鳞鲑卵裂方式和胚胎发育时序与绝大多数硬骨鱼类相似,大体分为卵裂胚体形成器官形成出膜这4个阶段[13]。本研究参照鲑形目鱼类中虹鳟、西藏亚东鲑、哲罗鱼和尖吻细鳞鲑的划分将秦岭细鳞鲑的胚胎发育分为6个阶段和26个时期,除此之外也有该物种本身的特殊性:①秦岭细鳞鲑在春季繁殖,胚胎发育不同步,致使出膜时间不一致。本研究中出膜时间跨度为5~7d,且秦岭细鳞鲑具有种间相残的现象,因此应及时将不同规格的仔稚鱼分池培育。②秦岭细鳞鲑卵为沉性的端黄卵,卵直径为3.81~4.25mm,较大马哈鱼(Oncorhynchusketa)[14](8~9.5mm)和大西洋鲑[15](SalmonsalarL.)(5.5~6.0mm)的小,且卵黄量大,胚盘较小,卵膜比较厚,需要剥膜观察,发育时间较长。③秦岭细鳞鲑卵黄囊含有大量的油球(中性脂肪),是一种营养物质。油球一般只存在于海产硬骨鱼类卵,如大西洋鲑[15],而在少数的淡水鱼类如哲罗鱼、花鲈(Lateolabraxjaponicus)、虹鳟、太湖短吻银鱼(NeosalanxtangkahkeiitaihuensisChert)、西藏亚东鲑等卵黄囊表面均有油球分布。④与同属鲑科的虹鳟、西藏亚东鲑、哲罗鱼等物种类似,秦岭细鳞鲑在胚孔关闭之前已经形成眼原基,这与银(Squalidusargentatus)[16]、宽口光唇鱼(Acro-ssocheilusmonticola)[17]、胡子鲇(ClariasfuscusLacepede)[18]、裂腹鱼(Sehizothorax)[19]、泰山赤鳞鱼(Scqphecthesmacrolepis)[20]等的眼原基都形成于胚孔关闭后不同。⑤秦岭细鳞鲑很多器官在胚胎发育中已经形成,胸鳍、尾鳍原基在脑部分化之前已经出现,背鳍、脂鳍等其他鳍均在胚后形成,眼色素也是在胚胎发育过程中完成,这与尖吻细鳞鲑[12]、哲罗鱼[8]和大西洋鲑[15,2122]类似。⑥秦岭细鳞鲑胚胎发育过程中胚环的形成是发生在原肠期阶段,而哲罗鱼(♀)与细鳞鱼(♂)杂交种[7]、哲罗鱼[8]和尖吻细鳞鲑[12]的胚环是在囊胚晚期形成的,两者不一致。本研究与楼允东的组织胚胎学[23]、尤永隆的发育生物学[2122]和大马哈鱼[14]符合。作者对哲罗鱼(♀)与细鳞鱼(♂)杂交种[7]、哲罗鱼[8]和尖吻细鳞鲑[12]中胚环出现的划分方法持有不同的观点。#p#分页标题#e# 3.2影响胚胎发育和仔稚鱼生长的因素 3.2.1胚胎发育影响因素 受精卵的第一次卵裂标志着胚胎发育的开始,在整个发育过程中,卵的发育速率和出膜率受外界因子影响较大,主要因子有水温、溶氧、光照、水质以及敌害生物等[13]。鱼类的胚胎发育都需要一个适合的水温范围,如红大麻哈鱼的低温和高温温度忍受范围分别在40~42.5°F和55~57.5°F[24],如果超过或是低于这个范围,胚胎发育将停滞、异常或死亡。在合适的水温范围内,卵的发育时间与温度呈正相关,虹鳟在3℃条件下孵化历时100d以上,而在17℃时不到17d即可出膜[25]。秦岭细鳞鲑在平均水温11.03℃条件历经408h出膜,时间远远低于平均温度较低的哲罗鱼[8](7.5℃/839h)、西藏亚东鲑[10](4.3℃/2196h)、尖吻细鳞鲑[12](7.7℃/597h)。日本大头鳕(GadusmacrocephalusTilesius)受精卵的发育速率、孵化率、初孵仔鱼存活率和形态特征在一定温度范围内受水温变化影响显著,发育速率与孵化速率呈正相关[26]。本研究中由于条件限制水温较自然产卵场的水温要高,这也可能是导致受精卵出膜时间短,出膜过程中出现死亡或是畸形苗的原因之一。2010年在10.35℃的平均温度下从孵化到出膜所需积温为197℃•d,经推算得出在自然河道6~11℃的水温变化下需要经过29~35d孵化出膜[27],这反应了水体温度与孵化速率、出膜时间的关系,因此可以推断人工繁殖的最高水温不要超过14℃,最适宜水温应控制在6~10℃。鱼卵发育对DO水平的要求随种类、卵的类型及其特点而不同,鱼卵所需氧气是通过扩散得到的,受精卵在不同阶段对DO水平的要求也不一样,如鲱(ClupeaharengusL.)、中华鲟(Acipensersinensis)的卵在发育初期要求较低,而后逐渐递增,在孵化前期即胚体开始扭动至出膜时期达到最高峰[2829],DO水平在大西洋鲑的胚胎发育后期的肌肉发育中具有重要作用[30],秦岭细鳞鲑的孵化水体DO需求在6.00~8.55mg/L。如果低于这个水平将会导致发育迟缓、坏死或是出膜幼苗畸形,在正常水平范围内孵化出正常胚胎与溶氧的水平呈正比。通常在一定范围内,耗氧量的多少与水温的高低成正比,中华鲟胚胎耗氧量的需求量实验验证了这个观点[29]。因此适合的水体DO水平是保证秦岭细鳞鲑胚胎正常发育的前提之一。孵化水体的水质也是保证胚胎正常发育的一个重要条件。本研究中孵化水体采用的是山涧引水和井水混合水体,雨天的山涧水体(持续大雨)通常比较浑浊,这样可能会导致水体中各种病原菌或是其他能感染受精卵的微生物数量增加,细菌长在卵膜外部会使卵膜牢固下降,出现坏死区,增加耗氧量,从而严重影响了胚胎的正常发育。在鱼卵孵化过程中,一旦胚胎发育停止或是死亡,可能极易感染水霉病[31]。在具体生产中作者采用了定时用食盐泼洒进行最大可能预防水霉病的发生。 3.2.2仔稚鱼生长影响因素 秦岭细鳞鲑刚出膜的仔鱼体长(9.64±1.03)mm,体质量(0.0229±0.0020)g。此时的仔鱼营养完全依靠卵黄提供,属于内源性营养阶段,该阶段最大影响因子是温度和水质等,需要有稳定的温度和良好的水质。当达到临界期(内源性营养转外源性营养)时,是由饵料保障和仔鱼器官发育的共同作用的一个危险期[32],鱼类的初次摄食时间主要与种类、卵黄囊消失时间、消化器官的发育、水体水温和开口饵料的选择等有关[33],鱼类仔鱼的开口摄食率通常很低,在10%~50%[3435],这也是野外环境下,稚鱼和幼鱼的死亡率远远低于仔鱼的原因[36]。仔鱼初次摄食成功的最主要决定因子有饵料的大小、质量和密度,其次初次摄食的仔鱼都需要伴以视觉、摄食、消化、运动等器官功能的形成。秦岭细鳞鲑初孵仔鱼就已经开口,到第3天口咽腔已经逐步发育,出膜到第12天阶段称为卵黄囊期仔鱼(yolk-saclarvae),以卵黄囊作为营养源。12d卵黄囊逐步消失,开始进食,这与尖吻细鳞鲑的主动摄食时间相近[12]。鱼类仔鱼度过危险期成功进入外源性营养,在良好的水体环境中,温度、密度和饵料的选择则是影响仔稚鱼生长的主要因素。高白鲑仔稚鱼摄食强度随温度变化很大,在适合温度范围内仔稚鱼的摄食强度都随着水温的变高而增强[37]。大西洋鲑在水温8℃以上出膜到初次摄食的时间与褐鳟(Salmotrutta)、红点鲑(Salvelinusmalma)的时间一致,但水温降到8℃以下大西洋鲑比褐鳟、红点鲑需要等多的时间达到初次摄食阶段,该结果与这3种鱼的最适合水温范围以及地理分布相一致[38]。目前关于秦岭细鳞鲑摄食强度与温度的关系还没有报道,有待更进一步的研究,以为苗种驯化提供基础资料。饵料种类及大小的选择关系到仔稚鱼食物喜好性选择,楼宝等对赤点石斑鱼(Epinephelusakaara)稚幼鱼采用不同的生物饵料投喂得出桡足类的投喂效果最佳,存活率最高[39]。据饲养观察,秦岭细鳞鲑开口饵料丰年虫效果较好,仔鱼摄食活动强烈,等仔稚鱼长到20mm左右,开始投喂剁碎的水蚯蚓,摄食强度也很好,若换成了饲料,则摄食强度变差,这可能是因为野生秦岭细鳞鲑偏好在水中晃动的活饵料,因此在人工驯化的时候先需要活饵料和饲料的混合再逐步用饲料替代活饵料,以达到人工驯化的目的。 3.3胚胎发育过程中注意的问题 2010年春季在长江水产研究所、陕西省水产研究所和陕西陇县秦岭细鳞鲑部级自然保护区三方合作首次取得了人工繁殖和幼鱼培育的成功,但仍需要注意以下问题:(1)根据2010年、2011年两年的经验,建议孵化水温控制在6~10℃,本次孵化水温偏高,出膜时间较短,导致受精卵出膜过程中死亡或是出现畸形仔鱼(主要是身体弯曲)。(2)溶氧要控制在6mg/L以上,确保在胚胎发育过程中因缺氧而坏死从而导致水霉病发生,最后形成坏死区域,水体的流速要适中,水流小了会导致受精卵表面氧气交换量不足导致缺氧,水流过大会导致对受精卵的冲击力较大影响正常的胚胎发育,特别是在敏感阶段(囊胚期到原肠期到神经胚阶段)。(3)要做到日常的定时消毒工作,及时用自制符合大小的吸管吸出死卵,防止死卵感染水霉,连成坏死区,吸卵时动作要非常轻,避免碰到好卵影响发育,整个孵化过程中受精卵要避免光照。(4)由于秦岭细鳞鲑出膜时间不一致,先出膜的仔鱼生长时间长,个体较后出膜的仔鱼大,会出现大吃小和相互残杀的现象,因此需要及时将规格差别大的仔稚鱼分开驯养,提高种苗的存活率。 #p#分页标题#e#