多壁碳纳米管(MWCNT)是最为常用的一种人造纳米材料，它所具有的特殊物理化学性质，使其在纳米材料领域占据着重要地位。例如，出色的机械性能和机电性质使得它成为各种增强复合材料和智能材料的研究热点［1-3］;极小的尺寸和高度对称的结构赋予了它显著的量子效应和电磁学性质;特殊的表面结构和孔结构让它在吸附作用方面受到青睐，此外它还是光学和热学领域研究的热点［4］。然而，碳纳米管的这些独特理化性质也使得它具有特殊的生物效应。在进入生命体和环境以后，它们与生命体相互作用所产生的化学特性和生物活性与化学成分相同的常规物质有很大不同［5-7］。碳纳米管可能产生新的污染，已成为世界各国政府和公众关注的新焦点。 目前已有研究报道碳纳米材料对微生物的毒性。Kang及其合作者研究发现［8］，碳纳米管直接与细菌接触，可导致细胞膜损伤，细胞代谢能力下降并引起核酸外泄。另一项研究表明［4］，单壁碳纳米管(SWCNT)对革兰氏阴性的埃希菌属、假单胞菌属以及革兰氏阳性的枯草芽孢杆菌和葡萄球菌均能产生较大的细菌毒性，使细菌失活。而多壁碳纳米管对不同菌属细菌的毒性差异很大，总体毒性中等。这些研究的对象多为单一细菌，关于复杂的土壤生态环境中微生物的研究较少［9］。目前国际上仅有两篇文章报道了碳纳米材料对土壤微生物的生态毒理效应。Tong等通过测定土壤有机质、土壤呼吸作用、碳的矿化作用、氮循环和酶活性指标，发现富勒烯(nC60)对土壤微生物群落结构、功能和生物作用具有微弱影响［10］。Johasen及其合作者报道，在实验条件下，富勒烯(nC60)对土壤的呼吸和微生物量没有影响，但对快速生长的细菌具有抑制作用［11］。碳纳米管对土壤微生物的影响，目前还缺乏认识。 土壤是陆地生态系统的主要组成部分，是珍贵的自然资源。土壤微生物是土壤中的活性组分，在维持土壤生态平衡如养分运转、有机质分解和环境污染物净化中发挥着重要作用［12］。为进一步揭示碳钠米管的生态毒理效应，本研究以多壁碳纳米管为研究对象，从生化作用、酶活性、微生物数量和群落结构等方面系统地评估了它对土壤微生物的影响，为碳钠米管的环境风险提供理论依据。 1材料和方法(Materialsandmethods) 1.1仪器与试剂 仪器:7500FastReal-TimePCRSystem实时荧光定量PCR仪(AppliedBiosystems公司，美国)，TL-25/H基因扩增仪(BIOER公司，日本)，TanonEPS300电泳仪(上海天能科技有限公司)，HE120电泳槽(Tanon公司)，547R型台式离心机(Eppendorf公司)，IngenyPho-rU突变分析系统(Ingeny公司，荷兰)，透射电子显微镜(TecnaiF30，FEI公司，美国)和热重分析仪(OQ50V20.6Build31，ThermalAnalysis公司，美国)。 试剂:多壁碳纳米管(S-MWCNT-1020)购自深圳市纳米港有限公司，外径10～20nm，长度1～2μm，纯度(重量百分比)95%～98%，无定型碳2%，灰分≤0.2wt%，比表面积40～300m2•g－1。图1和图2分别显示了多壁碳纳米管的热重分析(TGA)和透射电子显微镜(TEM)分析结果。结果分析表明，多壁碳纳米管的纯度达到95%以上，平均管径约为14nm，平均长度为1～2μm，与产品标注的性质相符。 1.2实验材料 土壤样品采自北京大学未名湖岸边山坡地，用镊子去除土壤中的草根及其他杂物，过2.5mm筛，筛过的土壤在室温条件下留待使用。实验用土壤pH为6.2，水解氮和速效磷的含量分别为67.4和20.2mg•kg－1，总有机碳含量为1.38%，含水量为4.86%。为避免水份挥发造成的误差，实验期间定期补水使土壤的含水率控制为5%左右，环境条件能够保证土壤微生物的正常生命活动。 1.3实验设置 设置两组实验，分别为碳纳米管组和对照组。对于碳纳米管组，按1mg碳纳米管•g－1土的浓度将多壁碳纳米管与土样均匀混合，具体做法如下:将实验用土置于有盖大塑料盒内，在磁子搅拌的同时，从盒子上部的两端通过插入的玻璃管用氮气少量多次吹入所需量的多壁碳纳米管，进行混匀。将混合均匀的含碳纳米管的土样分装至18个250mL锥形瓶，每个瓶内约140g土样。对照组中仅有土样，无碳纳米管。以28d为测定周期，每个周期分别从碳纳米管组和对照组取3个锥形瓶中的土样测定所研究的各项指标(即做3个平行样)。实验期间通过定期加水，控制土壤的含水率在5%左右。 1.4分析方法 1.4.1多壁碳纳米管的性质测定 多壁碳纳米管的纯度用热重分析法(TGA)测定，测定条件为:氮气(N2)下以10℃•min－1速率升温(室温至950℃);表面特性采用透射电子显微镜(TEM)分析测定。 1.4.2土壤理化性质和酶活性的测定 土壤呼吸作用的测定(密闭静置培养法)，土壤氨化作用的测定(土壤培养法)，土壤脱氢酶活性的测定(氯化三苯基四氮唑法)和土壤荧光素二乙酸酯酶活性的测定均参考文献［13］进行。 1.4.3土壤微生物量的测定 采用最可然数(MPN)和适时定量聚合酶链反应(RT-PCR)两种方法对土壤微生物进行测定。MPN法按照美国FDA细菌学分析手册进行［14］，土壤稀释倍数为10～108倍，每个浓度做3个平行，在LB培养基中培养2d后，在600nm波长下测定其浊度。土壤细菌总DNA的提取采用FastDNASpinKitforSoil试剂盒(Qbiogene，美国)，提取过程按照试剂盒产品说明书进行。采样针对细菌16SrDNA的通用引物341F(5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和518R(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)对样品中的细菌DNA进行扩增。PCR反应体系为20μL，包括10μL预混液(SYBR?qPCRMix)，0.2μL341F引物，0.2μL518R引物，0.4μL模板DNA，9.2μL无菌水。PCR扩增程序如下:95℃预热20s;循环:变性94℃3s，延伸60℃30s，循环数40。用含有细菌16SrDNA的质粒作标准样品，其浓度范围为0.08～50μg•mL－1，根据样品反应的Ct值，通过标线计算出样品中细菌16SrDNA的浓度。#p#分页标题#e# 1.4.4土壤群落结构的分析 采用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)法测定土壤细菌的群落结构。用带GC夹的细菌16SrDNA通用引物GC341-357F(5’-CGC-CCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGC-CCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和518R(5’-AT-TACCGCGGCTGCTGG-3’)对样品中的细菌DNA进行扩增，采用降落PCR法。PCR反应体系为50μL，包括25μL预混液(PremixTaqTMVersion2.0)，0.5μLGC341-357F引物，0.5μL518R引物，1μL模板DNA，23μL无菌水。PCR扩增程序如下:94℃预热5min;循环1:变性94℃1min，杂交65℃1min(每个循环降0.5℃)，延伸72℃1min，循环数20;循环2:变性94℃1min，杂交55℃1min，延伸72℃1min，循环数10，最后1次循环延伸72℃10min，然后4℃保存。升温程序设置为2℃•s－1，降温程序设置为－1.5℃•s－1，热盖。对样品DNA扩增产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)，仪器采用IngenyPhorU突变分析系统。以聚丙烯酰胺为变性剂，梯度为40%～80%，取PCR产物40μL，加入8μLDGGE上样缓冲液，混匀后进样，100V电压预电泳5min后，以70V恒压、60℃恒温，电泳16h以上。电泳结束后，将胶体浸入3LEB染液中，避光染色45min，换至清水中避光脱色20min后于凝胶成像系统观察。所得图像利用QuantityOne4.62进行分析，包括泳道/条带识别和相似性分析。 1.5数据处理 用Excel2007软件记录数据和制作图表，采用成对数据t检验方法比较不同组的数据差异。用Spss18统计软件对数据进行处理。 2结果(Results) 2.1多壁碳纳米管对土壤微生物生化作用的影响 2.1.1呼吸作用 土壤呼吸作用是衡量土壤中微生物活性的重要指标。在为期近5个月的实验中，测定了不同时段碳纳米管组和对照组中土壤微生物的呼吸作用，结果如图3所示。实验初期碳纳米管组的微生物呼吸作用略受抑制，随后基本与对照组相近，且随时间变化不大。为排除系统误差的影响，以对照组为基准，作出碳纳米管组与对照组的呼吸强度比值(文中定义为呼吸作用相对强度值)随时间的变化曲线。从图中可以看出，实验初期碳纳米管组的呼吸作用受到抑制，随后逐渐恢复(2个月后与对照组基本 2.1.2氨化作用 土壤氨化作用是生物界氮素环境的重要环节，对植物的生长具有重要意义。图4显示碳纳米管组和对照组中土壤的氨化作用。实验前2个月内，碳纳米管组中土壤的氨化作用明显强于对照组，随后两组之间的相对大小逐渐发生变化，实验3个月后，碳纳米管组中土壤的氨化作用低于对照组。从相对氨化作用强度(碳纳米管组与对照组的氨化作用强度比值)看，实验初期碳纳米管增强了土壤的氨化作用，但后期土壤的氨化作用减弱。 2.2多壁碳纳米管对土壤微生物酶的影响 2.2.1脱氢酶活性 土壤酶是参与土壤新陈代谢的重要物质，其中氧化还原酶系在土壤的物质和能量转化中占有很重要的地位。脱氢酶属于氧化还原酶系，它能从一些基质中析出氢而进行氧化作用。本研究中，碳纳米管组和对照组中土壤的脱氢酶活性变化见图5。实验后第28天、112天和140天，碳纳米管组中测得的脱氢酶活性均明显低于对照组;但在第0天和84天，碳纳米管组中的活性略高于对照组。从相对脱氢酶活性(碳纳米管组与对照组的脱氢酶活性比值)看，实验初期碳纳米管抑制了土壤的脱氢酶活性，中期土壤的脱氢酶活性逐渐复原，后期土壤的脱氢酶活性又逐渐减弱。 2.2.2荧光素二乙酸酯酶活性 土壤中广泛存在荧光素二乙酸(主要来源于土壤微生物细胞及部分植物残体)，它可被土壤中许多酶，如蛋白酶、脂肪酶和酯酶等水解，发生酶促反应。因此，有学者提出用荧光素二乙酸酯酶活性来评价土壤微生物的总体活性［13］。本研究中，碳纳米管组和对照组中土壤的荧光素二乙酸酯酶活性变化见图6。整个实验期间，碳纳米管组中的荧光素二乙酸酯酶活性均低于对照组。从相对荧光素二乙酸酯酶活性(碳纳米管组与对照组的荧光素二乙酸酯酶活性比值)看，实验初期有些波动，随后逐渐减弱。 2.3多壁碳纳米管对土壤微生物量的影响 研究采用两种方法分析土壤的微生物量，即基因分析法(定量荧光PCR)和最可然数法(MPN)。图7显示了基因分析法测定的微生物量结果(图中纵坐标采用对数坐标，因此仅做出正误差线)。实验初期，碳纳米管组和对照组的微生物量基本持平;第56天，碳纳米管组的微生物量明显高于对照组;第84和112天，碳纳米管组的微生物量明显低于对照组(由于实验操作的失误，没有获得第140天的微生物量数据)。MPN法测定的微生物量结果与定量荧光PCR法基本一致。土壤微生物量的分析是1次进行的，即实验期间，每次取样时冷冻保存一部分土壤，实验结束后，对所有土壤样品中的基因进行提取和分析。因此，没有计算和分析相对微生物量。 2.4多壁碳纳米管对土壤微生物群落结构的影响 研究采用PCR-DGGE方法分析土壤的微生物群落结构。图8为实验第0天至第140天12个样本的DGGE图谱。其中N表示碳纳米管组，C表示对照组，0、28、56、84、112和140表示实验的天数。为了更清楚地对条带进行分析，使用QuantityOne软件包，以样品N0为标准做出了12个样品的泳道识别图，见图9。泳道中的条带粗细不一，对应其在DGGE胶上的密度大小不同。密度大，则条带比较粗黑;密度小，则条带比较细。图9中显示了15条最明显的条带，其中条带5、9和15在每个样品中均有出现，条带1、3、7和10也出现在10个以上的样本中，条带1、2和10在大多数泳道中都比较粗。根据条带对比的结果，利用戴斯系数Cs(Dicecoefficient)计算出各样品的相似性，所得相似度最大的两组为实验开始和第56天的样品(N0和C0、N56和C56的相似度分别为74.9%、79.7%)，其他时间两组的微生物群落结构相似度较低(N28和C28、N84和C84、N112和C112、N140和C140的相似度分别为42.4%、55.6%、42.5%和41.3%)。#p#分页标题#e# 3讨论(Discussion) 3.1实验土壤的影响 本研究土壤中多壁碳纳米管的浓度参照文献设定为1mg•g－1新鲜土［10］。多壁碳纳米管的水溶解度很低，必须使用其他溶剂才能制成均匀溶液。例如，文献中报道用四氢呋喃做溶剂可得到多壁碳纳米管的均匀悬浊液，但悬浊液中的四氢呋喃本身对生物也具有一定的毒性［15］。为排除溶剂对土壤微生物的影响，本研究中不使用任何溶剂，而是直接将多壁碳纳米管颗粒混入土壤。为使实验土壤尽量均匀，将过2.5mm目筛的实验用土分次置于有盖大塑料盒内，用磁子连续搅拌土样，同时从盒子上部两侧通过插入的玻璃管用氮气分次吹入所需量的多壁碳纳米管，然后将混有多壁碳纳米管的土壤放入有盖的圆筒内进行混匀，再将混匀的土样进行分装。尽管如此，由于土壤本身的不均匀性以及固相混合难均匀的特点，每个锥形瓶内的土样会有所区别，有可能导致实验测定波动较大，在一定程度上会影响对实验结果的判断。但是，综合各项指标，实验结果还是表现了一定的规律性。 3.2多壁碳纳米管对土壤微生物的生态毒理效应 本研究选择呼吸作用、氨化作用、脱氢酶、荧光素二乙酸酯酶、微生物数量和微生物基因多样性为指标，从生化作用、酶活性、微生物量和群落结构4个方面反映多壁碳纳米管对土壤微生物的毒性。结果显示，在相同处理条件下，不同指标呈现不同的变化。其中，氨化作用和脱氢酶的变化规律有些相似，即暴露于多壁碳纳米管后，初期微生物的氨化作用和脱氢作用略有增强。郭桂悦等［16］发现纳米炭黑能促进腈纶废水生化处理过程中氨化菌的生长，从而提高生物脱氮的效果，其原因可能是腈纶废水中含有难降解的有机物等，这些物质会阻碍氨化作用的进行，而投加炭黑后一部分难降解有机物会被吸附，使氨化反应得以顺利进行，促进微生物中氨化菌的生长。土壤中可能含有与腈纶废水中类似的阻碍微生物氨化作用的物质，而多壁碳纳米管的加入可能吸附了这些物质，从而使氨化作用增强;后期氨化作用的减弱则可能是土壤中营养物质的消耗或某些有毒降解产物的积累引起的。另外，土壤中可能存在某些可以降解多壁碳纳米管的微生物，因而实验初期脱氢酶活性增强，后期因营养缺乏或中间有毒产物的积累，脱氢酶活性又逐渐降低。荧光素二乙酸酶通常被用来评价土壤微生物的总体活性。本实验中，碳纳米管处理组中荧光素二乙酸酶活性在整个实验期间均低于对照组，表明总体上碳纳米管对土壤微生物的总酶(主要是水解酶)有一定的抑制作用。有研究发现［18］，在一定剂量下多壁碳纳米管诱导了明显的细胞凋亡，包括细胞核变性、核基质减少，染色质浓缩，出现月牙样边集，细胞浆中出现空泡等现象。Sayes等［19］进一步指出，碳纳米材料的毒性效应可能是由于产生氧化胁迫或自由基，造成脂质过氧化损伤和膜结构破坏，细胞正常功能丧失，引起细胞的死亡或凋亡［20-21］。因此，本实验中的碳纳米管很可能对部分土壤微生物细胞产生了类似的作用，但由于各项生化指标的灵敏度不同，所以实验结果的显著程度也不同。 MPN法和定量荧光PCR测定微生物量的结果基本一致:除第56天碳纳米管组微生物量高于对照组外，其余几个时间点碳纳米管组微生物量均低于对照组。第56天碳纳米管组微生物量的增加可能与实验初期土壤中某些菌(如氨化菌)的增加有关。MPN法操作相对复杂繁琐，且实验结果的准确性需要严格无菌操作保证，因此实验过程中引入随机误差的可能性较大［22-23］，与荧光定量PCR法相比误差较大，使得两组的差值波动较大。DGGE图谱的分析结果表明，实验开始和第56天时，碳纳米管组和对照组群落结构的相似度较大，但在其他时间相似度较小。土壤中的优势菌(如图9中的条带1、3、5、7、9、10、15)在各组中的含量均较高，说明多壁碳纳米管对这些优势菌种没有影响或影响很小，某些甚至可能利用多壁碳纳米管进行代谢。Allen等［17］研究表明，碳纳米管能被山葵过氧化酶(horseradishperoxidase，HRP)催化进行生物降解。HRP会与过氧化氢形成一个活性很高的中间体，然后在蛋白质的作用下进一步转化为另一种化合物，而位于HRP催化位点处的碳纳米管将会被这种化合物降解。研究者推测，这很可能是自然界降解碳纳米管的一种途径，其他过氧化酶(如myeloperoxidase，MPO)也许对碳纳米管的氧化降解同样有效。Kagan等进一步研究发现［24］，人体嗜中性白细胞髓过氧化物酶(hMPO)产生的活性自由基中间产物和次氯酸盐可以催化碳纳米管的生物降解，主要是通过hMPO的氨基酸与碳纳米管表面的羟基的相互作用实现的，这种作用也被Kam和他的同事在实验室所证实［25］。因此，土壤中很可能存在一些微生物所分泌出的能够降解碳纳米管的酶。 研究中采用成对数据t检验方法比较了碳钠米管组和对照组的相应测定指标数据差异，除荧光素二乙酸酯酶活性外(碳钠米管组在0.05水平上显著低于对照组)，其他指标在两组中在0.05水平上没有表现出明显的统计学意义上的差异。这可能与研究的时间跨度还不够长，测定存在波动，或者各项指标的反应灵敏度不同有关。 综上所述，我们认为土壤中不同微生物对多壁碳纳米管的响应不同，土壤微生物有些功能可能受到多壁碳纳米管的抑制，但有些功能却可能被增强。多壁碳纳米管的毒性效应是碳纳米管本身物理化学特性与微生物生物特性综合作用的结果。总体上，多壁碳纳米管对土壤微生物表现了一定的毒性，使土壤中的酶活性降低、生物量减少以及群落结构发生变化。