温带气温变化有节律性温变(包括季节温变和日温变)和非节律性温变(突发性极端温度变化)。对温暖湿润气候节律性气温变化的长期适应导致白三叶具有很强的适应性，耐热、耐寒、耐干旱，它不仅可在平地(草地)及房前屋后生长，也可在海拔2800m的高山地区安全越冬，保绿期长可达230d，成为优良的地被植物而被广泛应用于园林绿化和草坪建植，在发展园林绿化及园林生态建设上起重要作用(朱树声等，2003;罗镪等，2006;张鹤山等，2009)。然而，目前全球气温增高引起的暖冬导致的融冻型冻害已严重阻碍了越年生植物的越冬和返青生长，使作物减产和牧草产量下降，造成农业和畜牧业遭受巨大损失(Jonesetal．，2003)。那么，对节律性季节性温变具有良好适应能力的白三叶是否能适应未来暖冬引起的非节律性温变(冻融胁迫循环)呢?其适应的生理调控机理是什么呢?目前国内外尚未见报道。因此，揭示白三叶抗融冻胁迫的生理变化不仅可为未来作物抗冻育种提供理论依据，还可为白三叶生态园林管理维护和应用提供指导。 对植物季节性冷冻适应生理机理的研究发现，生长在高寒山区的多年生牧草在自然越冬过程中根中抗氧化酶活力增加(Zhouetal．2004;Guoetal．，2006)。随冬季气温下降常绿树木叶片和越冬草本植物叶片抗氧化酶活力和脯氨酸含量增加(Chenetal．，2006;赵梅等，2011)。在晚秋降温过程中冬小麦根含水量下降与抗冻性呈负相关(Yoshidetal．，1997)。在冬季冷适应和春季返青生长中冬小麦叶片中稳定蛋白质可溶性糖积累并与其抗冻性相关，其中抗冻性强的冬小麦品种能更有效地刺激积累这些保护物质(Guyetal．，1987，2003;Flecketal．，1999;Stupnikovaetal．，2002;Wenetal．，2010)。关于白三叶抗冻生理机理研究发现，随着温度由10℃降低到0℃，白三叶叶片电导率和MDA含量均呈升高趋势(范玉贞，2009a)。在－10℃，不同品种白三叶叶片MDA积累较快(安莹等，2009)。 在温度由20℃逐渐下降到0℃的过程中，白三叶叶片SOD和POD活性急剧增加(安莹等，2009;范玉贞，2009b)。同时随着气温下降至冰点白三叶叶片中可溶性糖和脯氨酸含量急剧上升(Kirstietal．，1993;Guinchardetal．，1997;安莹等，2009)。研究指出，冷冻低温条件下，白三叶叶片抗氧化酶系统在清除活性氧自由基，防止膜脂过氧化维持膜完整性上起重要作用(安莹等，2009;范玉贞，2009b)。但目前大多研究了植物抗氧化酶活力和渗透调节物在植物适应节律性降温和人工模拟降温过程中的作用。而对融冻胁迫循环下细胞膜在抵抗反复伸缩作用过程中是否也包含了抗氧化酶的保护和渗透调节物渗透调解作用?目前这方面报道较少。红三叶因花为红色，是很好的观赏植物。但由于其耐寒、耐热和耐旱能力都比白三叶差，只能在更温和湿润的地区种植(朱树声等，2003;张鹤山等，2009)。本文以抗冷性强的白三叶和抗冷性弱的红三叶为对象，通过分析在人工模拟冻融胁迫过程中白三叶和红三叶叶片抗逆生理指标的变化和冻融胁迫后恢复生长的能力，了解它们对非节律性人工融冻胁迫的响应机制和差异，以期了解白三叶和红三叶对温度适应的生态幅，以及它们在应对环境变迁的潜在适应能力。 1材料与方法 1.1实验材料的培养 供试白三叶和红三叶由中国农业科学院畜牧研究所提供。试验于2010年4—12月在鲁东大学生物院和实验室进行。实验材料的培养:在2010年4月初将取自土壤表层的土壤过筛、混均等量分装到直径为19cm的花盆中，挑选饱满粒大的种子播种，每个品种30盆。所有花盆放置在校生物院试验地中挖的15cm深的坑中，用土填充盆间缝隙。播种初期人工定时浇水，待幼苗定植，减少浇水量和次数。盆栽白三叶和红三叶完全在自然条件下生长。 1.2试验处理和取样 在2010年12月份，从盆栽白三叶、红三叶中分别挑选出生长均匀一致的20盆作为实验材料。在处理前一天将实验材料从室外搬回到实验室(15℃)过夜，同时剔除黄叶和枯萎叶。第二天早晨开始融冻-冻融处理。融冻胁迫处理为每2h降温5℃，同样冻融胁迫处理为每2h升温5℃。设置的温度梯度为10、5、0、－5、－10、－5、0、5、10℃。每隔2h取样一次，每次从各盆中随机用剪刀剪取植株中上部叶片，混匀后用锡箔纸包裹放入液氮中固定，然后放于－80℃的超低温冰箱中，用于抗氧化物酶、渗透调节物质和丙二醛的测定，同时取部分新鲜材料用于细胞膜透性和相对含水量测定。用测定平均值作图表。整个实验重复2次。 1.3实验方法 1.3.1细胞膜透性和叶片相对含水量的测定 采用电导率法测定细胞膜透性(Luttsetal．，1996);根据张治安和陈展宇(2008)等方法测定叶片相对含水量。 1.3.2酶液制备 酶的提取是在4℃条件下进行。从液氮固定的材料中随机称取一定量的样叶于预冷研钵中，加入酶提取液(磷酸缓冲液，pH=7.8)，冰浴上研磨成匀浆，在15000r•min－14℃条件下离心15min，上清液用于MDA、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白质含量、抗氧化酶活力的测定。每个处理的酶液提取重复2次。 1.3.3生理指标测定 采用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化还原法测定SOD活性(Sundaretal．，2004);采用过氧化氢碘量法测定CAT活性(Drazk-iewiczetal．，2004);采用张志良和瞿伟菁(2003)愈创木酚法测定POD活性、硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定丙二醛(MDA)含量、茚三酮法测定游离脯氨酸;采用张治安和陈展宇(2008)蒽酮比色法测定可溶性糖含量、用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量。每个指标做5次重复。 1.4数据处理 数据均采用MicrosoftExcel2003整理完成，并用SPSS11.5软件对试验数据进行差异显著性分析。 2结果与分析 2.1人工融冻循环中叶片形态变化及叶片恢复生长力比较#p#分页标题#e# 温度从10℃降低到－10℃为融冻胁迫处理，温度由－10℃上升到10℃为冻融胁迫处理。研究发现，温度降至0℃，叶片微有冻结，下降到－5℃时，叶片完全冻结变脆，随着温度上升叶片解冻，叶片变蔫。经历融冻胁迫循环两星期后，白三叶植株下部老叶死亡，部分变蔫的幼叶叶片恢复正常，同时又长出一些新叶，恢复生长很好。但红三叶经历融冻胁迫循环老叶枯死，没有新叶生出，植株死亡。白三叶抗融冻能力明显高于红三叶。 2.2人工融冻循环中叶片细胞膜相对透性和MDA含量的变化 融冻阶段温度从10℃降到－10℃，两种三叶草叶片结冻，叶片细胞膜相对透性呈上升趋势。冻融阶段温度从－10℃上升到10℃，两种三叶草叶片解冻，叶片细胞膜相对透性呈下降趋势(图1)。与融冻阶段相比，冻融阶段两种三叶草细胞膜透性增高1.8倍，二者差异明显(P＜0.05)。这说明经历融冻胁迫循环细胞膜在冰晶形成和融化的机械伸缩作用下增大，但两种三叶草细胞膜对这种机械伸缩作用反应存在差异。在冻融阶段，红三叶叶片平均细胞膜透性比白三叶高20%，表明在细胞冰晶融化体积缩小时白三叶细胞膜恢复能力要高于红三叶，白三叶细胞膜柔韧性和弹性比红三叶高。随温度的变化，两种三叶草叶片细胞内MDA含量与细胞膜透性的变化趋势相同，在融冻降温过程中增加，在冻融升温过程中下降(图1)。但在整个融冻和冻融处理过程中，白三叶叶片MDA含量均高于红三叶，白三叶叶片平均MDA含量比红三叶分别高1.6倍和1.2倍。该研究结果与范玉贞(2009a，2009b)和安莹等(2009)对白三叶抗寒性研究结果一致。 2.3人工融冻循环中白三叶和红三叶叶片可溶性 糖、可溶性蛋白质和脯氨酸含量的变化在融冻和冻融胁迫循环中，两种三叶草叶片脯氨酸含量变化不同(图2)。在融冻阶段，白三叶脯氨酸含量逐渐升高，在温度下降到－5℃，达到最大值(第一个峰值)，比叶片未结冰时(10℃)增高了3倍;在温度降至－10℃叶片脯氨酸含量较－5℃下降74%;在冻融阶段，叶片脯氨酸小幅增加(图2)。然而，在融冻和冻融胁迫过程中，红三叶叶片中脯氨酸含量低，融冻和冻融阶段叶片脯氨酸含量差异也不显著，但明显较白三叶低60%，且差异极显著(P＜0.001)。这表明在融冻胁迫循环中白三叶具有很强的渗透调节能力防止结冰失水维护细胞水分平衡。在融冻-冻融胁迫循环中两种三叶草叶片可溶性糖含量变化趋势相似(图2)。在融冻降温过程中，白三叶和红三叶叶片可溶性糖含量略有增加(34.2%，18.5%)，在冻融升温至－5℃叶片可溶性糖含量急剧增加(51.2%，6倍)，在持续升温过程中维持较高水平(图2)。导致冻融阶段白三叶和红三叶叶片中可溶性糖含量比融冻阶段增高76%和2倍，两阶段可溶性糖含量差异显著(P＜0.05)。这表明在融冻阶段细胞结冰引起脱水导致的渗透胁迫，而此时增加的可溶性糖可提高细胞渗透势防止细胞脱水。在冻融阶段细胞冰晶融化过程中，增加的可溶性糖可防止水分丢失维护细胞内水分平衡。但在融冻阶段，白三叶可溶性糖含量高于红三叶，且两者差异极显著(P＜0.001)，表明白三叶具有较强的渗透调节能力。在融冻-冻融胁迫循环中，两种三叶草叶片可溶性蛋白质含量变化趋势相似(图2)。在融冻阶段，温度由10℃逐渐降低到－5℃时，白三叶和红三叶叶片可溶性蛋白质含量均增加并达到最高(33.3%，25.6%)，当温度持续下降到－10℃，可溶性蛋白质含量下降(30.5%，4.7%)。在冻融升温至－5℃，叶片可溶性蛋白质含量又增加达到第二个高峰(48.0%，23.1%)，在持续升温过程中含量下降(图2)。 2.4人工融冻循环中白三叶和红三叶叶片抗氧化酶活力变化 在整个融冻-冻融胁迫循环中，白三叶和红三叶叶片POD活性对温度反应不尽相同(图3)。白三叶叶片中POD活力在融冻阶段随温度下降而增高，在叶片完全冻结(－5℃)达到最高(增加79.1%)，随着温度升高叶片解冻而下降，并在叶片完全解冻(5℃，10℃)而稳定。而红三叶叶片内POD活性在整个融冻-冻融胁迫循环中变化幅度较小，差异不显著。且白三叶叶片平均POD活性比红三叶高约2倍，两者差异极显著(P＜0.001)。融冻-冻融胁迫中，白三叶和红三叶叶片中CAT活力变化趋势相同(图3)。在融冻阶段，随降温叶片CAT活力增高，白三叶和红三叶分别在－5℃和－10℃叶片CAT活力达到最高，并较10℃叶片CAT活力分别提高了175.1%和149.1%。在冻融阶段，随升温叶片CAT活力下降(图3)。在整个融冻-冻融胁迫中，白三叶叶片CAT活力较红三叶高24.1%。 融冻-冻融胁迫中，两种三叶草叶片SOD活力变化趋势相同(图3)。在融冻阶段，随温度下降，白三叶和红三叶叶片SOD活力增高，在－5℃达到最高，活力分别增加52.1%、71.3%，在叶片完全结冻时叶片SOD活力大幅下降，但在温度回升至－5℃时叶片SOD活力又再次大幅上升(96%，75.4%)，随持续升温，叶片解冻SOD活力又降低，但SOD活力仍较高。而经历融冻-冻融胁迫后(10℃)，白三叶和红三叶叶片SOD活力分别提高了90.9%和52.1%。这表明融冻-冻融胁迫诱导细胞中活性氧自由基的产生，叶片中的SOD参与了细胞中的活性氧自由基的清除。经历融冻-冻融胁迫循环后细胞抗氧化能力提高了，其中白三叶叶片抗氧化能力大周瑞莲等:白三叶和红三叶对人工融冻胁迫的生理响应差异1337于红三叶。值得注意的是，在融冻和冻融阶段，白三叶叶片SOD活性都在－5℃达到最高值，这说明白三叶叶片中的SOD在－5℃时反应比较敏感。 3讨论 白三叶和红三叶是三叶草的2个主要类型，但抗冷力不同。耐寒耐旱性较强的白三叶既可适应亚热带夏季高温，也能在寒冷的东北安全越冬，成为城市绿化建植草坪的优良植物。而红三叶尽管艳丽的红花可装点美化环境，但由于其耐寒、耐热和耐旱能力都比白三叶差使其分布的区域缩小。但未来全球气温增高引起的融冻型冻害是否会影响它们的生存和分布，其耐冷力差异与生理反应是否是一致呢? 对经历融冻-冻融胁迫循环后两种三叶草恢复生长状况的观察发现，处理结束1个月后，白三叶部分叶片恢复正常生长，植株上又长出许多新叶，而红三叶叶片枯萎植株死亡。对融冻-冻融胁迫过程中叶片细胞膜透性的分析发现，红三叶叶片细胞膜透性较白三叶高20%。研究表明，三叶草抗融冻能力与细胞膜稳定性相关。欧阳主才等(2008)研究了低温胁迫对矮生菜豆生理生化特性的影响，指出，矮生菜豆耐寒性最敏感的生理指标首先是膜透性。两种三叶草随细胞内结冰体积增大，而细胞膜透性增大，并随细胞内冰晶融化体积缩小，细胞膜透性下降，这是融冻-冻融胁迫过程中三叶草细胞膜对细胞结冰融化的适应。但经历融冻-冻融胁迫后，白三叶细胞膜透性低于红三叶，植株存活。这表明，在融冻-冻融胁迫过程中，白三叶叶片细胞膜的扩张收缩没有超过其细胞膜的耐受度，所以植株可以存活。而红三叶同样在融冻阶段细胞膜随细胞结冰而增加，但在－10℃时继续增大，细胞膜透性较白三叶高52%，并在冻融阶段细胞冰晶融化细胞膜透性下降幅度较小，这表明－10℃引起的细胞膜透性的增大已超过了红三叶细胞膜耐受度使细胞受损，从而导致其在融冻-冻融胁迫后植株不能恢复生长。可见，白三叶叶片和植株恢复生长的能力与其细胞膜具有较强的柔韧性可抵抗冰晶形成和融化间的机械损伤、稳定细胞膜完整性有关。#p#分页标题#e# 一些研究表明，冻融循环激活氧自由基的产生(ROS)(Benson＆Noronha-Dutra，1988;Benson＆Bremner2004)，促使膜脂过氧化，破坏细胞膜的完整性(Bensonetal．，1992;Flecketal．，1999)，并指出，冻融胁迫引起的氧自由基积累是细胞受损的主要原因。另一方面，在融冻降温至冰点以下，白三叶叶片细胞膜增大，MDA含量增高的同时还伴随抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活力增高。在冻融升温中，白三叶细胞膜降低，MDA含量下降的同时也伴随着抗氧化酶活力的降低。融冻-冻融胁迫循环中，叶片细胞膜透性和膜脂过氧化变化均与抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活力变化呈正相关。因此，融冻降温一方面引起白三叶氧自由基积累导致膜脂过氧化作用使MDA含量增加，但同时积累的氧自由基又激活了细胞中的氧自由基清除体系———抗氧化酶(SOD、POD和CAT)，它们控制并维持着细胞内氧自由基产生和清除的平衡。而红三叶在融冻-冻融胁迫过程中，细胞内MDA含量较白三叶低20%，同时POD和CAT活力也较白三叶低65%和20%，表明在融冻阶段红三叶细胞活性氧自由基浓度不高，细胞膜脂过氧化作用不是造成红三叶死亡的主要原因。 本研究中的2种三叶草在融冻降温细胞结冻细胞膜透性增大，膜脂过氧化增强时还伴随着脯氨酸、可溶性糖和蛋白质含量的大幅增加。尤其是耐冷力强的白三叶在融冻-冻融胁迫循环中叶片脯氨酸含量较红三叶高5倍。许多研究表明，冷冻胁迫下脯氨酸既是氧自由基清除剂抑制膜脂过氧化，又是渗透剂维护细胞水分平衡(Taschleretal．，2004;Lee，2007)。可见，白三叶具有很强的渗透调节能力维持细胞水分平衡。 另外，在叶片冻结时2种三叶草生理变化表现不同。白三叶叶片细胞膜透性、MDA含量、SOD、POD、CAT活力和脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白质含量在融冻胁迫温度降至－5℃，均增加到达最大，在－10℃均降低;而红三叶在－10℃时，叶片细胞膜透性、MDA含量、SOD、POD和CAT活力达到最大。这表明，白三叶对环境温度变化反应敏感，通过快速激活抗氧化酶系统抑制细胞膜脂过氧化维护膜的柔韧性和弹性，同时通过快速积累渗透调节物维护细胞水分平衡和降低细胞冰点，增强了细胞抗结冰能力和对冷冻的适应性。在温度降至－5℃时白三叶细胞弹性达到最大，以至在－10℃下细胞膜透性不再增高。而红三叶对环境温变反应较慢，以至于在－10℃细胞膜透性仍在增高，叶片POD和CAT活力达到最大。但在融冻-冻融胁迫中，红三叶叶片中MDA含量一直较低，这表明融冻-冻融胁迫过程中膜脂过氧化作用不是引起其叶片细胞死亡的主要原因。在融冻阶段，红三叶细胞中脯氨酸仅为白三叶的1/5，可溶性糖含量也较低。较低的渗透调节物不能及时稳定细胞中水分，导致低温下细胞内结冰造成机械伤害，可能是红三叶死亡的主要原因。 综上所述，融冻型胁迫引起细胞结冰-融化造成的机械伤害使许多植物不能越冬。虽然白三叶耐旱耐寒，但是其抗融冻胁迫能力决定着未来它在园林建设中的应用。经历融冻-冻融胁迫循环后，白三叶部分叶片恢复正常生长，而红三叶叶片枯萎植株死亡。白三叶各项抗逆生理指标均在融冻胁迫和冻融胁迫的－5℃达到最高，－5℃可能是白三叶叶片适应结冻和解冻生理调解的温度点，通过在－5℃时叶片生理代谢调解维护细胞中氧自由基产生和清除的平衡提高膜的柔韧性以适应融冻-冻融过程中细胞膨胀和收缩。在－10℃细胞膜透性的下降，表明白三叶对未来全球暖冬引起的融冻型冻害有很强的适应性，是一个值得应用推广的优良园林绿化植物。