流式细胞仪范文1
1 材料与方法
1.1 外周血造血干细胞 APBSC采集自经环磷酰胺（CTX）＋重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）动员后的实体瘤患者（淋巴瘤、乳腺癌），采集使用 CS3000- Plus血细胞分离机（Baxter公司，美国）。
1.2 CD34+细胞的标记 对10份 APBSC分别进行2种不同再处理与CD34标记。
1.2.1 溶血法 APBSC与CD34-PE荧光单克隆抗体（Immunotec，法国）室温暗处反应15 min，然后用细胞裂解液溶解红细胞，待测。
1.2.2 分离单个核细胞法 经Ficoll（相对密度1.007）梯度离心，收集界面层单个核细胞，与CD34-PE标记的单抗室温孵育15 min，待测。
1.3 FACS检测CD34+细胞 上述标记细胞悬液分为2管，其中一管 6 h内使用流式细胞仪（EPICS ELITE ESP， COULTER公司）测定CD34+细胞占单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的百分率，另一管经 1％多聚甲醛固定， 4℃冰箱保存72 h后， FACS测定CD34+ 细胞数。
1.4 荧光标记的CD34单克隆抗体 33份 APBSC同时分别用表达第2类抗原表位QBEnd 10（ClassⅡ，Immunotec）和表达第3类抗原表位 8G12（ HPCA2，classⅢ，Becton Dickinson）的单抗进行标记，比较2组 CD34+细胞百分率之间的差异。
1.5 双标记CD34/CD45 APBSC中同时加入抗CD45-FITC（J33）和抗CD34-PE（HPCA2），用溶血法处理细胞， FACS测定CD34+细胞。
1.6 统计学处理 用 t检验。
2 结果
2.1 溶血法与单个核细胞标记法测得CD34+ 细胞百分率无显著性差异（P＞0.50）。
2.2 同一样品经 1％多聚甲醛固定72 h后的测定值与 6 h内的测定值相比，CD34+细胞荧光强度降低，非特异吸附增加，变异系数范围在 9.9％～49.5％之间，平均CV值为 32.2％。
2.3 APBSC标本分别用2种CD34单体标记，CD34+细胞百分率无显著性差异（P＞0.05）。
2.4 CD34-PE／CD45-FITC双标记测定 APBSC中CD34+细胞的百分率为 4.5％，而同一组样品进行CD34+细胞单色标记为5.3％。
3 讨论
FACS虽然对CD34+细胞的检测具有决定性意义，但早期造血干细胞表面CD34抗原表达弱且少，标本保存（冷冻）、不同标记方法及固定剂的使用均会影响CD34+细胞结果［1］。本研究对样品固定前、后测定，CV值明显大于批内变异，应在 1％～ 6％，批间变异＜20％的国际质控标准［2］。样品的2种不同处理方法间虽无显著性差异，但溶血法较分离单个核细胞法简单，避免了细胞损伤，使细胞回收率提高［2］，更适于临床应用。CD34抗原表位可分为3类，其抗原表达亦有差异，应用针对不同表位的抗体测定CD 34+细胞，结果是否有差异，则报道不一［3，4］。本研究的结果表明无显著性差异。
各实验室对CD34+细胞标记与测定目前尚无统一的标准方法，必然会产生较大的室间差异，Lowdell 等对28份 APBSC在15个实验室进行室间分析，结果差异很大，CD34+细胞为∶ 0.08％～19.31％，CV值为100.1％～136.6％［1］。1995年初，国际血液治疗与移植工程协会（ISHAGE）成立了干细胞计数委员会，建立了一种简单、快速、灵敏的计数CD34+细胞的方法［5］，建议双标记CD34-PE／CD45-FITC计数CD45+细胞中CD34+细胞的百分率，因为白细胞共同抗原CD45在造血干／祖细胞上的表达明显减弱，CD45和侧向散射光（SSC）一起可以较好地把CD34+细胞和淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、死细胞、细胞碎片、血小板团块及有核细胞区分开［4］。此外还可以同时结合第3种荧光抗体，测定CD34+细胞亚群［5］。
应用 FACS测定CD34+细胞应遵循以下原则∶选用特异性及敏感性高的单体，CD34单抗结合PE效果要强于 FITC［6］；由于CD34+细胞表达很少，应计数尽可能多的细胞，以提高结果的准确性［7］；标本应新鲜测定；同时标记CD45，可提高检测CD34+细胞的准确性。
参考文献：
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［5］Sutherland D R ， Anderson L ， Keeney M et al. The ISHAGE for CD34+ cell deterination by flow cytometry . J Hematotherapy ， 1996 ; 5(3) : 213
流式细胞仪范文2
关键词：病毒性心肌炎，急性；T淋巴细胞亚群；NK细胞；流式细胞术
中图分类号：R542.2 R256.2 文献标识码：B 文章编号：1672―1349(2007)04―0348―02
急性病毒性心肌炎(acute viral myocarditis，AVMC)的发病机制至今未完全清楚，最近，病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)与细胞免疫功能的关系颇受关注。有资料认为，病毒性心肌炎心肌病变的形成，除病毒直接作用外，还与自身免疫反应有关[1]。利用流式细胞仪对成人急性病毒性心肌炎病人淋巴细胞亚群的CD3、CD4、CD8、自然杀伤(NK)细胞等进行了检测，现将结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料选择2005年1月―2006年9月诊断为急性病毒性心肌炎病人23例(观察组)，均符合诊断急性病毒性心肌炎的标准[2]。其中男9例，女14例，年龄(16～45)岁，平均27.5岁，监测前未接受激素及免疫调节剂治疗。对照组选取健康志愿献血者20名，其中女10名，男10名，年龄(24～39)岁，平均31.1岁
1.2 试剂与仪器 流式细胞仪为BD公司生产的FACSCal-ibur，离心机为法国JUNAN生产的CR422，检测淋巴细胞亚群的CD3、CD4、CD8、NK细胞的荧光标记抗体、红细胞溶解素均为BD提供。
1.3 检测方法利用流式细胞分析技术进行检测。对照组和观察组分别于早晨抽取空腹外周血2 mL，EDTA－K2抗凝，于采血2 h内检测。取6个试管分别加入FITC－CD45/PE－CD14、FITC－IgGl/PE－IgGl、FITC－CD/PE－CD19、FITC－CD3/PE－CD4、FITC－CD3/PE－CDk、FITC－CD3/PE－CD16＋56各20 uL，加EDTA－K2抗凝全血100 uL，混匀置室温暗处20 min，然后加入红细胞溶解素2 mL溶解红细胞8min，300 r/min离心5 min，用PBS洗涤2次后，加0.5 mL含1％多聚甲醛PBS固定，待测。仪器调整良好后测标本，以FITC－IgGl/PE～IgGl作为同型对照，计数1×104个细胞。
l.4 统计学处理采用SPSS 10.0统计学软件，数据以均数±标准差
表示，两组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
与对照组相比，观察组CD3的变化不明显(P＞0.05)。CD4、Th/Tc比值明显低于对照组(P＜0.01)，CD8、NK细胞明显高于对照组(P＜0.01)。详见表1。
3 讨 论
病毒性心肌炎是病毒侵犯心脏引起的心肌实质或间质、局限性或弥漫性病变，其病理变化主要是广泛或散在的心肌细胞坏死及周围间质细胞浸润[3]。近年来此病发病率有增高趋势，大多数病人可完全恢复正常心功能，少数病人临床症状可改善，但会遗留心功能不全，极少数病人进行性心脏扩大，可能转化为扩张性心肌病、慢性心力衰竭、死亡或需心脏移植[4]，而该疾病至今仍无特效疗法，从病理生理学角度来看，早期以心肌细胞的直接损伤为主，后期以免疫介导心肌细胞损伤为主，对其免疫机制及感染因素研究，对治疗病毒性心肌炎有很大帮助。
通过分子模拟的原理证实了T细胞在心肌炎中的重要作用[5]。T细胞通过识别宿主和微生物的抗原表位而促进自身免疫反应的发生和发展。心肌损伤时，作为隐蔽抗原的肌凝蛋白就会释放出来与免疫系统接触，激活对它有交叉反应的T细胞，从而引发自身免疫反应。
本组研究显示病毒性心肌炎发病过程中，病人细胞免疫检测指标下降。细胞免疫主要包括T淋巴细胞、NK细胞和巨噬细胞等，T淋巴细胞是重要的免疫细胞，在自身免疫性炎症中起重要作用。在胸腺中发育成熟后进人外周血中。CD为细胞分化抗原，是细胞表面的一种标记。根据T细胞不同的表面标记和功能可分为CD3、CD8和CD8亚群。本研究中的CD4、Th/TcCD4/CD8比值明显低于照组(P
在本研究中，观察到NK细胞明显增殖活跃。Deguchi等[7]发现，在急性病毒性心肌炎阶段，炎性细胞浸润可分为两个时相：第一时相即病毒感染后(3～9)d，主要为NK细胞和巨噬细胞浸润心肌并达到高峰；第二时相在病毒感染后(7～14)d，T细胞替代NK细胞和巨噬细胞成为主要浸润细胞。NK细胞是VMC早期最主要的炎性浸润细胞，因其不受主要组织相容复合物分子限制，可直接作用于病毒感染心肌细胞，主要通过释放穿孔素途径溶解细胞，达到清除病毒的作用，并通过分泌γ干扰素(INF－γ)等细胞因子，进一步扩大反应。NK细胞的杀伤作用虽然参与了VMC的病理损害，但因其主要杀灭病毒感染心肌细胞，是VMC早期主要的抗病毒屏障，所以对心肌的病理损害是有限的。
由于利用流式细胞仪检测淋巴细胞亚群对病毒性心肌炎研究时间较短，且本研究的样本量比较小，是本研究的不足之处，这有待在后续进一步的研究中改进提高。
参考文献：
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流式细胞仪范文3
【关键词】流式细胞；荧光素
近十年来流式细胞仪已经成为临床医生、免疫学家和细胞生物学家必不可少的工具，这项技术在不断进步。流式细胞仪的多参数细胞分析这一独特的功能让大多数细胞分析成为了可能。Coon首先提出了荧光抗体标记细胞内的目的蛋白技术，在20世纪80年代，细胞亚群仅仅通过检测单一的细胞表面标志物来确定，使用的单抗和荧光素很受限制。基因表达技术的诞生和新的单抗以及荧光素的获得使更复杂的多参数分析成为可能。
荧光素受到一定波长的激光激发后，释放出能量并发射出一定波长的荧光.因此，我们在选择荧光素时应注意各种荧光素的激发波长，以选择正确的激光器.例如FITC和PE、PI等的激发波长为488nm，APC等激发波长为630nm。FITC、PE、PE-Cy5为目前流式细胞仪的常用荧光素，基本能满足日常临床和科研的需要。随着多色流式细胞仪的出现，新荧光素和标记抗体也得到了长足发展。然而为实验中所需抗体选择最佳的荧光素组合是一个复杂的过程。如何选择多色流式细胞仪检测试剂组合，避免重复试验和错误，增加你实验成功的机会。试剂的选择首选是根据您仪器配置开始的。仪器中所装配的激光器和探测器的型号和数量决定了你的仪器的光学系统能否激发某个荧光素，并能否正确地检测某个荧光素组合。本文总结了一些常用流式细胞荧光素和多色流式细胞中荧光素选择的原则。
1常用荧光素的种类及特性［1］
1.1FITC（Fluorescein）又称异硫氰酸荧光素，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；FITC的最大发射波长为525nm，在流式细胞仪的FL1通道检测。
1.2PE（R-Phycoerythrin）又称藻红蛋白，有R-PE和RD1的别称，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PE的最大发射波长为575nm，在流式细胞仪的FL2通道检测。
1.3PE-TR（PE-TexasRed）/ECDPE-TR又名ECD，是由PE和TexasRed（TR）组合而成的Tandem荧光素；其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PE-TR的最大发射波长为615nm，在流式细胞仪的FL3通道检测；PE-TR标记的抗体可用于毫瓦级激光器的小流式细胞仪，也适用于配备有全功率激光器的大流式分选仪。
1.4PI（PropidiumIodide）又称碘化丙啶，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PI的最大发射波长为617nm。在流式细胞仪的FL3通道检测。
1.5PE-Cy5（TRI-COLOR，TC）又称TRI-COLOR或TC，是由PE和Cy5组合而成的Tandem荧光素；其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PE-Cy5的最大发射波长为670nm，在流式细胞仪上用FL4通道检测；PE-Cy5标记的抗体可用于毫瓦级激光器的小流式细胞仪，也适用于配备有全功率激光器的大流式分选仪。
1.6PerCP（Peridinin-Chlorophyll-ProteinComplex）多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PerCP的最大发射波长为677nm。在流式细胞仪的FL4通道检测。
1.7APC（Allophycocyanin）又称别藻蓝蛋白，其标记的抗体适用于配备氦氖激光器发射波长为633nm的多色流式细胞仪；APC最大发射波长为660nm，在流式细胞仪中只有配有双激光器的FL4才能检测。
1.8APC-Cy7是由APC和Cy7组合而成的Tandem荧光素；其标记的抗体适用于配备氦氖激光器发射波长为633nm的多色流式细胞仪，APC-Cy7主要用于四色以上的流式细胞术。
2荧光素选用方法及原则
2.1尽量选择荧光度强的荧光素FITC、PE、PE-cy5和APC为目前流式细胞仪的常用荧光素，基本能满足日常临床和科研的需要。荧光素的荧光强度是有区别的，FITC为荧光强度比较弱的素，而APC、PE和PE-cy5为荧光比较强的素。尽量选择荧光强的荧光素。细胞表面或内部的各种抗原表达量也不同，如CD4和CD8在细胞表面的表达分子数很多，而CD25等分子在细胞上的表达量则不多。在用流式细胞术分析这些分子时应根据表达量来选择荧光素，对于表达较多的分子，可用FITC等弱荧光素，而对于表达较少的分子，则须要用荧光较强的素，包括PE、PE-Cy5和PE-Cy5.5等，针对您特定的仪器配置，选择最亮的荧光素。
2.2多荧光素组合，尽量选择同一激光激发当多荧光素组合时候，尽量选择同一激光激发，如果不同激发器激发，在实际检测中会因为两激光调节不同，影响荧光素的灵敏度。
2.3搭配荧光素之间发射光谱重叠尽量小每个荧光通道选一种荧光，荧光素可随意搭配，但是应该考虑荧光素之间发射光谱重叠问题，选择试剂组合时要将光谱叠加可能性减到最低。这可以能与选择最亮的荧光素的规则是冲突的。如在进行四色分析，经常会将PE-Cy5标记的抗体与APC标记的抗体搭配使用，此搭配需较大幅度地调节两者的颜色补偿。可选用PE-Cy5.5来替代PE-Cy5，颜色补偿只需1%左右。因为Cy5的激发波长与APC的激发波长相近，所以PE-Cy5荧光素中的Cy5，也会被激发APC的第二个激光器（氦氖激光器）所激发，导致PE-Cy5与APC的颜色补偿很难调。相反，PE-Cy5.5中的Cy5.5激发波长为675nm，不能被激发APC的第二个激光器所激发，也就不存在Cy5.5对APC的干扰，颜色补偿也就很小。因此，可能需要牺牲个别的荧光的亮度来避免荧光渗漏以及敏感度丧失。
综上所述，本文总结了一些多色流式细胞术荧光素选择的规则，这些规则需要达到一个平衡状态，才能得到最佳的实验结果，针对特定的流式细胞仪器配置，选择最亮的荧光素，同时选则荧光素要尽量降低光谱叠加的可能，保留最亮的荧光素给弱表达的抗体。
流式细胞仪范文4
【摘要】 目的观察三叶青黄酮对SMMC-7721肝癌细胞诱导凋亡的作用。方法通过四氮噻唑蓝(MTT)比色法检测三叶青黄酮对细胞的抑制增殖作用;光学显微镜、荧光显微镜下形态学观察;DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞仪(FCM)研究分析三叶青黄酮对肝癌细胞的诱导凋亡作用。结果三叶青黄酮能显著的抑制SMMC-7721肝癌细胞的生长，并具有浓度依赖性。光学显微镜、荧光显微镜下观察，发现细胞凋亡现象;DNA琼脂糖凝胶电泳可见DNA梯形条带;流式细胞仪(FCM)检测分析出现凋亡亚二倍体峰。结论三叶青黄酮对肝癌细胞具有诱导凋亡作用，有抗肝癌的药用价值。
【关键词】 三叶青黄酮; 肝癌细胞; 凋亡
三叶青具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛等功效[1]，用于治疗高热惊厥、肺炎、哮喘、肝炎、风湿、月经不调及恶性肿瘤，具有很好的疗效。大量的研究表明该中药具有免疫调节作用 ， 其不仅直接作用于细胞免疫，而且通过整体作用来控制细胞免疫与细胞因子的活动。近几年，三叶青黄酮抗肿瘤作用日益受到重视。为进一步探讨三叶青抗肿瘤作用的机制，更好地开发利用三叶青， 本实验通过(MTT)比色法、光学显微镜下形态学观察、荧光显微镜观察、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪(FCM)测定法研究三叶青黄酮对SMMC-7721肝癌细胞诱导凋亡进行研究。
1 仪器与材料
1.1 仪器酶联免疫检测仪，国营华东电子管厂研制，型号，DG-3022;流式细胞仪(FCM)，美国B&D公司产品，型号，FACS.calibur;电泳仪，北京六一仪器厂产品，型号DYY-Ⅲ1;紫外透射分析仪，上海长兴机器厂产品，型号: 2F-3。
1.2 药物与试剂三叶青，宁夏明德饮片厂提供，宁夏药品检验所鉴定。青霉素，宁夏启元药业生产，规格，160万单位，批号080912;链霉素，安徽淮南国瑞药业产品，规格，0.75 g，批号20090308;RPMI1640，美国Sigma公司产品;四氮噻唑蓝(MTT)，美国Sigma公司产品。
1.3 细胞株及培养肝癌细胞株SMMC-7721由第四军医大学口腔医学院引进。接种于100 L玻璃培养瓶中，在含10%小牛血清、青霉素100 mg·L-1、链霉素100 mg·L-1的RPMI1640培养基中， 37℃、pH7.2置5%CO2培养箱中培养48 h，经0.25%的胰酶消化后，制成2×105·ml-1细胞悬液。
1.4 三叶青黄酮的提取、分离和制备称取三叶青块根1 000 g ，采用碱性稀醇提取法[2] 提取得三叶青黄酮7.2 g 。聚酰胺柱层析[2] 后，分别用10% ，30% ，50% ，70% ，95% 的乙醇洗脱，回收得浓缩物，真空干燥至恒重，分别标记为HT10，HT30，HT50，HT70 和HT95。分别称取HT10，HT30，HT50，HT70 和HT95各2 mg ，溶解于200 μl 二甲基亚砜中，旋涡振荡，全部溶解后，加入800 μl RPMI1640培养液旋涡震荡混匀后放置于4 ℃ 冰箱保存备用， 终浓度为10 mg ·ml-1 。用时按比例配制成2，4，6，8，10 mg ·ml-1的浓度液。
2 方法
2.1 实验分组实验组分加药组和对照组，加药组分别加入HT10，HT30，HT50，HT70 和HT95。各自加入100 μl 2，4，6，8，10 mg ·ml-1的药液，每计量组6个复空，对照组加等量的培养基，混匀后放入5%CO2培养箱中培养。
2.2 四氮噻唑蓝(MTT)比色法取对数生长期SMMC-7721细胞，接种于96孔板，每孔加入100 μl细胞悬液，培养24 h，待细胞贴壁后，进行换液和药物处理[3] ，弃上清液，加入100 μl HT10，HT30，HT50，HT70 和HT95各浓度的药液100 μl。对照组加100 μl的培养液，混匀。37℃、pH7.2置5%CO2培养箱中培养。培养48 h后，弃上清液，在各孔中加入5 g·L-1MTT 30 μl ，继续培养4 h，弃上清液，每孔加二甲亚砜100μl，振摇5 min，用酶联免疫检测仪测定570 nm处吸光度，计算出细胞抑制率。
2.3 光学显微镜下形态学观察取实验组细胞，用PBS(pH7.2)洗涤1次，做离心涂片，用甲醇固定3～5 min，滴加Wright染色2 min，入Wright磷酸缓冲稀释液4～10 min，用蒸馏水冲洗[3] ，在油镜下观察细胞形态。
2.4 荧光显微镜观察取实验组细胞，吹打均匀，取30 μl悬液加到载玻片上，加10 μl吖啶橙染色，加盖玻片后置荧光显微镜下观察SMMC-7721细胞形态并照相，在显微镜下数400个细胞，计算细胞凋亡率[3]。
2.5 DNA琼脂糖凝胶电泳收集药物作用组及对照组培养细胞，常规方法提取细胞DNA ，1.5%琼脂糖凝胶孔中电泳，在室温、50 V、恒流60 mA电泳2 h，紫外灯下观察并照相[3]。
2.6 流式细胞仪(FCM)分析将经药物处理的细胞，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，PBS洗涤2次，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，加冷的70%(体积分数)乙醇4℃固定24 h，离心，弃乙醇，PBS洗1次，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，滴加0.5 ml 100 mg·L-1RNase，放置4 h，离心，弃上清液，PBS洗1次，300目筛网过滤1次， 1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，加0.5 ml PI过夜[3]。上流式细胞仪测定。
2.7 统计学处理采用SPSS11.0 软件，不同药物浓度组间的比较采用完全随机设计的方差分析，各药物浓度组与对照组的比较采用Dunnett t 检验，以α= 0.05 为检验水准。
3 结果
3.1 三叶青黄酮对SMMC-7721肝癌细胞增殖的抑制作用结果见图1。从图1可以看出，不同浓度乙醇层析分离的三叶青黄酮(HT10、HT30、HT50、HT70和HT95) 均能抑制SMMC-7721 细胞的增殖;随着药物浓度的增加，其生长抑制作用增强，呈浓度-效应关系。其中HT50作用最强，随着加入药物浓度的增加，其对SMMC-7721细胞生长抑制率分别为38.6%，47.2%，65.1%，70.1 %和71.6%。图1 三叶青黄酮对SMMC-7721肝癌细胞增殖抑制作用
3.2 光学显微镜下形态学变化取对照组细胞及实验组细胞，光学显微镜下观察，可见实验组细胞染色质浓集，细胞核固缩、碎裂，细胞膜起泡，有核碎片的凋亡小体形成。
3.3 荧光显微镜下形态学变化取对照组及实验组细胞，荧光显微镜下可见对照组细胞为黄色或桔红色，给药组细胞核或细胞质内可见致密浓集的黄绿色染色，可见黄绿色碎片，细胞核固缩、核碎裂、细胞膜起泡及凋亡小体形成，检测其凋亡率， 其中HT50组不同浓度的凋亡率分别为29.5%，36.3%，52.5% ，62.8%和70%;随着浓度的不断增加，细胞凋亡率呈上升趋势。
3.4 DNA琼脂糖凝胶电泳结果取对照组及HT50组的8，10 mg ·ml-1两个浓度的细胞，经琼脂糖凝胶电泳后，给药组均出现凋亡特有DNA Lad-der带，而对照组则无此带。3.5 流式细胞仪(FCM)测定结果取对照组及HT50组的8，10 mg ·ml-1两个浓度的细胞，流式细胞仪(FCM)测定，对照组未出现亚2倍体峰，给药组均可见明显的亚2倍体峰。
4 讨论
三叶青具有多方面的生物活性，其中抗肿瘤作用日渐被人们重视。本研究通过定量和定性的细胞凋亡研究方法，对5种不同浓度的乙醇分离的三叶青黄酮作用后的细胞进行凋亡研究，发现各组均有直接抑制肿瘤细胞增殖作用，且呈浓度-效应正相关。其中HT50的10 mg ·ml-1浓度抑制作用最强。通过光学显微镜、荧光显微镜对细胞形态学的观察，可见细胞核固缩、核碎裂、细胞膜起泡及凋亡小体形成等形态， 随着浓度的增加凋亡率也不断升高。 DNA琼脂糖凝胶电泳显示实验组细胞，DNA电泳图上呈现“梯状”条带，这是细胞凋亡最具特征的生化改变;流式细胞仪分析，三叶青黄酮作用后的细胞均出现明显的亚2倍体峰。三叶青黄酮对SMMC-7721肝癌细胞具有明显的诱导凋亡作用，是很有潜力的抗癌药物。
参考文献
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流式细胞仪范文5
[关键词]流感病毒；肿瘤细胞；细胞凋亡
[中图分类号]R73[文献标识码]B [文章编号]1673-7210（2007）05（c）-150-02
细胞凋亡是细胞在生理或病理信号刺激下，启动自身凋亡相关基因而发生的主动“自杀”过程。近年来的研究表明，流感病毒可诱导多种细胞发生细胞凋亡，包括其容纳细胞和非容纳细胞，由于流感病毒可诱导多种肿瘤细胞发生细胞凋亡，因此认为这可能是肿瘤治疗的一条新途径。本研究选择了非容纳细胞（Hela细胞），体外观察流感病毒与经紫外线照射后的流感病毒分别诱导其凋亡的作用。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 病毒与细胞A型流感病毒购自华西医科大学典型培养物保藏中心， Hela细胞为大连医科大学微生物教研室保存的传代细胞，在含有10%小牛血清的MEM培养基中培养传代。
1.1.2 主要试剂与仪器Annexin-V-FITC/PI Staining试剂盒购自Roche公司。透射电子显微镜(JEM-2000EX)，流式细胞仪(FACS V antage TMSE)，酶标仪(model 3550，biorad公司)。
1.2 方法
1.2.1 病毒培养将A型流感病毒接种于9～11日龄鸡胚尿囊腔，37℃孵育72 h，收获尿囊液，检测血凝效价，取血凝效价>1∶640的尿囊液低温保存备用。
1.2.2 肿瘤细胞凋亡的诱导Hela细胞长至80%单层(悬浮细胞于对数生长期)时，按20 m.o.i.加入病毒液1 ml/瓶[1]，37℃吸附1 h，吸出病毒液，加入含2%小牛血清的维持液继续培养，于诱导后不同时间点收集细胞，以下述方法检测凋亡。同时以生理盐水诱导作为对照。
1.2.3 Hela细胞凋亡的形态学检测将不同时间收集的细胞(约1×108个)，按常规程序固定、脱水、包埋、切片后，经枸橼酸铅、醋酸铀染色后电镜下观察细胞超微结构特征的改变。
1.2.4 Annexin-VFITC/PI染色检测细胞凋亡取效价为1∶64 A型流感病毒0.5 ml接种至长成80%单层的Hela细胞，37℃吸附1 h弃去病毒液，加入维持液1 ml。于接种后4、8、12、24、48 h收集细胞，用冷PBS洗涤两次，调整细胞浓度为1×108个/ml，取100 μl进行染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。同时设不加病毒的阴性对照及经紫外线照射30 min的病毒对照。共检测3次结果取均值。
2 结果
2.1 细胞超微结构改变
电镜下可见，生理盐水诱导组细胞染色质疏松，在细胞核内均匀分布，胞浆丰富；而病毒感染组细胞则出现凋亡的形态学改变，诱导后6 h细胞表现凋亡早期改变，诱导后24 h则多数细胞出现凋亡后期形态学特征。在凋亡早期，细胞微绒毛消失，细胞表面平滑化，核浓缩、染色质固缩凝结至核膜周边；随后胞质浓缩，细胞体积缩小，内质网扩张，形成一系列膨胀小泡，胞浆内细胞器(线粒体、溶酶体)聚集，结构完整；最后胞膜逐渐内陷，将细胞分割成多个大小不等的不连续凋亡小体(图1)。
2.2 Annexin-VFITC/PI染色流式细胞仪检测结果
流感病毒及紫外线照射30 min后的流感病毒分别作用于Hela细胞后，于4、8、12、24、48 h收集细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡，按下式计算凋亡百分率。结果病毒感染后6 h开始出现细胞凋亡，且凋亡百分率随时间延长而增高，于12～24 h达高峰，之后凋亡百分率下降，而坏死细胞百分率逐渐增加(凋亡百分率=实测凋亡百分率-阴性对照凋亡百分率)（表1）。
3 讨论
凋亡是不同于坏死的细胞死亡方式之一，它与机体的一些生理与病理过程密切相关。研究表明，细胞凋亡的抑制与肿瘤的发生、发展及其对治疗的耐受都有着密切的关系。由于肿瘤细胞凋亡具有可诱导性，诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的又一途径。中国在20世纪80～90年代即有大量关于用流感病毒治疗小鼠腹水瘤使动物生存期延长的报道[1～3]，笔者认为这与病毒感染肿瘤细胞后，在其表面表达病毒抗原成分，从而增强细胞抗原性，提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别、清除能力有关[1]。鉴于流感病毒能诱导体外培养的细胞发生凋亡，且皮下和腹腔注射并不引起动物发病和死亡，因而有望利用流感病毒诱导肿瘤细胞凋亡开发一种新型的肿瘤治疗方法。在研究中发现，流感病毒不仅可引起动物呼吸道细胞及一些容纳性细胞的凋亡，亦可引起非容纳性细胞(如Hela细胞)发生凋亡[4～6]。本研究选择了非容纳细胞，体外观察流感病毒与经紫外线照射后的流感病毒分别诱导其凋亡的作用。
本研究发现：无论是A型流感病毒还是经过紫外线照射的流感病毒均可诱导Hela细胞凋亡，但流感病毒诱导肿瘤细胞凋亡的能力要比经紫外线照射后的流感病毒强。当A型流感病毒作用于Hela细胞后6 h细胞表现凋亡早期改变,诱导后24 h则多数细胞出现凋亡后期形态学特征。从诱导时间来看，流感病毒作用后6 h开始出现细胞凋亡，12～24 h时的细胞凋亡百分率达到高峰，之后随着坏死细胞增多，凋亡百分率开始下降。与此同时，流感病毒经紫外线照射30 min后作用于Hela细胞,流式细胞仪也同样检测到了一定的凋亡率，最高可达到16.4%，这说明，经紫外线作用后的流感病毒仍然具有一定的诱导细胞凋亡的能力，但其他报道认为紫外线灭活后的流感病毒不能诱导细胞凋亡[7]，对此尚需进一步研究。流感病毒诱导细胞凋亡一方面是其致病的一个重要机制[8～9]，另一方面也提示其在肿瘤的治疗方面可能具有一定的应用价值。
[参考文献]
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[8]Hinshaw VS，Isen CW，Dybdahl Sissoko N，et al.Apoptosis:a mechanism of cell killing by influenza A and B viruses[J].J Virol，1994，68(6):3667-3673.
[9]Ito T，Kobayashi Y，Morita T，et al.Virulent influenza A viruses induce apoptosis in chickens[J].Virus Res，2002，84(1-2):27-35.
流式细胞仪范文6
【摘要】 目的 研究化疗药物对胆囊细胞的敏感性。方法 应用MTT法及流式细胞仪，选择6种化疗药物作用于胆囊癌细胞株，进行化疗药物敏感性的检测。结果 MTT法及流式细胞法测定6种化疗药物对胆囊癌细胞的敏感性，由高至低依次为顺铂(DDP)34.77±3.53、丝裂霉素(MMC)33.25±3.40、卡铂(CDB)15.73±4.50、阿霉素(ADM)15.52±3.56、甲氨蝶呤(MTX)14.5±2.13、长春新碱(VCR)8.5±1.95。结论 6种化疗药物以DDP、MMC较敏感，CDB、ADM、MTX次之，VCR最差。
【关键词】 胆囊癌；化疗；流式细胞仪
【Abstract】 Objective To study the sensitivity of the primary gallbladder carcinoma to chemotherapeutic drugs.Methods Analyzed by MTT methods and cytofluorometry，the sensitivity detection of 6 kinds of chemotherapeutic drugs to gallbladder carcinoma cell strain.Results All of the six antitumor drugs was evaluated by MTT methods and cytofluorometry，they were (from high to low)：cisplatin(DDP)34.77±3.53，mitomycin C(MMC)33.25±3.40，carboplatin(CDB)15.73±4.50，adriamycin(ADM)15.25±3.56，methotrexate(MTX)14.5±2.13，vincristine(VCR)8.5±1.95.Conclusion DDP and MMC are more chemosensitive than CDB，ADM and MTX especially than VCR.
【Key words】 gallbladder carcinoma；chemotherapy；cytofluorometry
原发性胆囊癌是一种恶性程度高且预后较差的胆系恶性肿瘤，占消化系统恶性肿瘤的第五位，近年来的统计结果表明，其发病有增高趋势［1］。虽然在诊断技术，及治疗方法上有所发展，但治疗5年生存率仅有5%～10%的水平。手术治疗仍然是目前胆囊癌治疗的首选方法，但手术切除率低依然是困扰胆囊癌治疗方法的主要原因，因此，药物化疗就显得至关重要。但目前针对胆囊癌的化疗效果欠佳，且国内外尚无统一、公认显效的联合用药方案。我们选择了5种化疗药物，采用MTT及流式细胞仪(FCM)方法检测其药物敏感性，以期找到临床合理运用化疗方案的科学依据，从而使化疗个体化。本实验研究的结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞来源 胆囊癌细胞系(山东医科大学外科陈博教授提供)。
1.1.2 药物 顺铂、阿霉素、丝裂霉素、卡铂、长春新碱、甲氨蝶呤。
1.1.3 试剂及仪器 RPMI 1640培养基及小牛血清由北京中山公司提供，四甲基偶氮唑盐( MTT ) 及二甲基亚砜( DMSO )由Sigma 公司提供，自动酶标读数仪( 国产DG-3022 )，流式细胞仪 FACScort (Becton Dickinson)。
1.2 方法 （1）胆囊癌细胞在含100%小牛血清的1640培养基，37℃，5% CO2 培养箱中生长。取对数生长期的细胞以每孔5×104个细胞接种于96孔细胞培养板中，37℃，5% CO2条件下培养48h。把所有细胞分为6个实验组和1个对照组，6种不同浓度的化疗药物浓度为［ 药物浓度计算公式为：药物浓度(μg/ml)=60×D/5000÷50%×103，D为临床用药剂量(mg/kg·d)，60为平均成人体重(kg)，50%为红细胞压积，乘103后将mg换算成μg］DDP 40μg/mg、MMC 2μg/ml、ADM 40μg/ml、CDB 300μg/ml、MTX 5μg/ml、VCR 1μg/ml。分别加入6个实验组中，使每孔最终体积为200μl，每个浓度设3个复孔。以无化疗药物的细胞液为空白对照，作用48h后，每孔加1mg/ml 的 MTT 0.1ml；继续培养4h后加DMSO溶液0.1ml，温育30min；在自动酶标读数仪上比色，波长570nm，测出每孔OD值(吸光度值)，结果以高度敏感(抑制率＞70% )，中度敏感 ( 抑制率 50%～70% )，不敏感 ( 抑制率
1.3 统计学方法 采用SAS统计软件进行Student-t 检验。
2 结果
2.1 MTT法测定化疗药物的平均抑制率 不同的化疗药物对胆囊癌细胞的抑制率不同，体外MTT的试验表明，胆囊癌细胞对顺铂及丝裂霉素有较高的敏感性。见表1。
注：*临床上以抑制率大于50%为敏感
2.2 流式细胞法测定化疗药物的杀伤率 不同的化疗药物对胆囊癌细胞的杀伤率不同，流式细胞仪药敏测法分析6种药物之中，顺铂、丝裂霉素、阿霉素、卡铂、甲氨蝶呤与对照组相比差异有非常显著性（P
注：与其他组比较差异有显著性，P
1 朱爱军，石景森.原发性胆囊癌的诊断和治疗.消化病诊断和治疗，2001，1：25.
2 Wilson JK，Sargent Jm，Eligie AW，et al.A feasibility study of chemosensitivity testing in ovarian malignancy.Br J Cancer，1990，62：189-194.
3 牟洪超，王兵.原发性胆囊癌的诊断和治疗.临床军医杂志，2003，31：93-94.
