摘要：目的建立加味三核颗粒的质量控制方法。方法采用薄层色谱（TLC）法对加味三核颗粒中黄柏、补骨脂、蛇床子、水红花子进行定性鉴别；采用高效液相（HPLC）法测定加味三核颗粒中盐酸小檗碱的含量，GeminiC18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；乙腈∶0.1%磷酸溶液（50∶50）（每1000mL加十二烷基苯磺酸钠0.1g）为流动相；检测波长265nm；进样量10μL；流速1.0mL/min。结果薄层鉴别的色谱图斑点清晰，特征斑点专属性强，阴性对照无干扰；盐酸小檗碱进样量在640~6400ng与峰面积具有良好的线性关系，r=0.9998，平均回收率为100.56%，RSD=1.46%。结论所建的质量控制方法简单、专属性强，重现性好，可作为加味三核颗粒的质量控制方法。
关键词：加味三核颗粒；盐酸小檗碱；高效液相色谱法；质量控制
前列腺增生症是引发中老年男性排尿障碍的一种常见良性疾病，在50岁人群中发病率为40%，在80岁以上人群中发病率接近90%，90岁以后人群发病率几乎100%。我们目前逐步进入人口老龄化阶段，前列腺增生症患者逐年增加，严重影响老年人的生活质量，甚至还可能伤及肾脏，造成肾功能不全等后果[1]。加味三核颗粒是国医大师王世民教授由经典古方加味而成，由橘核、山楂核、荔枝核、黄柏、水红花子等多味中药组成的中药制剂，治疗前列腺增生疗效显著，极大地减轻了患者的病痛。本论文就加味三核颗粒的薄层定性鉴别、含量测定、方法学考察进行研究，建立加味三核颗粒的完整、全面的质量控制方法，为加味三核颗粒的质量控制研究奠定一定的基础。
1仪器与试剂
1.1仪器
美国Waterse2695高效液相色谱仪，Wa-ters2998紫外检测器，Empower工作站；CAMAGTLCVISUALIZER薄层成像仪；CAMAGLINOMAT5半自动点样仪；瑞士METTLERAB135-S电子天平；SB-800DTD超声波清洗机。
1.2试剂
乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；盐酸小檗碱对照品（批号：110713-201915）；黄柏对照药材（批号：121510-201807）；补骨脂对照药材（批号：121056-201605）；蛇床子对照药材（批号：121030-201808），以上标准品均购自中国食品药品检定研究院。
2方法与结果
2.1薄层鉴别
2.1.1黄柏的薄层鉴别
将样品研磨成细粉状，取3g于具塞锥形瓶中，加入20mL分析纯甲醇，超声波清洗机超声30min后过滤取出，在水浴锅上蒸干得到的滤液，加3mL分析纯甲醇溶解残渣后得到的溶液即为供试品溶液。另取黄柏对照药材2.0g，制备方法同供试品溶液，作为对照药材溶液。再取黄柏阴性样品3g，制备方法同供试品溶液，即得缺黄柏的阴性对照溶液[2，3]。参照2020版《中华人民共和国药典》四部0502通则[4]下薄层色谱法，将制备好的3个批次供试品、黄柏对照药材以及缺少黄柏的阴性对照溶液各吸取1μL，应用薄层色谱点样仪，分别点于同一硅胶G薄层板上，点好的薄层板在内含乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）为展开剂的展开槽中展开完全后，将薄层板从展开槽中取出，通风处晾干，在紫外光灯（366nm）下观察，结果发现3个批次供试品薄层色谱图与黄柏对照药材薄层色谱图在同一位置上有相同颜色的荧光斑点显现，图谱显色清晰，阴性对照未见干扰。结果见图1。
2.1.2补骨脂的薄层鉴别
将样品研磨成细粉状，取2g于具塞锥形瓶中，加入20mL分析纯甲醇，超声波清洗机超声45min后过滤取出，在水浴锅上蒸干得到的滤液，加3mL分析纯甲醇溶解残渣后得到的溶液即为供试品溶液。另取0.5g补骨脂对照药材、2g补骨脂阴性样品分别制备对照药材和缺补骨脂的阴性对照溶液，方法同上[3，5]。参照2020版《中华人民共和国药典》四部0502通则[4]下薄层色谱法，将制备好的3个批次供试品、补骨脂对照药材以及缺少补骨脂的阴性对照溶液各吸取2μL，应用薄层色谱点样仪分别点置于同一个硅胶G板上，点好的薄层板在内含乙酸乙酯-正己烷（3∶1）展开剂的展开槽中展开完全后，将薄层板从展开槽中取出，通风处晾干，以10%氢氧化钾甲醇溶液作为显色剂，将其均匀的喷洒于展好的薄层板上，105℃恒温处理，结果发现3个批次供试品色谱图与补骨脂对照药材色谱图在同一位置上有相同颜色的斑点显现，图谱显色清晰，阴性对照未见干扰。结果见图2。
2.1.3蛇床子的薄层鉴别
将样品研磨成细粉状，取2g于具塞锥形瓶中，加入20mL分析纯甲醇，超声波清洗机超声40min后过滤取出，在水浴锅上蒸干得到的滤液，加3mL分析纯甲醇溶解残渣后得到的溶液即为供试品溶液。另取2g蛇床子对照药材、2g蛇床子阴性样品分别制备对照药材和缺蛇床子的阴性对照溶液，方法同上[3，5]。参照2020版《中华人民共和国药典》四部0502通则[4]下薄层色谱法，将制备好的3个批次供试品、蛇床子对照药材以及缺蛇床子的阴性对照溶液各吸取2μL，应用薄层色谱点样仪分别点置于同一硅胶G薄层板上，点好的薄层板在内含二氯甲烷-乙酸乙酯-正己烷（2∶3∶2）展开剂的展开槽中展开完全后，将薄层板从展开槽中取出，避光处晾干，在紫外光灯（366nm）下观察，结果发现3个批次供试品色谱图与蛇床子对照药材色谱图在同一位置上有相同颜色的荧光斑点显现，图谱显色清晰，阴性对照未见干扰。结果见图3。
2.1.4水红花子的薄层鉴别
将样品研磨成细粉状，取3g于具塞锥形瓶中，加入20mL分析纯甲醇，超声波清洗机超声30min后过滤取出，在水浴锅上蒸干得到的滤液，加20mL蒸馏水溶解残渣后得到的溶液用20mL的乙酸乙酯萃取2次，合并并浓缩乙酸乙酯液，水浴蒸干萃取液，加1mL分析纯甲醇溶解残渣后得到的溶液即为供试品溶液。另取1g水红花子对照药材、3g水红花子阴性样品分别制备对照药材和缺水红花子的阴性对照溶液，方法同上[3，6]。参照2020版《中华人民共和国药典》四部0502通则[4]下薄层色谱法，将制备好的3个批次供试品、水红花子对照药材以及缺水红花子的阴性对照溶液各吸取5μL，点于同一张聚酰胺薄膜上，点好的薄膜置于含氯仿-甲醇（3∶2）展开剂的展开槽中展开完全后，将薄膜从展开槽中取出，通风处晾干，将10%三氯化铝乙醇溶液均匀喷在薄膜上，在紫外光灯（366nm）下观察，结果发现3个批次供试品色谱图与水红花子对照药材色谱图在同一位置上有相同颜色的荧光斑点显现，图谱显色清晰，阴性对照未见干扰。结果见图4。
2.2含量测定[7，8]
2.2.1色谱条件
固定相：GeminiC18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每1000mL加十二烷基苯磺酸钠0.1g）；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：265nm。
2.2.2对照品溶液的制备
精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.32mg的溶液，即得。
2.2.3供试品溶液的制备
取装量差异项下的本品，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.4阴性样品溶液的制备
按处方比例分别称取除黄柏以外的其余药味，按照加味三核颗粒的制备工艺制成阴性样品，按2.2.3项下供试品溶液的制备方法制作，制备成阴性样品溶液。
2.2.5专属性实验
分别精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液，供试品溶液及阴性样品溶液各10μL，按2.2.1项下所述的色谱条件进行测定。结果表明：阴性样品溶液在盐酸小檗碱的色谱峰位置上无吸收，表明该方法的专属性良好。结果见图5。
2.2.6线性关系考察
精密称取盐酸小檗碱对照品6.40mg，置10mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀；再分别精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.6、2mL至2mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得不同浓度对照品溶液，分别进样10μL，测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X，ng）作图，得一直线回归方程：Y＝2883.1X+44363，R2＝0.9996，r＝0.9998，故盐酸小檗碱进样量在640～6400ng进样范围内，浓度与色谱峰峰面积呈良好线性。
2.2.7精密度实验
精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液（0.32mg/mL）10μL，连续进样6次，测定盐酸小檗碱峰面积积分值，其RSD为0.60%（n=6）。结果表明：该高效液相色谱仪的精密度良好。
2.2.8稳定性实验
取供试品溶液（批号20200820）在0、2、4、6、8、10、12h分别进样10μL，测定样品中盐酸小檗碱峰面积积分值，其RSD为0.97%。结果表明：供试品溶液在12h内稳定性良好。
2.2.9重复性实验
精密称取同一批号（批号20200820）的加味三核颗粒6份，按3项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，精密吸取10μL，进样，测定峰面积积分值并计算含量。结果样品中盐酸小檗碱的平均质量分数为3.9977mg/g，RSD＝1.06%。结果表明该方法重复性良好。
2.2.10回收率实验
精密称取已知含量批次样品（批号20200820，3.9977mg/g）6份，分别精密添加盐酸小檗碱对照品适量，按“供试品溶液制备”项下的方法制备供试品溶液，测定峰面积积分值，计算回收率。结果盐酸小檗碱的平均回收率为100.56%，RSD为1.46%，表明该方法测定结果的准确度较高。结果见表1。
2.2.11样品含量测定
取3批样品，按供试品溶液制备方法制备，依法测定，计算样品中盐酸小檗碱的含量。结果见表2。
3讨论
本文采用TLC法对加味三核颗粒中黄柏、补骨脂、蛇床子、水红花子进行定性鉴别，结果供试品样品与对照药材相对应的位置有相同颜色的斑点，斑点清晰，阴性对照无干扰，实验专属性强，可以作为加味三核颗粒的定性鉴别方法。黄柏是加味三核颗粒的君药，其中盐酸小檗碱为黄柏的主要药效成分，故选择盐酸小檗碱作为控制本品质量的指标性成分。实验参照《中华人民共和国药典》一部、四部及文献报道，采用HPLC法对盐酸小檗碱进行含量测定。为获得最佳的分离效果，依据参考文献进行条件摸索，最终选择检测波长为265nm[8]，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每1L流动相中加十二烷基苯磺酸钠0.1g）[4，9]。流动相在配置的过程中先配置乙腈-0.1%磷酸溶液，再加十二烷基苯磺酸钠，这样操作可以避免大量气泡的产生。本方法简便，容易操作，结果准确，可用于加味三核颗粒的质量控制。
作者：李慧峰 孟霜 冯振宇 周晓荣 王鑫鑫 裴妙荣 赵建平 单位：山西中医药大学中药与食品工程学院 山西省中西医结合医院中心实验室 山西中医药大学研究生学院