[摘要]目的:建立三金排石颗粒的定性和定量控制方法。方法:采用薄层色谱法对三金排石颗粒中所含的广金钱草、牛膝、益母草、甘草进行定性鉴别,采用高效液相色谱法测定方中君药广金钱草的特征性成分夏佛塔苷的含量。结果:实验研究建立的薄层色谱法可鉴别出广金钱草、牛膝、益母草、甘草,阴性对照无干扰;夏佛塔苷进样量在0.09082~0.9082μg范围内与峰面积呈良好的线性关系,夏佛塔苷平均回收率为103.71%,RSD为1.01%。结论:本研究所建立的方法操作简单可行,具有较好的专属性和准确度,可用于三金排石颗粒的质量控制。
[关键词]三金排石颗粒;薄层色谱法;夏佛塔苷;高效液相色谱法
三金排石颗粒主要由广金钱草、牛膝、益母草、甘草等中药组成,是广东省第二中医院院内制剂,具有清热利湿、活血祛瘀、通淋排石的功效,在临床上广泛应用于湿热下注或瘀血阻滞所致石淋者。为保证三金排石颗粒的临床用药安全和质量稳定可控,本研究基于薄层色谱定性法和高效液相色谱定量法,通过实验摸索,不断优化方法,最终建立三金排石颗粒所含药味中广金钱草、牛膝、益母草、甘草的定性鉴别和广金钱草的特征性成分夏佛塔苷的定量质量控制方法,现报告如下。
1仪器与试剂
1.1仪器。昆山KQ-700DE型超声波清洗器;上海恒温电热水浴锅;重庆PBQ-2型半自动薄层铺板机;上海DHG-9070A型恒温电热鼓风烘箱;瑞士卡玛ATS4薄层点样器;瑞士卡玛Reprostar3薄层数码成像系统;瑞士梅特勒多利托TLE-204电子天平;美国安捷伦1200/1260高效液相色谱仪。
1.2试剂。广金钱草对照药材(批号:121248-201605)、牛膝对照药材(批号:121066-201508)、益母草对照药材(批号:120912-201209)、甘草对照药材(批号:120904-201620)、夏佛塔苷对照品(批号:111912-201703,以95.6%计),均采购于中国食品药品检定研究院。三金排石颗粒(批号:20190404、20190405、20190406),由本院制剂室提供。乙腈为默克一级色谱纯,水为屈臣氏蒸馏水,甲醇、正丁醇等研究中所用其他试剂均为分析纯。
2薄层色谱定性鉴别
2.1方中所含广金钱草的薄层色谱鉴别。1)供试品、对照药材、阴性对照溶液的制备。取三金排石颗粒2.00g,加入20ml80%甲醇溶液,超声处理(功率700W,频率40kHz)提取30min,提取液置水浴锅上蒸干,再加入20ml水溶解,继用经水饱和过的正丁醇充分振摇提取2次(20ml/次),取正丁醇提取液置水浴锅上蒸干,再加入2ml甲醇复溶,制备得供试品溶液。另取广金钱草对照药材1.00g,置200ml烧杯中,加入100ml水煎煮,使之微沸30min,煎液滤过,浓缩至剩约20ml,自“继用经水饱和过的正丁醇充分振摇取2次(20ml/次)”起,同法操作制成广金钱草对照药材溶液。按照三金排石颗粒处方比例和制备工艺,制得广金钱草阴性样品,再按供试液制作方法制得广金前草阴性对照溶液。2)点样。以硅胶G薄层板为固定相,广金钱草供试品、阴性对照溶液各点样4μl,广金钱草对照溶液点样8μl。3)展开。配制三氯甲烷-甲醇-水的体积比为(10∶2.3∶1.8)的展开剂,展开。4)显色及检视。薄层板晾干后,以三氯化铝试液为显色剂,用电吹风热风吹3min后,在紫外光365nm下观察。5)结果。三金排石颗粒供试品与广金钱草对照药材薄层色谱相同的Rf值处,有相同颜色的荧光斑点对应,阴性对照无干扰。(见图1)
2.2方中所含牛膝的薄层色谱鉴别。1)供试品、对照药材、阴性对照溶液的制备。取三金排石颗粒3.00g,加入30ml甲醇,超声处理(功率700W,频率40kHz)提取30min,提取液置水浴锅上蒸干,再加入20ml水使溶解,继用经水饱和过的正丁醇充分振摇提取2次(30ml/次),取正丁醇提取液,用40%氨水溶液洗涤3次(40ml/次),弃去氨水洗涤液,将正丁醇液置水浴锅上蒸干,再加入1ml甲醇复溶,制备得供试品溶液。另取牛膝对照药材1.00g,置100ml烧杯中,加入100ml水煎煮,使之微沸30min,煎液置水浴锅上蒸干,自“加入30ml甲醇”起,同法制成牛膝对照药材溶液。按照三金排石颗粒处方比例和制备工艺,制得牛膝阴性样品,再按供试液制作方法制得牛膝阴性对照溶液。2)点样。以硅胶G薄层板为固定相,供试品、对照、阴性对照溶液各点样10μl。3)展开。配制三氯甲烷-甲醇-甲酸的体积比为(8∶2∶0.2)的展开剂,展开。4)显色及检视。以10%硫酸乙醇溶液为显色剂,在105℃烘箱中加热至斑点呈现明显,在紫外光365nm下观察。5)结果。三金排石颗粒供试品色谱与牛膝对照药材色谱相同的Rf值处,有相同颜色的荧光斑点对应,阴性对照无干扰。(见图2)
2.3方中所含益母草的薄层色谱鉴别。1)供试品、对照药材、阴性对照溶液的制备。取三金排石颗粒2.00g,加入30ml乙醇,超声处理(功率700W,频率40kHz)提取30min,提取液置具塞锥形瓶中,加入活性炭0.50g,充分摇匀,滤过,滤液置水浴锅上蒸干,残渣加入1ml乙醇复溶,制备得供试品溶液。另取益母草对照药材1.00g,置250ml烧杯中,加入150ml水煎煮,使之微沸30min后,煎液置水浴锅上蒸干,自“加入30ml乙醇”起,同法制成对照药材溶液。按照三金排石颗粒处方比例和制备工艺,制得益母草阴性样品,再按供试液制作方法制得益母草阴性对照溶液。2)点样。以硅胶G薄层板为固定相,供试品、对照、阴性对照溶液各点样10μl。3)展开。配制正丁醇-盐酸-乙酸乙酯的体积比为(4∶1.5∶0.5)的展开剂,展开。4)显色及检视。以稀碘化铋钾试液为显色剂,日光下检视。5)结果。三金排石颗粒供试品色谱与益母草对照药材色谱相同的Rf值处,有相同颜色的斑点对应,阴性对照无干扰。(见图3)
2.4方中所含甘草的薄层色谱鉴别。1)供试品、对照药材、阴性对照溶液的制备。取三金排石颗粒3.00g,加入30ml甲醇,超声处理(功率700W,频率40kHz)提取30min,提取液通过中性氧化铝柱(柱子内径粒径1.5cm,柱高8cm,氧化铝粒径为100~200目)吸附后,用80ml40%的甲醇溶液洗脱,收集洗脱液置水浴锅上蒸干,残渣加入20ml水溶解,继用经水饱和过的正丁醇充分振摇取2次(30ml/次),合并2次所得正丁醇提取液,再用经正丁醇饱和过的水充分振摇洗涤3次(40ml/次),弃去水液,将正丁醇液置水浴锅上蒸干,再加入1ml甲醇复溶,制备得供试品溶液。另取甘草对照药材0.50g,置250ml烧杯中,加入100ml水煎煮,使之微沸30min后,煎液置水浴锅上蒸干,自“加入30ml甲醇”起,同法制成甘草对照药材溶液。按照三金排石颗粒处方比例和制备工艺,制得甘草阴性样品,再按供试液制作方法制得甘草阴性对照溶液。2)点样。以硅胶G薄层板为固定相,供试品、对照、阴性对照溶液各点样10μl。3)展开。配制乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水的体积比为(15∶1∶1∶2)的展开剂[1],展开。4)显色及检视。以10%硫酸乙醇溶液为显色剂,在105℃烘箱中加热至斑点呈现明显,在紫外光365nm下观察。5)结果。供试品色谱与甘草对照药材色谱相同的Rf值处,有相同颜色的荧光斑点对应,阴性对照无干扰。(见图4)
3广金钱草中夏佛塔苷的含量测定
3.1高效液相色谱实验条件。以WatesXBridgeShieldRpC18柱(粒径:5μm,长度:4.6mm×250mm)为色谱柱;以乙腈-0.1%磷酸水溶液(13∶87)为流动相;流速为1.0ml/min;柱温为25℃;检测波长为272nm。理论板数按夏佛塔苷峰计算,应不小于1500.
3.2含量测定供试液的制备。取三金排石颗粒,研细,取约1g,精密称定重量,精密加入25ml80%甲醇,称定重量,超声处理(功率700W,频率40kHz)提取30min,取出放冷后,再次称重,用80%甲醇补足超声过程中减少的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。
3.3夏佛塔苷对照品溶液的配制。精密称取夏佛塔苷(批号:111912-201703,以95.6%计)9.50mg,置100ml容量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释定容至刻度,摇匀,制得每1ml含夏佛塔苷90.82μg的对照品溶液,作为母液。
3.4方法学考察。3.4.1专属性试验考察。取广金钱草阴性对照样品,照供试品溶液制备的方法制得阴性对照溶液。分别精密吸取对照品、供试品、阴性对照溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定。结果阴性对照溶液色谱在夏佛塔苷色谱和供试品溶液色谱相应的位置上无对应色谱峰出现,说明所建方法专属性较好,阴性对照无干扰。(见图5)3.4.2线性关系考察试验。分别精密吸取夏佛塔苷对照品储备液(90.82μg/ml)0.5、1、1.5、2.5、4、5ml,置5ml量瓶中,再加50%甲醇稀释定容至刻度,摇匀,制得每1ml中含夏佛塔苷分别为9.082、18.164、27.246、45.41、72.656、90.82μg的对照品溶液,分别依次进样10μl,按上述确定的色谱条件测定峰面积,以峰面积Y的为纵坐标,以进样对照品量X为横坐标进行线性回归,得回归方程Y=2018.35008X+9.8984016(r=0.99993),表明夏佛塔苷进样量在0.09082~0.9082μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。3.4.3精密度考察试验。精密吸取20190404批次三金排石颗粒供试品溶液10μl,连续重复进样6次,按已确定的色谱条件测定。计算夏佛塔苷色谱峰面积RSD值为0.87%,表明实验研究所用仪器精密度良好。3.4.4稳定性考察试验精密吸取20190404批次三金排石颗粒供试品溶液10μl,分别在0、3、6、9、12、15、18、21h进样,按已确定的色谱条件测定,计算夏佛塔苷色谱峰面积RSD值为1.08%,表明三金排石颗粒供试品溶液在21h内稳定。3.4.5重复性考察试验。取20190404批次三金排石颗粒样品,分别制备6份供试液,已确定的色谱条件测得峰面积并计算含量,结果夏佛塔苷平均含量为0.076%,RSD为1.56%,根据《中国药典》[1]2015年版四部通则中“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定样品中待测成分含量为0.01%时,重复性RSD%可接受范围为4%,表明该分析方法的重复性良好。3.4.6中间精密度考察试验。由本实验室其他分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作,按相同的含量测定方法,对20190404批次三金排石颗粒样品,分别制备6份供试液,测得峰面积并计算含量,结果RSD为1.40%,小于4%,表明该分析方法中间精密度良好。3.4.7加样回收考察试验。取20190404批次三金颗粒9份,每份取约0.5g,精密称定重量,分别加入一定量的夏佛塔苷对照品,按照已确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液,再按照已确定的色谱条件测定,计算夏佛塔苷回收率,结果平均回收率为103.71%,RSD为1.01%。根据《中国药典》[1]2015年版四部通则中“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定样品中待测成分含量为0.01%时,回收率限度为85%~110%,本试验回收率在限度范围内,表明所建立方法回收率良好,结果见表1。3.4.8样品测定。取三金排石颗粒,研细,取约1g,精密称定重量,精密加入25ml80%甲醇,称定重量,超声处理(功率700W,频率40kHz)提取30min,取出放冷后,再次称重,用80%甲醇补足超声过程中减少的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。测定法:分别精密吸取对照品溶液2、10μl,与供试品溶液10μl注入液相色谱仪,测定,即得。(见表2)
4讨论
广金钱草薄层色谱鉴别中,参考《中国药典》[1]2015年版一部广金钱草项下薄层色谱鉴别方法,结果供试品色谱斑点存在严重的拖尾现象,经摸索调整为样品加80%甲醇超声处理提取后,提取液蒸干,加水复溶,再用水饱和的正丁醇振摇提取,以硅胶G薄层板为固定相,以三氯甲烷-甲醇-水的体积比为(10∶2.3∶1.8)的展开剂,用三氯化铝试液显色,结果斑点圆整,分离对应良好。广金钱草是三金排石颗粒中的君药,其主要含有黄酮类化合物、生物碱类化合物、多糖类等成分[2-3],夏佛塔苷属于其中所含的黄酮类化合物,是广金钱草发挥利尿通淋、清热祛湿、预防和治疗结石作用的主要成分[4-7],同时也是2015年版《中国药典》一部广金钱草项下含量测定控制指标成分。本研究过程中曾参考《中国药典》广金钱草含量测定项下流动相条件,结果夏佛塔苷峰形差,且分离度不够;经实验摸索,调整流动相为乙腈-0.1%磷酸(13∶87),供试品色谱中夏佛塔苷色谱峰能达到基线分离,且峰形较好,且阴性无干扰,所建立的夏佛塔苷含量测定方法经方法学验证试验考察,表明该方法方便可行,准确、重复性好。综上所述,所建立的方法操作简单可行、具有较好的专属性和准确度,可用于三金排石颗粒的质量控制。
作者:李素梅 李养学 肖观林 曾志浩 单位:广东省第二中医院 广东省中医药工程技术研究院 广州中医药大学