摘要：研究余甘子鲜汁沉淀物的化学组成与资源化物质鞣花酸的提取纯化工艺。方法：收集余甘子鲜汁沉淀物，采用能谱仪、傅里叶变换红外光谱仪和超高效液相色谱与串联四极杆飞行时间质谱联用技术（ＵＰＬＣＱＴＯＦＭＳ）分析余甘子鲜汁沉淀物的化学成分；以鞣花酸含量为指标，分别采用醇提法、酶提法、碱溶酸沉法对鞣花酸进行提取纯化，且通过单因素实验优化筛选提取工艺。结果：红外分析表明，余甘子鲜汁沉淀物具有Ｃ、Ｏ元素，苯环、酚羟基等基本结构；ＵＰＬＣＱＴＯＦＭＳ结果表明，沉淀物的主要成分为鞣花酸、邻苯二甲酸二丁酯等，且鞣花酸占比最高，为３９９１％；提取工艺优化结果显示，碱溶酸沉法为较优工艺，进一步优化后得到最佳工艺参数为料液比１∶４０、ＮａＯＨ浓度２％、超声提取时间２０ｍｉｎ，该条件下得到的提取物中鞣花酸含量为４７３８％，纯度为９４２２％。扫描电镜观察表明，鞣花酸提取物粉末中有大量柱状结晶，推测为鞣花酸分子平面聚合形成。结论：余甘子鲜汁沉淀物中鞣花酸天然丰度高，可作为鞣花酸天然来源途径之一。所得到的鞣花酸提取纯化工艺步骤简单、可操作性强、成本较低、含量及纯度较高，适宜用于余甘子鲜汁固废物中鞣花酸的富集。
关键词:余甘子；固废物；鞣花酸；提取纯化；工艺优化；含量测定；质谱分析；绿色生产
余甘子ＰｈｙｌｌａｎｔｈｕｓｅｍｂｌｉｃａＬ是大戟科叶下珠属植物，其成熟果实余甘子，亦称油柑子、滇橄榄、山油甘、庵摩勒等［１］。余甘子风味独特、营养丰富、保健功能显著，具有清热凉血，消食健胃，生津止咳等功效，在降糖、调节血脂代谢、预防牙龈炎等方面作用突出［２３］，是极具特色的中藏药传统药材及药食同源品种，具有较高的大健康产品与食品开发价值［４］。余甘子鲜汁系余甘子鲜果直接压榨而成，是余甘子产品的重要形式，也是开发相关饮片及提取物的重要原料［５］。据余甘子相关生产企业调查，仅云南省境内，余甘子鲜汁半年生产周期产量已达３５００吨，预计次年年产量将突破１５０００吨。然而，余甘子鲜汁在贮存过程中会产生大量乳白色或灰白色沉淀，约占鲜汁总质量的５％～２０％。目前，相关保健品或饮料生产企业均对该类沉淀物缺乏相应的研究与认识，并将之视为生产固废物，主要采用生物氧化等方式对其进行无害化处理［４］。该处理方法不仅面临巨大的生态环境压力，还会造成资源浪费与生产成本的增加。为进一步合理利用资源，急需寻找新的解决途径。课题组前期研究显示，余甘子鲜汁沉淀中除大量植物组织残渣、杂质外，还含有大量鞣花酸，天然丰度１０％左右［６］。以此估算，沉淀物中鞣花酸资源蕴藏量极高，极具开发潜力。鞣花酸是没食子酸的二聚衍生物，具有抗氧化、抗癌变、抗诱变、抗炎、抗菌和抗病毒等作用［７］，被广泛应用于食品、医药、医疗和化妆品等领域［８９］。目前，鞣花酸主要是五倍子浸出液水解制得的，其资源有限，粗提物每吨售价２０万元以上［１０］。而合成法因制备工艺复杂，存在杂醌类物质而较少使用［１１］。余甘子固废物沉淀鞣花酸天然含量可达７％～１０％以上，单个药企年产量可达数吨到数十吨，资源蕴藏量十分可观，有望成为潜在的鞣花酸新来源。据此，本研究首先采用超高效液相色谱与串联四极杆飞行时间质谱联用技术（ＵｌｔｒａｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｔｏＱｕａｄｒｕｐｏｌｅＴｉｍｅｏｆｆｌｉｇｈｔｍａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＵＰＬＣＱＴＯＦＭＳ）结合傅里叶变换红外（ＦｏｕｒｉｅｒＴｒａｎｓｆｏｒｍＩｎｆｒａｒｅｄ，ＦＴＩＲ）光谱仪、扫描电镜等，对余甘子鲜汁沉淀物的物质基础进行分析。其次，基于沉淀物的物质构成以及鞣花酸的性质，采用醇提、酶提、碱溶酸沉法提取鞣花酸。以鞣花酸的含量、纯度、外观为指标，对鞣花酸的提取方法、提取工艺进行了优化与评价。上述研究旨在基于精细高值资源化模式，辨识余甘子鲜汁沉淀物的化学构成，优化鞣花酸富集工艺，在实现其潜在价值的同时有望降低因处理加工固废物所产生的碳排放。为构建余甘子高品质、超循环的全产业链产品体系，实现开源节流、绿色生产，推进余甘子全产业链发展提供一定参考。
１仪器与试药
１.１仪器
十万分之一分析天平（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司，德国，型号：ＢＴ２５Ｓ），万分之一分析天平（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ公司，德国，型号：ＢＳＡ２２４Ｓ），高效液相色谱仪（岛津公司，日本，型号：ＬＣ２０ＡＴ），ＭｉｌｌｉＱ超纯水仪（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司，美国，型号：ＵＰＲ１１５Ｔ），扫描电镜（赛默飞公司，美国，型号：ＦＥＩＩｎｓｅｐｅｃｔＦ５０），ＥＤＡＸＯＣＴＡＮＥＳＵＰＥＲ能谱仪（依达克斯有限公司，美国，型号：ＳＥＭ５０００），数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司，型号：ＫＱ５００ＤＥ），傅里叶变换红外光谱仪（赛默飞Ｎｉｃｏｌｅｔ公司，美国，型号：ＩＳ５０），高分辨飞行时间质谱仪（Ｗａｔｅｒ公司，美国，型号：ＳＹＮＡＰＴＸＳ），高速冷冻离心机（四川蜀科仪器有限公司，型号：ＴＧＬ１６）。
１.２试剂
鞣花酸对照品（四川维克奇生物科技有限公司，批号：ｗｋｑ２１０１０４０３，质量分数≥９８％），纤维素酶（上海源叶生物科技有限公司，货号：Ｓ１００４１５ｇ，５００Ｕ／ｍｇ），果胶酶（上海源叶生物科技有限公司，货号：Ｓ１０００７５ｇ，５０Ｕ／ｍｇ），甲醇（Ｓｉｇｍａ公司，美国，货号：ＷＸＢＤ７３６１Ｖ），磷酸（Ｓｉｇｍａ公司，美国，货号：ＷＸＢＤ２０６０Ｖ），氢氧化钠（成都市科隆化学品有限公司，批号：２０１１０７１５），盐酸（四川西陇科学有限公司，批号：２１０６０８１），乙醇（成都市科隆化学品有限公司，批号：２０２１０８２３０２）。
１.３分析样品
余甘子鲜汁沉淀物（成都市三勒浆药业集团四川华美制药有限公司提供），经真空干燥后粉碎过三号筛备用。
２方法
２.１沉淀ＦＴＩＲ分析
取溴化钾于玛瑙研钵中，在红外烤灯下研磨成细粉；转移至压片模具中，将模具置于压片机中压实，得半透明薄片，即溴化钾空白片。取余甘子鲜汁沉淀物粉末适量，与溴化钾在玛瑙研钵中研磨，压片制成样品片，将样品片置于红外光谱仪中，扫描得到样品片的一维红外光谱。
２.２沉淀ＵＰＬＣＱＴＯＦＭＳ分析
２.２.１色谱条件色谱柱ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｃｃｕｃｏｒｅＣ１８柱（１００ｍｍ×２１ｍｍ，２６μｍ）；流动相０１％甲酸水（Ａ）乙腈（Ｂ），梯度洗脱（０～１ｍｉｎ，２％Ｂ；１～２ｍｉｎ，２％～５％Ｂ；２～４ｍｉｎ，５％～７％Ｂ；４～６ｍｉｎ，７％～２４％Ｂ；６～１０ｍｉｎ，２４％～４２％Ｂ；１０～１２ｍｉｎ，４２％～５４％Ｂ；１２～１５ｍｉｎ，５４％～７６％Ｂ；１５～１８ｍｉｎ，７６％～１００％Ｂ）；流速０２ｍＬ／ｍｉｎ；柱温３０℃；进样量５μＬ［１２］。２２２质谱条件采用加热电喷雾离子源（ＨｅａｔｅｄＥｌｅｃｔｒｉｃＳｐｒａｙＩｏｎ，ＨＥＳＩ），在正、负离子模式条件下进行检测。具体参数设置如下：喷雾电压３５ｋＶ（＋）／３０ｋＶ（－），离子源温度３５０℃，鞘气流速３５ａｒｂ，辅助气流速１０ａｒｂ，离子传输管温度３２０℃，离子扫描范围ｍ／ｚ１００～１５００，碰撞能量梯度为２０、４０、６０ｅＶ。２.２.３供试品溶液制备鲜汁沉淀物：精密称定干燥后的沉淀物粉末１０ｍｇ，置于２５０ｍＬ棕色容量瓶中并用甲醇定容，称定质量，超声３０ｍｉｎ（３００Ｗ，４０ｋＨｚ），放冷，加甲醇补足减失的质量，摇匀，过０２２μｍ微孔滤膜，即得。２.２.４数据分析及成分分析将采集得到的原始数据导入ＣｏｍｐｏｕｎｄＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒ３１质谱数据处理软件中，建立未知化合物鉴定的工作流程，设置一级及二级质量偏差＜５×１０－６，进行峰提取、峰对齐。根据一级准分子离子峰质荷比获得精确质量数及化合物分子式，结合二级碎片离子信息、ＭａｓｓＦｒｏｎｔｉｅｒ软件、ｍｚＣｌｏｕｄ网络数据库、ｍｚＶａｕｌｔ本地中药成分数据库、文献报道及部分对照品比对，进行化合物的分析鉴定。
２.３沉淀物中鞣花酸的提取纯化工艺优选
２.３.１醇提法精密称定沉淀物粉末２０ｇ，配置６０％乙醇溶液，按照料液比１∶３０（ｇ／ｍＬ），于６０℃条件下回流提取８０ｍｉｎ，提取３次，于５０℃水浴中用旋转蒸发仪蒸干溶剂，取沉淀，水洗３次后干燥粉碎。２.３.２酶提法精密称定沉淀物粉末２０ｇ，配置质量浓度为２％的复合酶（纤维素酶与果胶酶质量比为２∶１）水溶液，设置料液比１∶３０（ｇ：ｍＬ），酶解温度６０℃，并使用１ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液调节ｐＨ值至４，放入恒温振荡箱中（８０ｒ／ｍｉｎ），酶解反应４ｈ，离心取沉淀，水洗３次后干燥粉碎。２３３碱溶酸沉法精密称定沉淀物粉末２０ｇ，以料液比１：５０（ｇ：ｍＬ）加入１ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液，超声（３００Ｗ，４０ｋＨｚ，３０ｍｉｎ）并离心（３０００ｒ／ｍｉｎ，离心半径６ｃｍ，离心５ｍｉｎ），取上清液，加入１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ调节ｐＨ值至３，离心（３０００ｒ／ｍｉｎ，离心半径６ｃｍ，离心５ｍｉｎ），取沉淀，水洗３次后干燥粉碎。
２.４鞣花酸含量测定
２.４.１色谱条件色谱柱ＷｅｌｃｈｒｏｍＣ１８柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相０２％磷酸水溶液（Ａ）甲醇（Ｂ），梯度洗脱（０～６ｍｉｎ，５％Ｂ；６～１５ｍｉｎ，５％～７％Ｂ；１５～２０ｍｉｎ，７％～１５％Ｂ；２０～２５ｍｉｎ，１５％～２１％Ｂ；２５～３１ｍｉｎ，２１％～２２％Ｂ；３１～４１ｍｉｎ，２２％Ｂ；４１～４７ｍｉｎ，２２％～２８％Ｂ；４７～５１ｍｉｎ，２８％～３２％Ｂ；５１～５７ｍｉｎ，３２％～３８％Ｂ；５７７０ｍｉｎ，３８％～４５％Ｂ；７０～８０ｍｉｎ，４５％～６５％Ｂ）；检测波长２７０ｎｍ；体积流量１０ｍＬ／ｍｉｎ；柱温２５℃；进样量１０μＬ［１３］。２４２对照品溶液的制备精密称取鞣花酸对照品适量，置于１０ｍＬ棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度制成浓度为９９μｇ／ｍＬ的鞣花酸对照品溶液。称定质量，超声３０ｍｉｎ使溶解，静置冷却至室温，加甲醇补足减失的质量，摇匀，过０２２μｍ微孔滤膜，即得。２４３供试品溶液的制备鲜汁沉淀物：制备方法同２２１项下。鞣花酸提取物：制备方法同２.２.１项下。２.４.４精密度实验取２４２项下制备的鞣花酸对照品溶液适量，按２.４.１项下色谱方法条件连续进样６次，计算相对标准偏差（ＲｅｌａｔｉｖｅＳｔａｎｄａｒｄＤｅｖｉａｔｉｏｎ，ＲＳＤ）。２.４５线性关系考察将“２.４.２”项下制备的鞣花酸对照品溶液，按照“２２１”项下色谱条件进样，进样体积分别为３、５、７、１０、１３、１５μＬ，以峰面积为纵坐标（Ｙ），对照品质量浓度为横坐标（Ｘ），绘制标准曲线。２.４.６重复性实验取同一批果汁沉淀粉末，按“２.４.３”项下方法平行制备供试品溶液６份，按照色谱方法条件进行测定，计算ＲＳＤ。２５扫描电镜能谱仪检测采用扫描电子显微镜（ＳｃａｎｎｉｎｇＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＳＥＭ）对余甘子鲜汁沉淀粉末、鞣花酸提取物粉末进行表面微观分析。分别取干燥后的样品粉末，将样品粉末均匀分布于导电胶表面，用洗耳球吹去小颗粒，采用真空镀膜法在４Ｐａ以下高真空、电流２０ｍＡ条件下喷镀铂金属２ｍｉｎ使样品导电。仪器的加速电压为１００ｋＶ，工作距离为９８ｍｍ。在扫描电镜１０００倍镜下，联用能谱仪对余甘子果汁沉淀进行表面元素分析。
３结果
３.１沉淀粉末元素分析
在扫描电镜５０００倍镜下，联用能谱仪对供试品表面元素进行分析。见图１。元素分析结果发现，沉淀中Ｃ元素相对含量为４３０８％，Ｏ元素相对含量为５３８５％，为主要元素，还含有少量的Ｃｌ，Ｋ等其他元素。见表１。
３.２ＦＴＩＲ结果分析
由沉淀的ＦＴＩＲ谱图可见，在３２８８１７５０～３４１７３８７０、１７２０２６５０、１４５２１９７０～１６２１９０９０、１１１８５５８０、１０５９７３７０、９１９９１７５、６６７２７７６ｃｍ－１处检查到主要吸收峰度，其中３２８８１７５０～３４１７３８７０ｃｍ－１是酚羟基拉伸振动吸收峰，１７２０２６５０ｃｍ－１可能为芳香酮振动吸收峰，１４５２１９７０～１６２１９０９０ｃｍ－１为苯环骨架振动吸收峰，１１１８５５８０、１０５９７３７０ｃｍ－１为ＣＯ伸振动吸收峰，９１９９１７５ｃｍ－１可能是ＯＨ弯（面内）振动吸收峰，６６７２７７６ｃｍ－１可能是ＮＨ２振动吸收峰。
３.３沉淀化合物的分析与鉴定
从余甘子鲜汁沉淀物中共鉴定出１２种化合物。见表２。由表２信息可知，余甘子原汁沉淀中鞣花酸占比为３９９１％，为沉淀中天然丰度最高的物质。其次，较高含量的为没食子酸、柠檬酸、苹果酸。此外，还检测到一些氨基酸，例如脯氨酸、谷氨酸、异亮氨酸。
３.４鞣花酸提取工艺筛选与优化
３.４.１方法学考察１）精密度考察：各色谱峰相对保留时间的ＲＳＤ值均＜０１％，相对峰面积的ＲＳＤ均在２０％之内，表明仪器的精密度良好。２）线性关系考察：由“２４５”项下方法得到鞣花酸线性回归方程为：Ｙ＝９１４１１Ｘ＋１３４７１（Ｒ２＝０９９９２）。结果表明鞣花酸浓度在２９７～１４８５μｇ／ｍＬ内线性关系良好。３）重复性试验：各色谱峰相对保留时间的ＲＳＤ均＜０１％，相对峰面积的ＲＳＤ均在２０％之内，提示本方法重复性良好。３.４.２纯化工艺筛选结果显示了工艺１（醇提法），工艺２（酶提法），工艺３（碱溶酸沉法）３种工艺提取制备得到的鞣花酸粗品的色谱图，可直观看出工艺３对鞣花酸的提取纯化效果显著，因此确定较优工艺为碱溶酸沉法。见图３。３.４.３碱溶酸沉法工艺优化１）料液比。设置氢氧化钠溶液浓度为１５％，超声提取３０ｍｉｎ。设置料液比分别为１∶２０，１∶３０，１∶４０，１∶５０。考察不同料液比对鞣花酸含量的影响。由图４Ａ可以看出，料液比对鞣花酸含量有显著影响。鞣花酸含量随料液比增加呈现先增高后降低的趋势。料液比为１∶４０时，鞣花酸含量最高。当鞣花酸完全溶出后，进一步增加溶剂体积，鞣花酸含量不但不会增加，且还可能由于体积过大，鞣花酸分子分散程度高，不利于后续酸性条件下鞣花酸结晶的析出，呈现下降趋势。因此，确定较优的料液比为１∶４０。２）超声提取时间。设置料液比为１∶４０，氢氧化钠溶液浓度为１５％。设置超声提取时间分别为１０ｍｉｎ，２０ｍｉｎ，３０ｍｉｎ，４０ｍｉｎ。考察不同超声提取时间对鞣花酸含量的影响。图４Ｂ为超声时间对鞣花酸含量的影响。当超声提取时间为２０ｍｉｎ时，鞣花酸含量呈最大值。因此，确定较优的超声提取时间为２０ｍｉｎ。３）ＮａＯＨ浓度。设置料液比为１∶４０，超声提取３０ｍｉｎ。设置氢氧化钠溶液浓度分别为１％，１５％，２％，２５％。考察不同ＮａＯＨ浓度对鞣花酸含量的影响。图４Ｃ为ＮａＯＨ溶液浓度对鞣花酸含量的影响。鞣花酸含量随ＮａＯＨ浓度增大呈先升高后降低的趋势。氢氧化钠浓度在１％～２％范围内时，随着浓度增加，鞣花酸得率呈增长趋势。当ＮａＯＨ浓度超过２％时，鞣花酸得率显著降低，这可能与ｐＨ过高导致其他不溶性沉淀溶出，使最终提取物中鞣花酸的含量降低有关。因此，确定２％的ＮａＯＨ溶液较优。３.４.４鞣花酸含量及纯度分析本研究对鞣花酸的碱溶酸沉提取纯化工艺进行优化，优化得到的工艺参数为：料液比１∶４０（ｇ∶ｍＬ）提取时间２０ｍｉｎ，氢氧化钠浓度２％。由沉淀物的色谱相关数据计算可得，沉淀中鞣花酸的平均天然丰度为２０１％。以优化后的碱溶酸沉工艺对鞣花酸进行提取，通过色谱相关数据计算得到鞣花酸含量为４７３８％，纯度（峰占比）为９４２２％。图４不同工艺参数对鞣花酸含量的影响注：Ａ不同料液比；Ｂ提取时间；ＣＮａＯＨ浓度
３.５纯化前后样品表面形态分析
采用扫描电子显微镜对纯化前后的样品粉末进行分析。由图５Ｃ和５Ｄ可见，沉淀物粉末颜色呈淡黄色，而纯化后的粉末色泽呈深绿色。将提取前的沉淀物粉末与鞣花酸提取物分别置于扫描电镜下（×１０００）观察。由图５Ｅ可见，沉淀物粉末中含有大量晶状、纤维状、不规则块状的植物组织。由图５Ｆ可见，提取物粉末主要为柱状晶体，且部分聚集成簇状。推测为鞣花酸分子平面聚合形成。
４讨论
近年来，我国中药制药行业与大健康产业快速发展，已逐渐成为部分地区社会经济发展的重要引擎之一。但中药工业化生产阶段、生产过程中会产生大量固废物，这些固废物由于缺乏有效利用途径而被废弃，不仅造成资源的严重浪费，还伴随大量的碳排放［１４］。随着我国“３０６０双碳目标”稳步推进，如何实现多层次的中药生产固废物资源化利用模
作者:李格菲 谭庆刍 林俊芝 罗传红 樊三虎 曹志坚 张定 黄浩洲 韩丽 单位:成都中医药大学药学院 创新产业研究院 西南特色中药资源国家重点实验室 成都中医药大学附属医院 代谢性疾病中医药调控四川省重点实验室 成都市三勒浆药业集团四川华美制药有限公司 楚雄州百草岭药业发展有限公司