1引言 嗜盐菌指能在高盐环境下生长的微生物，它主要生长在盐湖、死海、盐场等浓缩海水中以及一些盐制品中。而来源于最适盐浓度超过2.5mol/L嗜盐菌中的蛋白称为嗜盐蛋白。这些蛋白成为目前研究其稳定性机制的主要模式蛋白[1]。嗜盐蛋白嗜盐机理引起了众多研究者的关注，目前认为主要有以下一些原因[2]：1.盐桥，嗜盐蛋白表面引入了酸性氨基酸(Asp、Glu)残基，与碱性氨基酸(Lys、Arg)残基形成盐桥(saltbridge)，消除盐离子的屏蔽效应，使分子结构具有刚性；2.溶剂可接触表面，嗜盐蛋白通过减少接触表面从而有利于保持折叠，而酸性氨基酸的增加和lys的减少正好有利于这一变化。上述特点均和蛋白分子中氨基酸组成有关。显然，嗜盐蛋白在氨基酸使用上与其同源的非嗜盐蛋白存在明显差异。然而，目前尚未见有关嗜盐蛋白质中氨基酸使用偏好与其理化性质之间联系的研究，而这在嗜热[3]、嗜冷[4]等极端蛋白质中却得到较深入研究。近年来，几种嗜盐微生物全基因组及蛋白质组注释的完成为本研究提供了可能。本文统计了362对嗜盐及非嗜盐同源蛋白，对其分别进行两两比对，通过统计同源位点氨基酸取代的情况，计算出20种氨基酸的嗜盐不对称指数，并同其243种物理化学性质的进行相关性分析，发现其中存在明显相关性的理化性质，为研究嗜盐蛋白稳定性机制提供了新视角，报道如下。 2材料与方法 2.1数据来源 选取了极端嗜盐细菌Salinibacterruber及与其在进化上比较接近的非嗜盐菌Pelodictyonluteolum的全蛋白质组序列，这两种菌基因组GC含量也接近，也避免了由于基因组GC含量差异导致氨基酸使用偏向性。这些序列来源于Uniprot数据库[5]，分别得到6078及2080条蛋白质序列。 2.2同源序列的获取及序列比对 为了减少信息冗余，剔除了所得序列中所有长度小于100个氨基酸的序列，因为它们大多为片断（fragment）或者部分（partial），同时也剔除了其中注释为膜蛋白的序列。同源序列（orthologs）的选取用BlastP程序，E值为1.0×10-10，找出90%长度覆盖范围内，同一性（identity）大于30%的同源蛋白序列。最后共得到362对同源序列。该样本量足够用于探测嗜盐蛋白在氨基酸使用上的某种趋势。获得同源序列后，将这362对同源蛋白两两进行比对，以统计同源蛋白在某些位点氨基酸发生突变的情况，进行比对的软件为ClustalX。本文共统计了108701个氨基酸，其中52102个氨基酸在相应位点发生了突变。 2.3嗜盐不对称指数的计算 在正常情况下，两种氨基酸发生互相突变的几率应该是50:50的比例，即各占50%的几率。若受到某种因素影响，就会偏离这种几率，偏离程度越大，表明该因素的影响越大。嗜盐不对称指数（Halophilicasymmetryindex，HAI）就是基于这种理念进行计算的。本文采用JohnH.McDonald等计算嗜热不对称指数的方法。修订后的计算公式为：ln(/)(1)ABBAABQQ=HAIhAI式中，A表示非嗜盐蛋白中某位点的氨基酸，B表示嗜盐蛋白质对应位点的氨基酸，ABQ表示非嗜盐蛋白中氨基酸A出现的位点在嗜盐蛋白相应位点被B氨基酸取代的比例，BAQ的意思则相反。具体计算过程详见文献[6,7]。最近，McDonald对该算法进行了修订，将指数值的中点数从1改为0，他认为这能更敏感的反应数据的特性[6]。 2.4氨基酸理化性质及相关性分析 文中使用了243种氨基酸的理化性质，如：亲疏水性、极性、分子量、等电点、分子表面可及性、分子体积、热容、吉布斯自由能、形成各种二级结构的倾向性、电荷分布、侧链相互作用参数、平均柔性指数、长距离相互作用、范德华体积、熵、非共价键自由能等。这些数据来源于APDbase数据库[8],网址为：www.rfdn.org/bioinfo/APDbase/index.html。将计算所得20种氨基酸的嗜盐不对称指数同上述243种理化性质分别进行相关性分析，选取相关系数较大（大于0.5），显著性较高（小于0.05）的理化性质进行分析。 3结果与分析 3.1嗜盐环境对氨基酸使用偏好的影响 通过统计嗜盐及非嗜盐同源蛋白在相应位点某种氨基酸突变的总趋势，可得到一个完整的两种类型蛋白中氨基酸使用偏性的模式，从而看出嗜盐环境对氨基酸使用偏好的影响，所得结果如表1所示。表中HAI值越大，表明该氨基酸更容易出现在嗜盐蛋白中，其嗜盐性能越强。例如：非嗜盐蛋白中除Asp（天冬氨酸）以外的其它19种氨基酸向嗜盐蛋白中Asp突变的总数量为2246个，而嗜盐蛋白中除Asp（天冬氨酸）以外的其它19种氨基酸向非嗜盐蛋白中Asp突变的总数量为4515个，这说明Asp更容易出现在嗜盐蛋白中，因此，其嗜盐不对称指数（HAI）最大，为0.835，其嗜盐性能也最强。其次分别为Glu（谷氨酸，E）、Pro（脯氨酸，P）及Gln（谷氨酰胺，Q）。而Phe（苯丙氨酸，F）、Met（甲硫氨酸，M）、Lys（赖氨酸，K）及Ile（异亮氨酸，I）则为最不嗜盐氨基酸，其HAI值从-0.512到-0.685不等。Asp和Glu为酸性氨基酸，在正常生理条件下带负电，而Lys为碱性氨基酸，在正常生理条件下带正电，前者在嗜盐蛋白中含量更高，而后者则更低[9]。因此，Asp和Glu的HAI值大，而Lys的HAI值则很小。Phe和Met非常容易形成β-折叠，而较多的β-折叠对于嗜盐蛋白的稳定性有不利影响，因此，这两个氨基酸的HAI值也较小。然而，Pro的刚性较强，过多的Pro容易导致蛋白分子刚性太强，不利于其稳定性[10]，同时，Pro很容易出现在转角和无规则转曲中，是强烈的转角和转曲形成子；而较多转角或无规则转曲会使蛋白质结构更柔性，从而增加其稳定性[11]。可能在嗜盐蛋白中Pro主要是通过后一种机制增强嗜盐蛋白的稳定性。与此同时，虽然Ile的侧链为分支的异丙基，能更有效提高蛋白分子表面的柔性，增加其稳定性[12]，但是，Ile也同时强烈的β-折叠形成子，过多的β-折叠会导致嗜盐蛋白不稳定，因此，其HAI最小，嗜盐性能最低。 3.2氨基酸嗜盐不对称指数与其理化性质相关性分析#p#分页标题#e# 将计算所得HAI值与氨基酸的243种理化性质分别进行相关性分析，得到了相关系数较大（r>0.50,p<0.05）的16个理化性质，如表2所示。这16个理化性质包括氨基酸亲疏水性参数、极性、自由能、非共价键能量、二级结构参数等，其中与二级结构参数相关的理化性质最多，达到6个，这说明嗜盐和非嗜盐蛋白在二级结构上可能存在较大差异。在这16个理化性质中，有5个与HAI值呈正相关，其它均为负相关。 在5个正相关的理化性质中，有两个与分子极性有关，极性越强，其HAI值越高，越容易出现在嗜盐蛋白中，处于分子表面的极性氨基酸会和起所处的溶液中的水分子发生相互作用，形成氢键或者静电引力（又称水合作用），从而增强蛋白质的稳定性，而这有可从另一理化参数——回归分析相关系数得到印证。该参数主要是反映蛋白质分子中氨基酸与溶剂相互作用面积[13]。极性越强的氨基酸与溶剂分子相互作用的面积越大，对嗜盐蛋白的稳定性的作用也就越强。因此，该参数与HAI值相关性最强，其相关系数为0.569（见图1及表2），p值为0.008，达到极显著水平。而与之对应的则是一组与HAI值呈负相关的和疏水性相关的参数，在11个与HAI呈负相关的参数中，与疏水性有关的有5个，占45.5%。疏水性氨基酸一般均为非极性氨基酸，多属于脂肪族氨基酸，减少疏水性氨基酸对嗜盐蛋白的稳定性有积极作用。而主成分因子I（PrincipalcomponentI）主要反映的是氨基酸侧链的长度[14]，他与HAI值呈负相关，说明嗜盐蛋白中倾向于使用侧链较短的氨基酸。而侧链较小的氨基酸其体积也较小，空间位阻小，容易占据蛋白分子内外空间，有助于蛋白质折叠。 β-折叠构象的自由能（Freeenergyinbeta-strandconformation）是指把某一个氨基酸放在β-折叠结构中由自由态转化为固定态时所需的能量[15]。它反映了各种氨基酸对β-折叠这种二级结构的倾向程度，自由能越大，说明这个氨基酸对β-折叠倾向越小，该参数与HAI值正相关，而与之想对应的参数氨基酸在β-折叠中归一化的出现频率（Normalizedfrequencyofbeta-sheet）则刚好与HAI负相关，进一步说明在嗜盐蛋白中β-折叠含量较低。这两种参数与HAI值的相关系数分别为0.527和-0.585。而与HAI值相关性最强的是优化的β结构-无规则卷曲平衡常数（Optimizedbeta-structure-coilequilibriumconstant），该参数是反映同源蛋白三级结构一致性的重要参数，它主要是反映氨基酸对β-折叠的趋向性[16]。对β-折叠趋向性越高其HAI越小，同样也说明嗜盐蛋白中β-折叠含量较少，它与HAI的相关系数为-0.646，p值为0.002，表明这种相关性达到极显著水平（见图2及表2）。而在11个与HAI值负相关的参数中，同β-折叠有关的参数有4个，占36.4%。 4小结 高盐环境会影响蛋白质的折叠从而导致其结构的不稳定，而嗜盐蛋白在高盐环境中既保持了良好的稳定性又具有很好的溶解性，这与其自身独有的与溶剂相互作用及高级结构有关[17]。这种独特的方式引起了众多研究者的关注，他们从基因组及蛋白质组等方面对嗜盐蛋白嗜盐机理进行了研究并从中找出了某些特定的氨基酸使用倾向[2,9]。但有关氨基酸这种使用偏向与其自身理化性质之间的联系却未见报道。因此，了解这种相关性有助于更深入了解嗜盐蛋白稳定性的机制，对指导其后续的改造具有重要意义。 本文严格选取了362对嗜盐及非嗜盐同源蛋白，通过统计对应位点氨基酸取代情况并在此基础上计算其HAI值并与氨基酸的243种理化性质进行相关性分析。其中与氨基酸嗜盐不对称指数最为相关的理化性质主要是氨基酸的亲疏水性及β-折叠倾向性。这是由于在高盐浓度的环境中，水活度降低，为了使嗜盐蛋白的水化层不被破坏，减少其表面的疏水成分增加亲水成分，从而增加其溶解性的同时加强稳定性。而β-折叠结构的减少也可使嗜盐蛋白三级结构在增强刚性的同时（α-螺旋增加）也可加强分子的柔性（无规则卷曲增加），使二者达到一个良好的平衡，从而使分子结构更为稳定[18]。
