随着农业经济的迅速发展，灌溉面积和灌溉用水量不断增加，化肥施用量也不断增加，由于灌溉技术落后和化肥的有效利用率较低，农田灌溉退水污染成为亟待解决的问题(曹仁林和贾晓葵，2001)。宁蒙灌区地处黄河中上游，年退水30亿m3，主要污染物为氮、磷和COD，其中造成超标污染物主要为氮(张爱平等，2008)，对灌区水环境和黄河水安全构成了严重影响。 人工湿地利用基质-微生物-植物这个复合生态系统，具有独特而复杂的净化机理(潘丽娟和阳小成，2008)，与传统的污水处理法相比具有基建、运行费用低，操作与维护简单等优点(梁继东等，2003)。微生物在人工湿地氮素的去除过程中发挥着关键作用，张列宇等(2010)认为，氨化-亚硝化-硝化-反硝化是湿地中脱氮的最主要途径。反硝化细菌的反硝化反应则是使硝酸盐氮重新回到大气的主要途径(方芳和陈少华，2010)，因此高效反硝化细菌的获得对人工湿地的构建，解决农灌退水污染具有重要意义。 研究表明，好氧反硝化细菌克服了传统的反硝化细菌只能在缺氧条件下进行反硝化作用的缺点，有氧生长，生长周期短，对高浓度的氮耐受力很强(Jooetal．，2005;周立祥等，2006)，好氧反硝化细菌的发现，为生物脱氮技术注入了新的活力。但是现在发现的好氧反硝化细菌为数不多(Patureauetal．，2000;黄运红等，2007;王弘宇等，2007)，而高效的好氧反硝化细菌则更少(朱晓宇等，2009)。已发现的菌株中假单胞菌属最为常见(李卫芬等，2011)，关于芽孢杆菌属的报道相对较少。本研究涉及的人工湿地示范基地建在内蒙古自治区巴彦淖尔市乌拉特前旗境内，所在环境条件恶劣，盐碱化程度较高，有关能够适应此环境的高效好氧反硝化芽孢杆菌的研究鲜见报道。 因此，本研究在天然湿地底泥中分离出高效好氧反硝化芽孢杆菌，对其进行生物学鉴定，确定其在分类学上的地位，并在实验室条件下对细菌反硝化特性进行系统的研究，充分认识湿地系统优势好氧脱氮芽孢杆菌的脱氮特性，为今后工程实践及强化微生物脱氮技术提供参考。 1材料与方法 1.1样品来源 2010年6月采自内蒙古巴彦淖尔市乌梁素海底泥，风干，保存于纸袋中。 1.2培养基 菌株分离培养基(NA):牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂20.0g，pH7.2～7.4，蒸馏水1000mL。硝酸盐还原产气培养基:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，KNO31.0g，pH7.2～7.4，蒸馏水1000mL。种子培养基:葡萄糖10.0g，CaCl20.2g，MgSO4•7H2O0.5g，(NH4)2SO42.0g，KCl0.2g，乙酸钠3.32g，pH7.2～7.4，蒸馏水1000mL。反硝化基础培养基:KNO32g，MgSO4•7H2O1g，KH2PO40.5g，葡萄糖10g，pH7.2～7.4，蒸馏水1000mL。菌株生理生化鉴定培养基参照文献的方法(东秀珠和蔡妙英，2001)。 1.3芽孢杆菌的分离 称取1g样品放入装有9mL无菌水的试管中，80℃水浴20min，充分振荡混匀，取1mL到下一个同样的试管中，依次稀释得到各种浓度的菌悬液。分别取10－5～10－73个稀释梯度的稀释液0.1mL涂布于NA平板上，然后倒置于37℃培养箱中培养24h。挑取不同形态的单菌落转接至NA斜面上，37℃恒温培养24h，置于4℃冰箱保存备用。所挑取菌落同时在NA培养基平板上划线检验纯度。 1.4反硝化芽孢杆菌的筛选 将1.3分离得到的菌株进行硝酸盐还原试验，具体方法参照文献(东秀珠和蔡妙英，2001)。对于能利用硝酸盐并且产气的试验菌株接种到反硝化基础培养基，37℃，200r•min－1，摇床震荡培养，离心取上清，测定总氮含量。根据氮含量的变化进一步确定优势菌株。总氮的测定采用过硫酸钾氧化紫外分光光度法(魏复盛等，2002)。 1.5菌株TGR30的鉴定 1.5.1形态与生理生化鉴定菌株的形态学鉴定 与生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英，2001)进行。 1.5.2基因组DNA的提取及16SrDNA鉴定 参考Kim等(1995)和Rainey等(1996)的方法提取细菌基因组DNA，以琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。扩增引物为通用引物(Claudiaetal．，2002)，正向引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;反向引物1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反应体系、扩增程序以及产物的检测参照胡朝松等(2009)方法。纯化后的PCR产物送宝瑞通生物技术(北京)有限公司测序分析。将测序结果用BLAST软件与GenBank中已登录的16SrRNA基因序列进行同源性比较，通过CLUSTALX和BIOEDIT等软件进行多重序列比对分析，并以Neighbor-joining法构建系统发育树(Sai-tou＆Nei，1987)。1.6反硝化细菌TGR30的反硝化特性测定方法 1.6.1碳源 主要考察醋酸钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、蔗糖、柠檬酸三钠、可溶性淀粉、琥珀酸钠、甘露醇、麦芽糖、乳糖对菌株反硝化特性的影响。将不同碳源分别以2%的添加量代替反硝化基础培养基中的葡萄糖，同时有不加碳源的培养基作对照。将试验菌株经纯培养18h后按8%的接种量加入到添加不同碳源的发酵培养基中，37℃，200r•min－1摇床振荡培养66h后取样测定总氮含量。 1.6.2碳氮比 试验中C/N均以碳源与氮源的质量比计算。反硝化基础培养基中KNO3浓度始终为2g•L－1，添加1.6.1小节中的最优碳源，碳源添加量根据试验调整，其他成分不变。菌株培养方法以及取样测定方法同1.6.1。 1.6.3盐浓度 培养基中的盐浓度以NaCl的含量计，设0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%8个梯度，将试验菌株经纯培养18h后，按8%的接种量接入培养基中，37℃，200r•min－1摇床振荡培养66h后取样测定总氮含量。#p#分页标题#e# 1.6.4pH将试验菌株经纯培养18h后，按8%的接种量分别接种于初始pH为4、5、6、7、8、9、10、11、12的改良后的反硝化培养基中，37℃，200r•min－1下摇床振荡培养66h后取样测定总氮含量。 1.6.5培养液DO 在上述试验的基础上，选择最适碳源、碳氮比以及pH的反硝化培养基，通过改变摇床转速的方式调节培养液DO的变化，分设150、180、210、240r•min－14个梯度，37℃培养66h后取样测定总氮含量，比较菌株在不同溶解氧下的反硝化性能。 1.7数据处理 试验结果用平均值±标准方差(n=3)表示。运用SPSS11.5软件进行统计分析。 2结果与分析 2.1菌株筛选和鉴定 2.1.1菌株筛选 应用加热富集芽孢杆菌的方式从样品中共分离得到56株芽孢杆菌，通过硝酸盐还原产气试验确定28株具有硝酸盐还原活性，通过摇瓶发酵培养的方式对其反硝化活性进行检测，发现菌株TGR30的反硝化活性最高，96h时脱氮率为56.6%，最终选取TGR30为后续试验的研究对象。 2.1.2反硝化芽孢杆菌TGR30的鉴定 1)菌落和菌体形态特征。观察在NA培养基中生长24h的菌落，菌落成乳白色，个体较大，圆形，不透明，边缘整齐，表面湿润有光泽，无褶皱，无隆起。菌株TGR30经结晶紫染色后显微镜下观察菌体呈杆状散在或成串分布，革兰氏染色呈阳性，芽孢呈椭圆形，中生。 2)生理生化试验。按东秀珠和蔡妙英(2001)的方法进行生理生化试验，结果见表1。综合供试菌株TGR30的形态特征及生理生化特性，对照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》(布坎南和吉本斯，1984)中相应属、种的有关性状，初步将供试菌株TGR30归入芽孢杆菌属。 3)16SrDNA序列分析。将测得的16SrDNA序列(1436bp)与GenBank中所有已测定的原核生物的16SrDNA序列进行比对，使用PHYLIPprogrampackage软件处理所得数据，得到了该菌株及相应标准菌株的进化距离并构建了系统发育树(图1)。由比对结果可知，与供试菌株16SrDNA序列相似性较高的参比菌株均属于芽孢杆菌属。另外该菌与参比菌株Bacillusmegaterium的相似性最高，达到了100%，同时结合菌落形态以及生理生化试验结果，确定该菌属于巨大芽孢杆菌(Bacillusmegate-rium)。 2.2反硝化细菌TGR30反硝化特性的影响因素 2.2.1不同碳源对菌株反硝化特性的影响 在生物反硝化系统中，反硝化细菌可以利用碳源作为电子供体、硝酸盐氮作为电子受体将硝酸盐还原成氮气，同时达到去除有机物的效果(王弘宇等，2007)，可见碳源是生物反硝化过程所必不可少的一种物质。目前发现的绝大多数好氧反硝化菌是异养菌，很多以有机碳作为能源(梁书诚等，2010)。从图2可以看出，该菌不能利用醋酸钠，酒石酸钾钠，柠檬酸三钠为反硝化碳源，这和有些报道的菌株不同(李秀婷等，2010);以琥珀酸钠作为唯一碳源脱氮率为15.1%;当以有机碳源为唯一碳源时，与未加碳源的对照组相比反硝化性能有明显的提高，其中尤以可溶性淀粉效果最佳，氮去除率最高，为60.3%，蔗糖次之，同时能利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖以及甘露醇脱氮，说明该菌具有相对较广泛的碳源谱。 2.2.2碳氮比对菌株反硝化特性的影响 不仅碳源种类对反硝化特性有影响，C/N也在反硝化过程中起着很重要的作用，Cervantes等(1999)认为C/N是在呼吸过程中获得高效反硝化效率的主要控制参数。一些研究证实，在一个适当的范围内，作为能源的碳源浓度越高，好氧反硝化速率越快(Robertson＆Kuenen，1983)。为了明确C/N与菌株反硝化特性的关系，试验中以2.2.1小节中显示的最优碳源可溶性淀粉为唯一碳源，通过改变碳源的量来调整碳氮比。由图3分析，当C/N≤14时氮的去除率随C/N的增高呈现明显上升趋势，C/N＞14时反硝化特性变化不明显，基本维持在70%左右。由此分析可知，碳源的量对菌体生长和反硝化效率起着重要的作用。如果碳源不足，就没有足够的电子流来提供足够的能源以供菌体生长，相应地反硝化效率也会变低。但是，当提供的碳源远高于菌体的需求，此时碳源已非限制性因素，菌体的生长和代谢活性处于稳定阶段，反硝化脱氮效率也增加不多。 2.2.3盐浓度对菌株反硝化特性的影响 鉴于该菌将要应用的人工湿地系统盐碱化程度较高，本试验考察了盐度对菌株反硝化特性的影响。TGR30在0～14%的盐度范围都表现出了生长特性，当盐浓度低于8%时菌株都能较好的生长，当盐浓度进一步提高，菌体生长比较缓慢，培养液中的菌密度降低，势必造成代谢活动的减弱。而菌株的脱氮活性与菌株的生长趋势息息相关，由图4分析可知，菌株在盐浓度低于6%时脱氮效率无明显的差异，均维持在80%以上;盐浓度进一步升高时，脱氮活性明显降低。由此分析，该菌株具有一定的耐盐性，同时具有相对较高的脱氮活性。2.2.4不同pH对菌株反硝化特性的影响徐亚同(1994)研究了pH值对反硝化的影响，认为pH值会显著地影响反硝化速率。另有资料表明(方晶晶等，2010)，pH值能影响反硝化的最终产物，当pH值超过7.3时，终产物为氮气，低于7.3时，终产物为N2O。图5表明，pH值对TGR30菌株的反硝化能力影响显著。不同pH值下，反硝化效率不同，pH4～8时氮去除率呈现上升的趋势，在pH8时氮的去除率达最高为91.9%，pH9～12时氮的去除率略有降低，但均在80%以上。由上可知，在该菌在偏碱性的环境下反硝化活性优于酸性环境，同时表明该菌具有较广泛的酸碱耐受性。 2.2.5DO对菌株反硝化特性的影响 Huang和Tseng(2001)研究指出，溶解氧是细菌进行好氧反硝化的关键因素。在不同转速下，摇瓶溶液含有不同的溶解氧，对菌株TGR30的生长和代谢产生影响，从而影响了反硝化效率，其结果如图6所示。可以看出，随着转速的增加溶解氧浓度增高，反硝化效率呈上升趋势，当转速为210r•min－1(DO为4mg•L－1)时脱氮率最高为92%;当转速进一步增加脱氮率略有下降。#p#分页标题#e# 3讨论 本试验采用加热富集、平板稀释涂布的方式进行菌株分离，结合硝酸盐还原试验以及总氮的定量分析，确定TGR30为筛选到的优势菌株;经形态学观察、生理生化试验以及16SrDNA序列分析，确定其为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)。而芽孢杆菌被公认为具有强大的生命力，抗逆性强，易于生产、运输和保藏等特点，因此该菌株具有开发成微生态制剂的潜在应用价值。 目前，芽孢杆菌属的一些菌种如蜡状芽孢杆菌(B．cereus)、枯草芽孢杆菌(B．subtilis)、地衣芽孢杆菌(B．licheniform)凝结芽孢杆菌(B．coagulans)，均有文章报道其具有好氧反硝化性能(Kimetal．，2005;杨希等，2008;安健等，2010)，并未发现对于巨大芽孢杆菌有类似的报道。本研究发现，巨大芽孢杆菌同样具有反硝化功能，并且脱氮率达到了91.9%，表现出了良好的脱氮效果，丰富了反硝化细菌的菌种资源。碳源是细菌赖以生长的重要能源，对细菌反硝化作用有重要影响，C/N在反硝化过程中也起着重要作用。由于代谢机理、电子传递途径的差异，所需的碳源以及C/N呈现多样性。王弘宇等(2007)研究表明，菌株X31以丁二酸盐和乙酸盐作为碳源时，其脱氮效果均要明显好于苹果酸盐，最适宜的碳氮比是5～6;刘咏等(2011)通过对Klebsiellasp.DB-1的研究，发现该菌在以乙酸钠为碳源，采用碳氮比为3时的反硝化效率最高;而本研究筛选到的菌株TGR30在以可溶性淀粉为唯一碳源，C/N为14时脱氮活性最佳。由此可见，不同反硝化细菌达到反硝化最佳效果要求的碳源以及碳氮比并不相同，呈现出多样性。同时该菌能利用乳糖、葡萄糖、蔗糖等多种有机碳源进行反硝化活动，说明该菌具有较广范的碳源谱。 pH同样对细菌反硝化作用的发挥有较大影响，pH过高或过低均会抑制反硝化还原酶的活性(杨希等，2008)。另有研究表明(Gupta，1997)，细菌反硝化还原酶的最适pH为中性或微碱性，当环境pH偏离该最适范围时，细菌的反硝化活性会相应降低。 通过对TGR30反硝化特性系统的研究发现TGR30具有广泛的pH适应能力，pH7～12的范围内均具有较高的反硝化活性对氮的脱除率基本都在80%以上，pH4～6的范围内对氮的脱除率也在50%以上。于爱茸等(2005)报道的反硝化细菌W2最适pH在7.0～7.5;修海峰等(2011)的研究表明，菌株DF2的最佳活性pH在6.5～7.5;张苗和黄少斌(2011)报道的菌株TAD1反硝化最适宜的pH在7.0～9.0，当pH值升高至10时，脱氮率下降到10.47%;蔡昌凤和梁磊(2011)筛选出的菌株F1去除硝酸盐氮的最适pH为6.0～6.5。本研究获得的菌株TGR30较上述报道的菌株pH适应能力广泛的多，同时该菌在盐浓度不高于6%时对氮的去除效果无显著性差异，均具有较高的脱氮率，充分显示了该菌的耐盐耐碱特性。 乌梁素海位于内蒙古西部巴盟乌拉特前旗，是黄河流域最大的湖泊，也是地球上同经纬度地区最大的自然湿地(孙鑫鑫等，2009)。目前，针对该地郑喜春等:反硝化芽孢杆菌的筛选鉴定及反硝化特性区进行好氧反硝化菌株筛选研究的工作鲜有报道，本研究从微生物学的角度弥补了该地区该项研究的空白;此外，本研究获得的菌株TGR30较其他外来引入的菌株，对当地环境特征的适应能力更强，能更好地定殖于人工湿地系统中发挥作用。