紫外线(ultravioletradiation，UV)波长范围为10～400nm，依据其波长可将其分为短波紫外线(UVC200～280nm)、中波紫外线波长(UVB280～315nm)和长波紫外线(UVA315～400nm)3个区段。UVA、UVB和UVC在紫外辐射总量中的比例为12∶3∶1(聂颖等，2010)。由于近一个世纪全球快速的工业发展导致臭氧空洞的产生，加剧了紫外线，尤其是长波紫外线对地球上生物体的辐射(翟兴礼和史本林，2000;柯惟中和周殿凤，2004)。虽然适量的紫外线可以促进机体的新陈代谢，然而过量的紫外线照射对生物体是极其有害的，尤其是UVA与UVB。目前，对紫外辐射的生物效应已有大量的报道，但主要集中在UVB的生物学效应方面(王静等，2009;赵海滨等，2009)，对UVA的生物学效应则大多见于植物学方面的研究，动物方面的研究则大多集中于对离体细胞培养材料的研究，偏重其机理的探讨(Araielal．，2000;Lielal．，2007)。对于UVA照射后，在体器官的损伤鲜有报告。暴露于紫外线照射中的动物，其肾脏不仅同样受到紫外辐射的损伤，而且还需要承担机体在损伤后产生的异常代谢物的排泄以及由此引起的再次损伤，因此使得肾脏成为机体损伤程度的重要检测组织之一(谢妮等，2002;白咸勇和谌宏鸣，2007)。然而，紫外线对两栖动物肾脏组织学结构的影响目前尚未见报道。花背蟾蜍是北方的广布种，成体平均体长在60mm左右。在辽宁省一般于10月中下旬开始逐渐进入冬眠期，在第二年的4月底出蜇;5月初开始产卵，产卵期一般在15d左右。近年来，已有很多学者利用花背蟾蜍进行了大量的研究，并认为花背蟾蜍是很好的生物学实验材料(柳殿均，1986)。由于照射仪器空间的制约，故选取了亚成体作为照射实验动物。本文旨在通过对花背蟾蜍(Buforaddei)肾脏组织学和组织化学的观察，揭示其在一定剂量长波紫外线处理后的结构变化，为分析紫外辐射对两栖动物种群衰减的机理积累科学依据。 1材料与方法 实验用亚成体花背蟾蜍，于2010年6、7月采自沈阳北陵公园。实验室适应养殖3～4d后，选取体长在33.7mm±9.8mm的57只花背蟾蜍，雌雄兼用，随机分组，共分19组，每组3只。用WD-9403B型紫外仪进行照射处理，UVA照射波长为365nm，辐射量为352μW•cm－2，照射时间为150、300及450min3个时间段。完成照射后，不同照射组各取出一组进行立即取材，即立即取材组。其他组继续正常饲养3、6、9、12和15d后，分别再各取一组进行取材，即恢复组。同时，设置空白对照组，每组3只。将亚成体花背蟾蜍用乙醚麻醉后，剖开腹腔，立即取出肾脏固定于10%中性福尔马林24h。常规石蜡切片，肾脏横切，厚度7μm，HE、PAS染色。O-LYMPUS-BX50显微镜下进行观察、OLYMPUSDP71拍照，运用Image-ProExpress6.0图像分析软件进行测量。间隔3～5张组织切片选取一张进行测量，且仅测量切片中切面较大的肾小体及管腔呈圆形的肾小管，测量数据均以平均数±标准差(mean±SD)表示。采用SPSS16.0软件包对实验数据进行单因素方差分析(one-wayANOVA)。文中运用到的计算公式:肾小体相对面积=(肾小体面积/对应肾脏横切面积)×100%肾小球相对面积=(肾小球面积/对应肾脏横切面积)×100%近、远曲小管管径和细胞相对高度=(近、远曲小管管径和细胞高度/对应肾小体长径)×100% 2结果与分析 2.1花背蟾蜍肾脏的一般结构 花背蟾蜍肾脏呈暗红色，长椭圆形，位于体腔背壁、脊柱的两侧。肾单位为肾脏的结构和功能单位，由肾小体和肾小管构成。肾小体呈饱满的圆形，一侧可见清晰的“弯月”状的肾小囊腔，其囊壁扁平细胞连续而光滑(图1-1)。肾小体主要分布在肾脏中央和腹缘，背缘和两侧缘则分布较少，其平均面积为6278.03μm2±1694.90μm2。近曲小管上皮细胞胞体饱满，细胞界限不清，胞质嗜酸性，核圆形，位于细胞近基底部，腔面具刷状缘，管腔小或无，基部有纵纹。远曲小管上皮细胞染色较浅，细胞界限较为清晰，胞核为圆形或椭圆形，位于细胞近中部;腔面无明显刷状缘，基部纵纹明显。PAS染色显示近曲小管管腔面呈强阳性;肾小球内部也呈阳性反应(图1-8)。 2.2UVA照射后肾脏结构的变化 2.2.1肾小管 UVA照射后立即取材，花背蟾蜍肾小管损伤主要表现为小管管径和上皮细胞均出现明显收缩;管壁细胞间出现明显缝隙，细胞基膜也呈间断性破损，导致小管管壁的破裂;部分管壁细胞出现胞核外排和局部核聚集的现象。同时，胞核有较为明显的缩小和变形，失去原有的圆形或椭圆形的规则形状，呈不规则状。近曲小管PAS阳性反应区，均有向管腔面和胞质内扩展的现象，且扩展区域着色在原腔面两侧逐渐减弱。与对照组相比，300min组肾小管组织学结构的完整性损伤程度最为严重，由于肾小管管径的收缩，导致各管间距明显增加(图1-3);而150min组整体损伤程度介于300min组与450min组之间(图1-2、1-4)。 在恢复期中，近曲小管组织学结构的损伤，如管壁的完整性、胞核形态的不规则、胞核丢失或聚集现象等，在6d或9d有一个明显的加剧趋势，随后又逐渐恢复，即结构的恢复呈现“U”型现象。在15d时，150min组近曲小管管壁结构基本恢复，仅在个别区间的上皮细胞间仍存在有裂隙，少数胞核的分布仍略微杂乱胞核形态已大部分得到恢复(图1-5)。300min组管壁形态较为完整，但由于细胞高度恢复不一而使腔面呈凹凸状，胞核仍有缺失和散乱的现象(图1-6)。450min组仅处于肾脏的近曲小管管壁仍有局部的断裂现象，大部分基本恢复，胞核形态和分布也趋于正常(图1-7)。各组近曲小管的基膜结构在恢复15d后都已接近完整，仅局部存在裂隙。对近曲小管的PAS染色所示，随着恢复时间的延长，近曲小管上皮细胞游离面阳性染色的面积增大充满管腔，也呈现向胞质内部扩散的趋势。但300min组恢复12d时，不仅阳性区域明显减小，且靠近游离面边缘的染色明显变深(图1-15) 。 远曲小管在恢复期中，150min组在3d后，部分远曲小管上皮细胞之间界限变得清晰，胞核分布趋于正常;12d时管壁细胞基膜基本恢复完整;15d时远曲小管管壁组织学结构基本恢复正常(图1-5)。300min组是损伤程度最严重的一组，在经历了15d恢复后，上皮细胞基膜局部仍有断裂，部分细胞间裂隙仍存在，胞核也没有恢复正常大小，且还有大量的形态异常胞核(图1-6)。450min照射组恢复程度介于150与300min照射组之间，在15d时仅有少数核缺失与移位现象存在，管壁细胞基膜与管壁结构已趋于正常(图1-7)。#p#分页标题#e# 从近曲小管管径，远曲小管管径和远曲小管上皮细胞高度的相对数值看，在UVA照射后0d组中均出现显著的收缩现象。在恢复15d后，300min照射组的3项指标恢复程度最低(表1)，且近曲小管管径和远曲小管管径的相对值与150min照射组间呈极显著性差异(P=0.000)。 如表1所示，150min组的近曲小管虽然在0d管径收缩程度较大，但在随后的恢复期中呈快速的恢复状态，在9d略高于对照组，12d和15d略有下降，此3个数值与对照组均没有显著性差异，可以认为是基本恢复正常状况。300min组和450min组管径虽然分别在3d和9d有所恢复，但随即又出现回落，直至15d仍然与对照组间呈极显著性差异，且300min的最后恢复数值在本组中呈最低值。 450min照射组远曲小管相对管径在0d时收缩程度最小，且与150min组和300min组间呈极显著性差异。在恢复期中表现出较大的起伏波动，在12d时至最低值(37.78%±2.90%)，与其他两组呈极显著性差异，但在15d迅速回升至本组的最高恢复值(52.30%±2.61%)，与15d的150min无显著性差异，与15d的300min之间呈极显著性差异。300min，0d的收缩程度是本组中最严重的，与450min呈极显著性差异。在恢复期中表现为先升后降，在15d仅略高于0d，两者间无显著性差异，但与对照组间呈极显著性差异。150min组在0d收缩程度介于450min组和300min组之间，其在恢复中呈较好的恢复趋势，仅在12d出现一个明显回落，15d的恢复值已高于其0d的数值，与其呈极显著性差异。 远曲小管上皮细胞相对高度的变化趋势与管径基本相似，但在15d时，不同照射时间组的恢复值明显不同，依次为450min＞150min＞300min(图1-5，1-6，1-7)，前者和后者之间分别呈显著性差异(P450～150min=0.015)和极显著性差异(P450～300min=0.000)。 2.2.2肾小体的结构 经UVA照射立即取材组，肾小体呈现明显的塌陷和收缩现象，同时肾小囊腔消失。在肾小体区域细胞呈无序状态，且可见大量的红细胞弥漫性的充斥在肾小体区域。由表1可见，除150min组的肾小球相对面积外，肾小体和肾小球的相对面积在实验组和对照组间均呈极显著性差异。从数值上看，300和450min两组间的相对面积几无差别，150min组肾小体收缩程度略小于前两者，但仍与对照组间且呈极显著性差异。肾小体结构在恢复期主要表现为肾小囊的恢复、肾小球和肾小体圆润度及大小的恢复。在15d的恢复中，肾小球相对面积表现出显著的起伏波动。可总结以下几点:1)在6d时3个实验组的肾小球相对面积恢复数值彼此接近，与对照组间呈极显著性差异(表1);2)15d时150min组和300min组已恢复接近0d数值，且两者无显著性差异(P150～300min=0.895)，而450min组仍远低于0d，其与两者间均呈极显著性差异(P450～150min=0.001，P450～300min=0.000);3)150min组和450min组均在9d肾小囊腔恢复，但300min组到12d肾小囊腔才出现。虽然450min组在12d时肾小囊腔有部分消失，但在15d又重新恢复，且明显大于9d的肾小囊腔。 3讨论 3.1UVA照射对肾脏结构的影响 UVA对生物体的损伤是由细胞的内源性光敏剂吸收其能量，进而诱导生成了过量的氧自由基而引起(Araietal．，2000;Takaoetal．，2002)。正常情况下，细胞中存在着一套完善的抗氧化酶体系能及时的清除过多的氧自由基，维护细胞的内稳态。但当生物体在应激状态下，产生了超过自身清除能力的氧自由基时，就会导致细胞结构和功能的极大损伤(李培峰和方允中，1994;高斌和高洪，2002;邱秀芹，2007)。对于细胞功能来说，质膜的完整性是极其重要的，它不仅可以保证细胞内环境的稳定，还为细胞之间的连接和通讯提供了结构基础(汪堃仁等，1998;陈誉华，2008)。氧自由基可使细胞质膜中不饱和脂肪酸发生过氧化产生丙二醛，降低膜结构的稳定性(符移才等，2000;王宁等，2007)。若氧自由基积累过多，可使膜脂发生脱脂化作用，最终导致细胞膜结构的破坏，胞核的溢出，改变了正常细胞胞核对质膜完整性的依赖(王冬梅等，1998;覃鹏，2004)。本实验结果显示，经过UVA照射后的肾小体区域出现大量的散乱聚集的胞核，也印证了上述结论。 细胞质膜上存在有大量的整合蛋白及黏多糖等，它们对细胞与外界环境之间的物质代谢、能量转换、信号通讯等起到重要作用。另外，上皮细胞基底膜上表达的特定黏着分子则在细胞与细胞、细胞与胞外基质连接的介导及组织形态构建过程中具有重要的指导作用(翟中和等，2008)。作为肾小球滤过膜结构中复杂的细胞连接保证了对血液有效的滤过作用(佐中孜，1991;姜春玲，2003)。但机体中过量的氧自由基可引起包括细胞骨架成分如带Ⅲ蛋白、整联蛋白、Ca2+通道蛋白等膜结合蛋白的光敏损伤，不仅影响了质膜结构稳定，降低膜功能，同时也导致了细胞连接的松散(李静，2006;聂颖等，2010)。本实验结果也显示出了相同的现象，即经UVA照射后，肾小体结构均出现了结构的异常，即由于细胞连接中的相关蛋白结构的变化，使得由毛细血管上皮细胞与肾小囊脏层上皮细胞之间的有序连接、肾小囊壁层上皮细胞与周围细胞及结缔组织之间的有序连接和肾小管管壁细胞之间的有序连接受到严重的损伤，最终导致了肾脏整个器官组织学结构的损伤，降低了肾脏的功能。另外，本实验还观察到，在相同照射条件下，近曲小管管壁结构的损伤程度大于远曲小管的损伤程度。从近曲小管和远曲小管生理功能分析，近曲小管主要是对原尿中的绝大部分水、葡萄糖、氨基酸、磷酸盐、重碳酸盐、钠、钾等进行重吸收，而远曲小管则是在调节电解质和酸碱平衡方面起重要作用(成令忠等，2003)。实验结果显示的两种肾小管损伤的差异，是否是由于其功能差异所致，还需要进一步从生理学角度进行研究证明。 3.2UVA照射对肾脏细胞遗传物质的影响 由于UVA的能量更低，故其对细胞遗传物质的损伤不像UVB那样直接作用于DNA引起嘧啶二聚体的产生，而是通过氧自由基的间接作用引起DNA的氧化损伤(Araietal．，2000;Takaoetal．，2002)，使其形成双链断裂、碱基修饰、DNA与蛋白质相交联等现象(Araietal．，2000;Maedaetal．，2000)。而对悬浮于Tris-HCl缓存液中的白来杭幼鸡肝脏细胞核给予65W•m－2的UVA照射后，肝脏细胞核内RNA合成量明显低于正常组RNA的合成量。Arai等(1997)研究指出，UVA照射诱导产生的氧自由基损伤了RNA合成相关的重要酶，从而抑制了RNA合成。其他研究也证实，UVA照射后产生的氧自由基可以增强Akt，p70s6k及MAP激酶的磷酸化，从而活化Erk、JNKs及p38激酶信号转导途径(Dingetal.，2002;Hellwegetal.，2007)。本实验结果显示，在肾单位中出现了大量的胞核大小和形态的异常，并有部分胞核内出现了染色质边缘化等现象。但实验用照射剂量的UVA对肾脏及肾小体细胞内的遗传物质损伤的程度还需要进一步深入探讨。#p#分页标题#e# 3.3UVA照射对肾脏糖原的影响 Mekkawy等(2010)实验显示，UVA照射会导致鲶鱼早期胚胎发育中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与乳酸脱氢酶浓度及活性异常，而这两种酶通常作为鉴定可能存在的环境污染的生物标记。本实验结果也证明了上述结论，不同照射组及恢复组中的糖原染色均存在变化，尤其是300与450min照射组糖原在近曲小管腔中变化较为明显，这可能一方面与近曲小管管腔中刷状缘结构的质膜损伤有关，导致质膜表面的黏多糖分散至管腔，形成腔内PAS浅染。另一方面可能与上皮细胞自身结构恢复需要糖原提供能量有关，形成部分细胞质呈PAS浅染。 3.4UVA照射与两栖动物对其的适应 近年来对辐射适应性的研究指出，由于最初的照射导致了细胞内氧化还原体系的失衡，从而激活细胞内某些信号途径，致使机体内的防御体系被激活，使细胞对随后的照射产生辐射适应性反应(Mar-tinez，2007;Tapio＆Jacob，2007;袁德晓等，2009)。300min照射组对肾脏结构损伤程度最为严重，且在恢复期中也较其他两个照射组恢复缓慢。可以推测，300min照射时间虽然引起了花背蟾蜍在体肾脏的极大损伤，但还未达到激活花背蟾蜍体内抗氧化酶系活性的峰值，而450min的照射时间，可能在一定程度上激活了花背蟾蜍体内的抗氧化酶系，产生了较强的辐射适应性，有效地保护了肾脏组织结构，并促进了其在恢复期的修复。 3.5UVA与两栖类种群的衰减 紫外辐射的增强，是两栖动物种群大幅度衰减的可能原因之一(武正军和李义明，2004;韩九皋，2007;饶定齐，2008)。在本实验的恢复期，虽然肾单位的结构均有明显的恢复，胞核的分布也趋于规则，但各项指标与对照组的正常值之间还存在一定的差距，这已经显示出花背蟾蜍在漫长的演化过程中，肾脏已经具备了非常强的自我修复功能，以适应各种不良环境。但从15d之后的恢复指标也可以看出，花背蟾蜍肾脏的自我修复能力是有限的，如果外部环境长期处于不良状态，就会严重损伤肾脏本身的内在调节机制，甚至导致肾脏功能的衰竭。这种情况一旦发生，花背蟾蜍的代谢产物就会逐渐积累在其体内，导致中毒现象的发生，严重影响机体的正常新陈代谢，最终势必导致个体的死亡。另外，在5—7月花背蟾蜍正处于产卵和完成胚胎发育及变态发育期间，测的环境中UVA的光照强度在晴天高达949.8μW•cm－2，即使是雨天也在339.1μW•cm－2(此数值与实验用强度非常接近)，只有在草丛下UVA的照射强度略减弱，为248.1μW•cm－2。虽然蟾蜍类大多在旁晚出来觅食，可以很好地躲避白天强烈的紫外照射，避免对其的损伤，但蛙类多以白天为最佳觅食时间，难免会受到大剂量UVA的照射。如果再由于人为的因素，使得水域附近的树木、草丛大量减少，蛙类缺少了可用来“避难”的自然掩体，就会引起蛙类个体的无名死亡现象，进而导致种群数量的衰减。本实验的结果提供了初步的实验证据，UVA对花背蟾蜍肾脏生理功能的影响以及蟾蜍和蛙类肾脏对UVA照射后的自我调节功能的差异等还有待于后续研究。