西伯利亚鲟(Acipenserbaerii)隶属于鲟科(Aci-penserdae)，鲟属(Acipenser)，是现存26种鲟类中的一种，具有生长速度快、适应性强、肉质好、鱼籽酱品质高等优点。1996年，西伯利亚鲟首次被中国引进，目前其养殖量仅次于施氏鲟(Acipenserschrenckii)，居中国鲟养殖产量的第2位［1］。然而，近年来病害的发生已成为鲟养殖业可持续发展的瓶颈。因此，关于鲟病害的分离鉴定及其药敏特性等基础理论研究对鲟病害的有效防治显得尤为重要。2006年6月中旬，中国浙江省千岛湖鲟养殖场的西伯利亚鲟感染了严重的以“肌肉、肾脏、性腺、肠道充血、出血，肝脏有出血点，肛门红肿并伴有血水流出”为主要病症的细菌性败血症，经分离鉴定其病原主要是嗜水气单胞菌，具有较强致病力，患病鲟鱼死亡率高［2］。外膜蛋白(outermembraneprotein，OMP)是革兰氏阴性菌外膜的主要结构，是气单胞菌重要的粘附因子和保护性抗原，与细菌的毒力也密切相关，其数量、种类及毒力大小随着不同菌株及菌株的不同培养条件而有所变化［3］。大量研究表明气单胞菌的外膜蛋白含量丰富，生物学功能复杂，在对宿主的感染和免疫中扮演着重要的角色，是重要的保护性抗原，很容易被宿主的免疫防御体系识别为异物［4－6］。本试验以由患败血症西伯利亚鲟(Acipenserbaerii)分离鉴定的嗜水气单胞菌为试验材料，研究了其外膜蛋白的组成及抗原性，同时比较了该菌与水产养殖中常见的3种气单胞菌，即致病性豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)、温和气单胞菌(Aeromonassobria)和无致病力的嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophlia)在外膜蛋白构成及免疫学特性等方面的异同，旨在发现西伯利亚鲟嗜水气单胞菌与气单胞菌属其他细菌共有的外膜蛋白，为进一步筛选和研究致病性气单胞菌的共同保护性抗原提供参考。 1材料与方法 1.1试验材料 西伯利亚鲟嗜水气单胞菌X1(Aeromonashydroph-lia)［2］，豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)［7］，温和气单胞菌(Aeromonassobria)，无致病性嗜水气单胞菌(Aero-monashydrophlia)。此4株细菌均由上海海洋大学农业部渔业动植物病原库提供。保存于－80℃。纯系新西兰兔由上海第二军医大学提供。1.2方法1.2.1兔抗XI全菌血清的制备菌悬液的制备菌株XI接种于普通营养肉汤培养基中，28℃培养24h，加入0.2%福尔马林溶液于30℃灭活24h，无菌检测后离心，取菌体沉淀以10mmol/L磷酸盐缓冲液重悬，用McFarland比浊法定细菌浓度为9×108CFU/mL。将制备的菌悬液用于新西兰兔的免疫［10］，免疫完成后从新西兰兔心脏一次性采血，制备抗血清。 1.2.2外膜蛋白的提取及SDS-PAGE检测 4株菌株主要外膜蛋白的提取根据改进的十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)方法抽提结合超速离心纯化的方法［8］进行。将4种菌株的全菌和外膜蛋白样品分别进行SDS-PAGE检测，用全自动凝胶成像系统扫描，Gel-ProAnalyzer软件分析各分离蛋白的分子量。 1.2.3外膜蛋白的Western-blot分析 电泳结束后，凝胶均用Mini2ProteinⅡcell系统(BioRad)转移至硝酸纤维素膜上，以免疫兔血清为一抗，未免疫兔血清为阴性对照，进行外膜蛋白的West-ern-blot分析。 2结果 2.1菌株X1与其他菌株外膜蛋白的SDS-PAGE图谱的比较 如图1所示，4株气单胞菌外膜蛋白的SDS－PAGE主要蛋白带较清晰，且有明显的区别。其中西伯利亚鲟嗜水气单胞菌菌株与豚鼠气单胞菌菌株的蛋白质条带较多，而温和气单胞菌与无致病力嗜水气单胞菌的蛋白质条带较少。西伯利亚鲟嗜水气单胞菌菌株与豚鼠气单胞菌菌株的蛋白质条件主要集中在120～72kDa，65～28kDa;温和气单胞菌菌株的蛋白质条带主要集中在72～43kDa，无致病性嗜水气单胞菌菌株的蛋白质条带100～95kDa，43～34kDa。西伯利亚鲟嗜水气单胞菌菌株主要有14条，分子量为120kDa、95kDa、75kDa、60kDa、58kDa、52kDa、50kDa、43kDa、40kDa、34kDa、36kDa、30kDa、28kDa、26kDa;豚鼠气单胞菌菌株主要有11条，分子量为120kDa、95kDa、75kDa、58kDa、52kDa、43kDa、40kDa、34kDa、36kDa、28kDa、26kDa;温和气单胞菌菌株主要有9条，分子量为120kDa、95kDa、75kDa、58kDa、52kDa、40kDa、28kDa、30kDa、36kDa;无致病性嗜水气单胞菌菌株主要有5条，分子量为95kDa、71kDa、52kDa、43kDa、34kDa、28kDa。图中可以看出蛋白带分子量为34kDa和28kDa为4株菌株所共有;蛋白带分子量为120kDa、95kDa、75kDa、58kDa、52kDa、40kDa、36kDa为西伯利亚鲟嗜水气单胞菌菌株、豚鼠气单胞菌菌株和温和气单胞菌菌株所共有;蛋白带分子量为43kDa、52kDa、28kDa为西伯利亚鲟嗜水气单胞菌菌株与豚鼠气单胞菌菌株所共有。 2.2菌株X1与其他菌株外膜蛋白的Western-blot印迹的比较 图2显示了兔抗西伯利亚鲟嗜水气单胞菌全菌血清与西伯利亚鲟嗜水气单胞菌菌株、豚鼠气单胞菌菌株、温和气单胞菌菌株、无致病性嗜水气单胞菌菌株主要外膜蛋白免疫反应结果。由图2可知，兔抗西伯利亚鲟嗜水气单胞菌全菌血清与4株菌株的外膜蛋白均可发生不同程度阳性反应。其中西伯利亚鲟嗜水气单胞菌菌株有6条反应带，分子量分别为75kDa、52kDa、43kDa、40kDa、34kDa、28kDa;豚鼠气单胞菌菌株主要有5条反应带，分子量分别为75kDa、52kDa、40kDa、43kDa、28kDa;温和气单胞菌菌株主要有4条发色带，分子量分别为75kDa、40kDa、34kDa、28kDa;无致病性嗜水气单胞菌菌株主要有3条发色带，分子量分别为43KDa、34kDa、28kDa;由此可明显看出28kDa、34kDa为4株菌所共有反应带;43kDa为西伯利亚鲟嗜水气单胞菌菌株、豚鼠气单胞菌和无致病性嗜水气单胞菌菌株所共有发色带;75kDa为豚鼠气单胞菌菌株、西伯利亚鲟嗜水气单胞菌菌株与温和气单胞菌菌株共有反应带。 3讨论 本试验采用Sarkosyl法分离提取了西伯利亚鲟嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌及无致病性嗜水气单胞菌的外膜蛋白，通过SDS-PAGE图谱分析了4株菌主要外膜蛋白结构组成。研究发现，3株致病菌株外膜蛋白条带较多，共有7条外膜蛋白，而无致病性菌株外膜蛋白条带较少，这可能与致病菌抗原的特异性及致病性有关。细菌外膜蛋白具有良好的免疫原性，不仅可激发机体的体液免疫，而且还可引起细胞免疫，可与其他血清型的嗜水气单胞菌有免疫交叉反应，具有异种血清型的免疫交叉保护作用，是一种潜在的共同保护性抗原［9］。嗜水气单胞菌OMPs除具有免疫原性外，主要与粘附致病作用有关［10］。除了某一分子质量单位的OMPs具有较好的免疫原性外，近年来，越来越多的研究者正致力于发现存在于同属甚至同科细菌中的共同OMPs［11］。本试验中，SDS-PAGE图谱显示分子量为34kDa和28kDa蛋白带为4株气单胞菌菌株所共有;蛋白带分子量为120kDa、95kDa、75kDa、58kDa、52kDa、40kDa、36kDa为西伯利亚鲟嗜水气单胞菌菌株、豚鼠气单胞菌菌株和温和气单胞菌菌株所共有，与Quinn等报道的40kDa是比较保守的孔蛋白，该蛋白广泛地分布于多数致病性气单胞菌的结果一致［12］。本试验Western-blot印迹显示28kDa蛋白为4株气单胞菌所共有发色带，可能是气单胞菌的特有蛋白。43kDa蛋白为西伯利亚鲟嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌与无致病力嗜水气单胞菌菌株所共有发色带，而温和气单胞菌菌株无此蛋白带;75kDa蛋白为西伯利亚鲟嗜水气单胞菌菌株、豚鼠气单胞菌菌株和温和气单胞菌菌株共有发色带。Quinn等［12］利用亲和层析技术分离纯化了嗜水气单胞菌40kDa和43kDa两种主要外膜蛋白并预测该两种外膜蛋白是嗜水气单胞菌重要的粘附素。Rchoa-de-Souza等［13］］则分离纯化并证明豚鼠气单胞菌43kDa的外膜蛋白是主要的粘附素，能够介导细菌牢固定植于HEp-2细胞，而43kDa蛋白的多克隆抗体能够有效阻断这种定植。在本试验中，无致病力的嗜水气单胞菌也有此蛋白，与前面的报道不太一致，需要进一步研究。而西伯利亚鲟嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌均为鲟细菌性败血症致病菌，43kDa蛋白作为开发研制鲟败血症亚单位疫苗候选材料有应用价值。75kDa蛋白为西伯利亚鲟嗜水气单胞菌菌株、豚鼠气单胞菌菌株和温和气单胞菌菌株共有特异性抗原，而无致病力菌株无致病性嗜水气单胞菌未发现此条带，由此推测75kDa蛋白可能在致病性气单胞菌感染过程中也起到重要作用，无致病力嗜水气单胞菌无此75kDa蛋白，说明无致病力的菌株很可能无此毒力基因［14］。由此可以进一步探讨75kDa外膜蛋白作为气单胞菌主要保护抗原的可能性。结果表明:2005～2009年各年份产人工培殖冬虫夏草的甘露醇含量分别为89.64、91.86、94.71、98.98、97.50mg/g。而康定两地野生冬虫夏草(2009年)的D-甘露醇含量分别为94.71、96.84mg/g。可见，人工培殖冬虫夏草与野生冬虫夏草的D-甘露醇含量基本相当。为人工培殖冬虫夏草的药用提供依据。#p#分页标题#e# 全国主要产区冬虫夏草D-甘露醇含量有亦较大差别。青海治多县和甘肃绿曲县产冬虫夏草甘露醇含量最高分别为125.18mg/g和125.81mg/g，四川稻城县和云南香格里拉县产冬虫夏草的甘露醇含量最低分别为68.57mg/g和68.17mg/g。可见不同产地野生冬虫夏草的甘露醇含量亦有较大差异。