海洋雪花是海洋生态系统中独特的现象，在能量流动和物质传递过程中具有重要的作用［1-2］。浮游植物凝聚体是海洋雪花的主要贡献者［3-4］。凝聚体的形成一般发生在海洋藻华发生的中后期，浮游植物细胞彼此粘合在一起，并且通过吸附细菌、生物碎屑和无机颗粒等物质，组成较大的凝聚体［3-4］。浮游植物凝聚体的形成显著影响了海洋生态系统的有机物质通量，据估算深海区域每年有36%的初级生产力以凝聚体的方式沉降出真光层［2］。室内研究同时发现，浮游植物细胞在衰退期时最易形成凝聚体，此时细胞分泌更多的糖类物质，细胞表面粘性显著增加，有利于细胞彼此连接［5］。浮游植物细胞的凝聚过程需要提高细胞互相碰撞的机会，布朗运动，水体搅动和细胞沉降方式等物理因素均增加了凝集体形成的几率［6-7］。浮游动物的摄食行为同样能够增强浮游植物的凝集效率，例如浮游动物产生粘性更强的粪球，可粘合更多细胞;浮游动物通过游泳行为增加细胞的碰撞机会，提高细胞凝聚的几率;但是某些浮游动物过快的游泳速度则可能减少凝聚体的形成［8］。因此浮游动物对凝聚体形成的影响还存在争议。 棕囊藻(Phaeocystis)广泛分布于从热带到两极的广大海区，在全球碳和硫循环过程具有重要的调控作用［9-10］。棕囊藻属于有害藻华物种，其产生的藻华经常导致严重的生态灾难和经济损失［11］。1997年，我国南海首次爆发球形棕囊藻(Phaeocystisglobosa)藻华，此次藻华面积覆盖3000km2海域，时间持续6个月，导致邻近海域养殖鱼类的大量死亡，直接经济损失达到750万美元［12］。棕囊藻具有特殊的异型生活史，包含游离单细胞和囊体两种生活史状态［13-14］。游离单细胞3—9μm，囊体直径一般为几百微米，中国南海发现的球形棕囊藻囊体直径则可达到3cm，为目前世界上发现的最大棕囊藻［12］。囊体结构为中空球状，球体外被为一层具有弹性的凝胶质半透膜，囊体细胞均匀包裹于凝胶质外被之下［15］。囊体外被的主要成分为粘多糖［16］，具有粘性，因此囊体经常能够粘附在一起，形成凝聚体［17］。凝聚体的形成加速了有机物质的垂直沉降。在欧洲北海南部，棕囊藻藻华衰退时，囊体互相聚合并粘附其它有机碎屑以及无机颗粒形成凝聚体沉降到水层底部，约有60%的初级生产力被沉入海底［4］。 棕囊藻的凝聚和沉降也被认为是棕囊藻藻华消退的主要原因之一［17］。但是，海区中极少发现棕囊藻单细胞形成的凝聚体［4］。棕囊藻囊体较大的体积导致浮游动物无法有效摄食囊体内细胞［18］，有效减少了摄食死亡率［19-20］。摄食压力的存在提高了囊体体积和囊体的形成率［18，20］。因此囊体的形成和体积的提高成为棕囊藻重要的生态竞争策略［20］。棕囊藻单细胞聚合成凝聚体同样提高了体积，最大直径可达到10cm［4］，远远超过浮游动物的摄食粒径范围。但是目前为止，依然不清楚单细胞凝聚体的形成同摄食压力的关系。本文选择中国南海球形棕囊藻为研究对象，通过添加高密度摄食者，引入摄食压力，研究棕囊藻单细胞凝聚体形成和摄食压力之间的关系，阐明摄食在棕囊藻藻华消退期间的功能和意义。本次研究的结果为阐明球形棕囊藻的竞争策略及其生态效应提供了理论支持，同时增强了对于浮游植物凝聚体形成机制的理解。 1实验方法 1．1藻种的培养 本研究所用球形棕囊藻取自广东汕尾沿海藻华发生现场，囊体直径范围为500μm到1cm，小心挑选健康完整的囊体，培养于暨南大学赤潮与水环境研究中心藻种室。球形棕囊藻培养在盐度为30psu的f/2培养基中［21］，温度保持为20℃，光照强度为100μmol光子m－2s－1，光暗比为12h∶12h。但是待第2次接种后，囊体全部消失，只有游离单细胞存在，而且70%以上的单细胞均带有鞭毛，可以自由运动。本次研究中采用的摄食者为异养甲藻-海洋弯曲甲藻(OxyrrhismarinaDujardin)，购自美国西华盛顿大学ShannonPoint海洋中心。已有研究证实海洋弯曲甲藻能够以较高的速率摄食棕囊藻的单细胞［22］。 1．2摄食实验 将球形棕囊藻单细胞接种至12个透明培养瓶中(BDBiosciences，USA)，接种体积为250mL，初始浓度为4000个/mL。将海洋弯曲甲藻投入到其中6个培养瓶中作为摄食组，初始密度为0．2个/mL，剩余6个培养瓶中只包含球形棕囊藻作为对照组。3个无摄食培养瓶和3个摄食瓶置于摇床上(VWRScientific，USA)，摇床转速为10RPM，保持细胞均匀分布，并提高细胞的相遇率［23］。其余3个摄食瓶和3个无摄食瓶置于静止平台上。培养温度为20℃，光照强度为100μmol光子m－2s－1，光暗比为12h∶12h。 1．3取样与测定 每4d取样1次，每次取2mL样品，加入酸性Lugol's溶液固定。利用Sedgwick-Rafter计数框(SPISupplies，USA)计数游离单细胞数量，计数的细胞数量不少于200个［18］。凝聚体形态与数量，凝聚体包含细胞丰度以及海洋弯曲甲藻数量的测定在24孔细胞培养板中进行，计数的凝聚体/海洋弯曲甲藻数量不少于30个。为了研究的便利，将凝聚体的形态简化为球体(见结果2．1及图1)，采用以下公式计算凝聚体的细胞数量(Na):式中，ragg为凝聚体直径，rcell为单细胞直径。 2结果 2．1单细胞凝聚体的形态 无论有无搅动，摄食组中均发现了棕囊藻单细胞凝聚体。细胞紧密附着在一起，形成近似圆球结构，体积大于摄食者———海洋弯曲甲藻。在凝聚体形成初期，细胞联系较为松散，细胞之间有凝胶状物质存在，凝聚体中包裹的纤维等物质清晰可见，且凝聚体细胞均无鞭毛。随着聚集体体积逐渐提高，细胞彼此之间联系愈发紧密，凝胶状物质不可见，细胞之间无缝隙，整个凝聚体呈不透明的球体，无法观察到凝聚体的内部结构(图1)。对照组中并无凝聚体的出现。无搅动摄食组中凝聚体体积逐渐提高(P＜0．01)，从第16天的(43．4±7．7)μm增长至第36天的(98．0±27．8)μm(图2a)。而搅动摄食组中凝聚体直径在第36天达到最高，只有(61．97±15)μm(图2b)。无搅动摄食组中，棕囊藻凝聚体包含的细胞密度逐渐提高(P＜0．01)，从16天的(97．5±89．8)提高到(1367±823．62)个/凝聚体(图2c)。而搅动摄食组中在第36天时达到最高，为(193．2±170．3)个/凝聚体(图2d)。凝集体包含细胞密度同凝集体体积线性相关(P＜0．001)。#p#分页标题#e# 2．2单细胞和凝聚体数量 海洋弯曲甲藻有效摄食了球形棕囊藻单细胞。摄食组中细胞丰度显著低于对照组(P＜0．001;图3a)。在16d和20d时，游离单细胞几乎被摄食殆尽。直到28d，细胞丰度才稍有提高，然后再次减少到几乎为0。搅动摄食组中单细胞浓度变化同样显著低于对照组(P＜0．001;图3b)，摄食组中球形棕囊藻承受着较大的摄食死亡率。无搅动摄食组中，凝集体在第16天时大量形成，凝聚体数量达到(43．8±2．4)凝聚体/mL，第20天达到最高值为(53．7±0．4)凝聚体/mL。第24天开始囊体密度下降，实验结束时(36d)，凝聚体数量只有(28．0±3.3)凝聚体/mL。搅动摄食组中于24d发现凝聚体，28d达到最高值(23．0±2．0)凝聚体/mL，之后凝聚体数量迅速下降(图4)。 2．3摄食者的密度 海洋弯曲甲藻的初始密度只有0．2个/mL，但是其数量迅速提高且出现较大的波动。在无搅动摄食组中，海洋弯曲甲藻的密度于12d后达到(1．06±0．02)×104个/mL(图5)。由于凝聚体的出现，海洋弯曲甲藻的密度出现波动并于24d后显著下降(P＜0．01)，到实验结束时，海洋弯曲甲藻在无搅动摄食组中密度只有(0.36±0．05)个/mL。搅动组中由于凝聚体的出现，摄食者密度同样出现了波动，在32d后显著下降(P＜0.05)。 3讨论 藻华末期，浮游植物细胞互相连接形成凝聚体是海洋生态系统中常见的现象。尽管棕囊藻经常引发大规模的藻华，但是目前关于棕囊藻单细胞凝聚体的报道只有一例［4］。由于囊体是藻华发生期间的优势形态［12-13］，单细胞丰度很少，因此导致单细胞间接触机会少，降低了凝聚体的形成几率。本次研究中，对棕囊藻培养体系施加了搅动，有效增加了细胞的碰撞与结合几率;并促使棕囊藻细胞更快的进入衰退期［24］;分泌更多的多糖类物质，使得细胞表面黏性增强［16］。具备形成凝聚体的两个必要条件，对照组中依然未发现任何凝集体，说明对照组中单细胞缺乏形成凝聚体的机制。无论是否存在搅动，摄食组中均发现了凝聚体的存在，说明摄食压力的存在促进了单细胞凝聚体的形成。囊体形成前，超过70%的单细胞具有鞭毛，在海水中自由的游动，而形成凝聚体的细胞则均无鞭毛。这样在凝聚体形成过程中，单细胞褪去鞭毛粘结在一起，证明了凝聚体的形成是棕囊藻主动的生理过程。凝聚体的形成有效保护了部分细胞免受摄食者的影响，凝聚体一旦出现，摄食者的数量立即减少。随着凝聚体的体积增大，更多的细胞被凝聚体粘连在一起，导致摄食者密度持续下降。凝聚体的形成在棕囊藻生长末期成为抵御摄食的有效手段。 本研究中采用的摄食者密度较高，达到1．3×104个/mL，而这个密度在自然水体中是难以实现的，这也是浮游动物摄食研究中一个普遍的问题［18，20］。在Jacobsen等的研究中［18］，摄食者:食物的比例为1∶50(Gyrodiniumdominans:P．globosasolitarycells)，随着实验的进行G．dominans密度提高很快，摄食者:食物的比例达到3∶50［23］。而在本次研究中，摄食者:食物的比例最初只有1∶20000，但是在20d时，这个比例达到8，说明海洋弯曲甲藻有效摄食了球形棕囊藻的单细胞，本身的密度也提高较快。过高的摄食者密度必然导致过高的摄食压力，从而引起浮游植物细胞特殊的生理响应［23］。本研究中，过高的摄食压力导致了游离单细胞几乎被耗尽，促进了凝聚体的形成。细胞被凝聚体的形成可能属于棕囊藻的“应激”反应的结果。由于现场中以及室内培养体系中，不会出现类似的高摄食压力，衰老的游离单细胞缺乏形成凝聚体的动力。这也解释了单细胞凝聚体很少被发现的原因。而Riebesell等在欧洲北海发现棕囊藻单细胞聚集体时，海区微型浮游动物密度较高［25］，棕囊藻单细胞同样面临较高的摄食压力，同本文的研究结果具有很好的对比性。 一般来说，藻华末期的棕囊藻囊体衰老破裂，释放出单细胞，被微型浮游动物摄食，有机碳进入经典食物链继续传递［13］。衰老的囊体在海洋表层被微生物侵蚀，形成大量白色泡沫［11］。而尚未破裂的囊体可形成凝聚体，但是由于囊体之间结合松散，具有较大的浮力，不利于沉降，在真光层中再矿化［4］，有机物质进入微生物食物环。如果单细胞形成凝聚体，则凝聚体不易被浮游动物摄食，而凝聚体由于结合了较多的细胞，体积和密度增加，从而快速沉降至海底［4］。因此单细胞形成凝聚体可能将更多的有机碳以沉积物的形式带入海底，减少了食物链中有机物质的比例。凝聚体的形成由于体积增大，可能阻碍小型浮游动物的摄食，减少了物质和能量在食物链中的传递效率。因此棕囊藻单细胞形成凝聚体将改变有机物质的循环和流通，进而改变海洋生态系统的结构和功能。 球形棕囊藻在生长的各个阶段均具有优越的竞争生存策略［19］。棕囊藻的囊体能够调控浮力，提高在真光层中的滞留时间［26］，为生物量在水体表层的迅速积累提供了条件。当球形棕囊藻藻华爆发时，囊体坚韧的外被和较大的体积抵制了海洋细菌，病毒和浮游动物对囊体细胞的侵蚀和摄食［18，20，27］。而在藻华后期，棕囊藻囊体开始破裂，囊体内细胞被释放出来。如果承受的摄食压力过大，单细胞则可形成凝聚体，降低了细胞的摄食死亡率。另外，聚集体的存在可作为棕囊藻越冬的形态，在条件适合时再次增殖［19］。具备各种优越的竞争策略有利于球形棕囊藻藻华的形成，也解释了棕囊藻成为海洋生态系统中最“成功”的浮游植物的原因。 4结论 通过添加高密度的摄食者———海洋弯曲甲藻，在球形棕囊藻培养体系中引入较高的摄食压力，棕囊藻单细胞被大量摄食，从而诱导并刺激单细胞脱去鞭毛，互相吸附连接，形成结构紧密的凝聚体结构。棕囊藻单细胞凝聚体体积显著高于摄食者的体积，且逐渐提高，造成了摄食者和食物之间的不匹配。凝聚体的形成有效阻止了海洋弯曲甲藻对游离单细胞的摄食，降低了细胞的死亡率。鉴于现场中很少出现单细胞凝聚体，本次研究中的凝聚体可能是球形棕囊藻面对高摄食压力情况下而采取的“应激性”防御策略。棕囊藻成为海洋生态系统中主要的藻华物种得益于其具有的各种竞争策略。#p#分页标题#e#