非细胞型HBOCs的抗氧化研究
维持Hb的还原状态是保证其能够携带氧的前提条件，而维持其还原状态则有赖于Hb所处环境中有较高浓度的还原剂，较低浓度的氧化剂。石晓东等研究发现，当对红细胞裂解液进行微孔膜分离时，MetHb增加不多；但去除超氧化物歧化酶(SOD)等其他红细胞蛋白后再进行超滤膜浓缩Hb，出现较多的MetHb，说明抗氧化剂的能有效地降低MetHb的生成。在Hb溶液中和制备Hb的超滤过程中，谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、亚硫酸钠、维生素C都能保护Hb免被氧化[2]。无基质Hb（Stromafleehemoglobin,SFH）由于缺乏正常红细胞所具有的还原酶系（如SOD、过氧化氢酶CAT、MetHb还原酶等），Hb内的Fe2+容易氧化成Fe3+形成MetHb而失去携氧能力，并且还可产生自由基，尤其是在组织缺血再灌注时，可发生自由基的级联反应，造成组织的过氧化损伤；同时Hb释放的铁离子能促进细菌的生长，可能引起脓毒症等。因此，除了其他副作用和缺陷外，单从抗氧化的角度，SFH就不是理想的氧载体。
第一代HBOCs的研究主要是对Hb的化学修饰，主要包括Hb的分子内修饰（形成分子内交联Hb）、表面修饰（形成共轭Hb）、分子内与分子间的双重修饰（形成聚合Hb）等[3]。其主要目的稳定Hb的四聚体结构，增加分子量，延长半衰期；升高P50，降低Hb与氧的亲和力，利于组织细胞获得更多的氧。然而，这类修饰并没有提高Hb的抗氧化能力[4]，有些修饰反而促进了MetHb的形成。如多聚交联Hb的自氧化作用比未聚合交联Hb显著增强[5]；Sprung等[6]对55例手术患者在术中使用了不同剂量的HBOC-201(HemopureTM，Biopure公司生产的超纯化的戊二醛多聚牛Hb电解质平衡溶液)，发现术后血浆MetHb呈剂量依赖性升高。O′HaraJF等[7]研究发现，HemAssistTM（DCLHb）在储存过程中，会随着时间和温度的增加，MetHb含量也明显增加。对大量失血患者使用大剂量的DCLHb治疗过程中发现血浆MetHb有不同程度的增加。尽管在这些研究中MetHb的增加在动物实验和初期临床试验中并没有引起明显的并发症，但是对患有严重疾病，尤其是危重病如多器官功能障碍综合症、缺血再灌注损伤等患者，由于复杂的病理生理环境（如自由基增加，过氧化状态，炎性介质的释放等）可能会加重病情或引起严重的并发症。
为了克服非细胞型HBOCs的自氧化缺陷，国内外学者开始了第二代HBOCs的研发，即在多聚的血红蛋白上交联抗氧化剂如SOD、CAT、硝基氧、GSH、水溶性维生素E类似物等，使多聚Hb具有抗氧化性。Chang等利用研发的交联SOD和CAT的聚合牛Hb（即PolyHb-SOD-CAT）对大鼠进行缺血再灌注研究，发现PolyHb-SOD-CAT对大鼠肝、肾再灌注具有较强的抗氧化性[8,9]。Powanda等[10]利用大鼠球形脑缺血再灌注模型，观察PolyHb-SOD-CAT的效果时，未发现明显的由氧自由基引发的再灌注损伤。我国杨懿铭等[11]采用戊二醛交联法制备的抗氧化酶交联的多聚Hb即PolyHb-SOD-CAT，测定不同温度、时间保存下制品MetHb的变化，发现在4℃、24℃不同保存时间均呈自氧化稳定，37℃、8小时显示比多聚Hb有更强的自氧化稳定性。说明交联了SOD、CAT的多聚Hb具有了抗氧化性，在一定程度上减轻了活性氧自由基的产生,并能抑制多聚Hb制备过程中MetHb的形成,减少Fe3+及血红素的析出。
以基因重组方法生产重组人Hb也是开发HBOCs的重要途径，Hoffman等[12]将Hb的α和β基因构建于同一表达载体，使α和β亚基在表达过程中即形成α2β2四聚体。由此可以想象，将抗氧化剂如MetHb还原酶、SOD和（或）CAT的基因与Hb的α和β基因构建于同一表达载体，将可能生产出具有较强抗氧化性的Hb。也有研究发现，人Hb的α链上酪氨酸Y-42位是血红素产生自由基的关键部位[13]，可以用无反应活性的氨基酸取代Y-42位，认为可以有效减少氧自由基的产生。因此，重组蛋白工程也是阻止HBOCs被氧化的有效途径之一。
细胞型HBOCs的抗氧化研究
细胞型HBOCs是第三代血液代用品，主要特点是在Hb的外面用膜包覆，在结构上接近红细胞。早期的人工红细胞是用一薄层有机酯包裹Hb、2，3-二磷酸甘油酸（2,3-DPG）、CAT和碳酸酐酶等。由于半衰期非常短、毒性大，又发展了用脂质体为材料的亚微米人工红细胞——脂质体包埋Hb，并进行了脂质体表面修饰，虽然半衰期明显延长，但MetHb的生成明显增加。为了减少MetHb生成以及其他副作用的产生，国内外学者把研究重点转移到生物降解纳米材料包裹Hb的研发上。如聚交酯或聚乙醇酸交酯包裹Hb的纳米级人工红细胞，同时加入MetHb还原酶等酶类。这种生物可降解聚合物包膜可以使外部的葡萄糖和还原酶进入微囊，而反应产物也可透过此膜到囊外，从而避免反应产物对还原反应的抑制。Chang等[14]曾研究出聚乙烯乙二醇-聚交酯包囊包裹了红细胞内全部酶类的纳米级人工红细胞，输注大鼠后血浆中半衰期为24.2小时，在人体有可能达到41.5小时；如果将其重悬于100mg/dl葡萄糖和0.02mM辅酶I(NADH)的乳酸林格液中，5小时后MetHb含量下降到1.5%，说明该包囊还能利用外液体环境中的还原剂有效地还原MetHb。SakaiH等[15]研制出的聚乙二醇修饰的脂质体包被的血红蛋白微囊，正在进行临床试验前的安全和效能评估。我国章晓兰等[16]研究制备了表面孔径可调的载牛血红蛋白(bovinehemoglobin，BHb)纳米微球型血液代用品，并且建立了一套两步还原及过程优化的非酶还原系统控制其中的MetHb含量。通过两步还原及过程控制，MetHb在原料中的含量从90％以上降为1.25％，接近天然血液中MetHb含量，具备携氧／释氧功能。同时，由于微球的膜是可调孔径的多孔结构，进入体内后，血浆中的还原成分可透过微球膜进入其中，可进一步抑制MetHb的生成。这为建立人工红细胞内的还原酶体系奠定了基础。
近年来，利用生物降解聚合物作为Hb载体的研究越来越受到了国内外学者的青睐。国际上如日本Tsuchida小组和美国Rudolph小组等，在利用生物可降解的聚乳酸（PLA）、聚乳酸乙醇酸（PLGA）等高分子材料开发包含Hb、红细胞各种酶类如SOD、MetHb还原酶在内的纳米微囊。我国中国科学院黄宇彬等工作者利用可降解纳米胶束（胶囊）技术合成了两亲性的PEG-MPC-PLA嵌段共聚物，在其胶束的憎水核的表面利用click反应键合了Hb，实验证明该聚合物不仅具有良好的氧合和解离功能，而且表面的PEG链段在水溶液中能自由伸展，可以有效地防止Hb被氧化和免疫系统攻击。同时，他们还合成了两亲性氨基酸共聚物聚赖氨酸-聚苯丙氨酸（PLL-b-PPA)，可以在水中形成一种包裹Hb的微米级囊泡。这不仅可以保证Hb的携氧功能，而且可以有效地保护Hb免受环境中氧化剂的攻击[17,18,19]，也可以将MetHb还原酶等酶类包裹其中，确保Hb不被氧化。王翔等[20,21]基于红细胞力学特性、结构特点与携氧功能的关系,研发了一种与天然红细胞在形态、功能、结构上相似的人工红细胞，重建的人工红细胞具有正常红细胞的携氧和释氧能力，并包含了正常红细胞具有的还原酶类，能够有效地防止Hb被氧化。#p#分页标题#e#
结语
《中华人民共和国献血法》的实施，无偿献血知识的宣传普及，“无偿献血由城市向农村转移”的开展，一定程度上缓解了临床用血供需矛盾，但仍存在巨大的缺口，尤其在战争、自然灾害等情况下更无法满足需求。同时，天然人血细胞还存在保质期短、运输困难等不足。而研发的HBOCs有望实现大规模生产，不仅能大大缓解血源紧张，而且能够克服天然人血细胞的上述不足，有极好的临床应用前景。目前HBOCs的研发已经获得许多突破，有些产品已进入临床应用阶段。但由于在实验研究中对其中的一些不良反应或缺陷没有引起足够的重视，导致不少的HBOCs产品在动物试验和前期临床试验中显示良好的效果，但在后期的临床应用中发现了许多不良后果，以至于研究被中止或废弃。因此，在HBOCs的研究过程中，应该重视其不良反应的研究，从而开发出理想的血液代用品。
本文作者：宋俊贞 魏文志 单位：河北省血液中心 河北白求恩国际和平医院健康管理中心