前言 20世纪70年代，Garrison等首次在生活废水中检测到了药物成分，引起社会上的广泛关注。随后，在污水处理厂、河流、湖泊、海洋、甚至饮用水中都检测到了不同的药物化合物［1］，如抗生素、降压药、降脂药、止痛剂、抗抑郁药、β受体阻滞药、抗癌药等。在欧洲，进入到环境中的药物活性成分已有4000余种［2］。这些药物活性成分对水环境生态安全和人体健康已构成威胁［3］。 四膜虫是一种单细胞原生动物，是毒理学与生态毒理学研究中的优良模式生物之一，并已广泛应用于药物、无机物、有机物的毒理学评价［4－6］。Bamadad等［7］在研究多环芳烃(PAHs)对四膜虫的毒性损伤时，发现四膜虫有类似于普遍存在于哺乳动物肿瘤细胞上、与肿瘤细胞耐药性有关的MDR泵，免疫细胞化学研究结果也进一步证实了这一点。 卡培他滨(CAP)，即5'－脱氧－5－氟－N－［(戊氧基)羰基］胞啶，是一种对肿瘤细胞有选择性活性的口服细胞毒性制剂，在体内可被代谢为5－氟尿嘧啶(5－FU)，从而发挥抗肿瘤作用。卡培他滨的代谢物中，除了5－FU，其它物质在体外试验中均不具有细胞毒性。CAP、5－FU及其它代谢物主要通过肾脏排出，其中2.9%是以CAP原形排出(图1)。根据IMSHealth2007的统计，2006年，CAP在欧洲的使用量为28827kg。由于使用量大，加之易溶于水(LogKow为4．5，Roche2008)，因此CAP及其代谢物对水生生态的影响不容忽视。目前对于环境中CAP残留的生态毒性数据极为缺乏，最近有报道指出，CAP对羊角月牙藻有很强的毒性，72h－ErC50为2.0mg/L［8］。而研究CAP对其他模式生物如四膜虫等影响的报道较为罕见。 本文以四膜虫为模式生物，研究了CAP对嗜热四膜虫细胞的生长以及多药耐药性(MDR)的影响，尝试探索CAP的生态毒性问题，为其科学管理提供依据。 1材料和方法 1．1试验用四膜虫和培养液 嗜热四膜虫(TetrahymenaThermophila，SB210)由中国科学院武汉水生生物研究所馈赠。培养液:胰蛋白胨10g，酵母提取物1g，葡萄糖2g，溶于1L蒸馏水中。搅拌使其充分溶解后分装于10mL试管和250mL锥形瓶中，用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min，冷却后于4℃保存。 1．2试剂与仪器 胰蛋白胨和酵母提取物均为Oxide公司产品，葡萄糖(AR，购自国药集团化学试剂有限公司)，罗丹明(RhodamineB，Sigma－Aldrich，购自于DAHU)。自动手提式灭菌锅(YXQ－LS－18S，上海博讯)，光照培养箱(SPX－250B－G，上海博讯)，多功能酶标仪(ThermoVarioskanFlash)，DSH－系列超净工作台程控仪(上海淀山湖净化设备厂)，高速离心机(3K30，Sigma)。 1．3四膜虫的培养 接种于装有5mL无菌培养液的试管中，置于恒温培养箱中30℃培养48h，随后移取试管中的培养液至250mL锥形瓶中，进行扩大培养，达到对数生长期时即可进行后续实验。 1．4四膜虫浓度与OD值的关系 移取对数生长期的四膜虫细胞液200μL至1.5mL离心管中，加入200μL1%的甲醛进行固定。在显微镜下用原生动物计数框计数，每个样品平行计数5次，最后取平均值，并计算出四膜虫细胞浓度。移取已知浓度的四膜虫细胞悬液，稀释不同倍数。用96孔板读数，并绘制四膜虫浓度与OD值关系曲线。 1．5CAP对四膜虫的毒性试验 在装有45mL无菌培养液的锥形瓶中，加入50μL不同浓度的CAP溶液，并接种5mL预培养至对数生长期的嗜热四膜虫培养液，使CAP终浓度为0.25、1、4、16μM，每个浓度设置3个平行，另设无CAP的对照。30℃培养。在不同培养时间取培养液于96孔板读数，测定OD值，并根据四膜虫浓度与OD值关系曲线，计算出相应的四膜虫浓度。 1．6CAP对四膜虫多药耐药性的影响试验 移取10mL对数生长期的四膜虫培养液于已灭菌的离心管中，分别加入10μL不同浓度的CAP溶液和10μL罗丹明B溶液(浓度为3mM)，使CAP终浓度为2和16μM，以CAP浓度0μM为对照，每个浓度设置3个平行。在恒温培养箱中30℃黑暗培养不同时间，离心收集细胞(1000g，6min)，并用pH为7.4的冰PBS洗涤3次，弃上清液，冻融3次以破碎细胞，随后加入1mLPBS，室温下12000rpm离心6min，取上清液加入96孔板，每孔加100μL。用多功能酶标仪测定荧光强度，激发波长540nm，发射波长590nm。 2实验结果与讨论 2．1四膜虫浓度与OD值关系曲线 四膜虫浓度与OD值关系曲线见图2，方程为y=0．0292x+0．051，R2=0．9891。2．2CAP对四膜虫的生长抑制作用四膜虫在培养24h后进入对数生长期，细胞浓度明显增加，48h后进入稳定期。在36h内，不同测试浓度的CAP(0.25、1、4、16μM)对四膜虫的生长几乎无影响(见图3);在48h，CAP浓度为16μM组与对照组相比四膜虫浓度较低;但在随后时间内，CAP浓度为16μM组的四膜虫细胞浓度快速增加。总体而言，在实验药物浓度范围及暴露时间内，未观察到CAP对四膜虫的生长有明显抑制。说明CAP对四膜虫细胞的毒性作用不大，这有可能是因为进入四膜虫体内的CAP被四膜虫的MDR泵排出体外。 2．3CAP对四膜虫多药耐药性的影响 在一定体积的四膜虫悬液中加入罗丹明B，黑暗中培养不同时间，测定四膜虫体内罗丹明B的积累(见图4)。随着培养时间的增加，四膜虫体内罗丹明B的荧光强度明显增强。相同培养时间内，药物浓度为2μM组的荧光强度略高于对照组和药物浓度为16μM组。说明CAP对四膜虫体内染料的排出机制有一定影响，但不显著。CAP作为抗癌常用药物，只有在体内被代谢为5－FU时才发挥相应作用，而CAP本身并不能抑制肿瘤细胞的MDR。通过CAP对罗丹明B在四膜虫体内积累的试验可以证实，CAP对四膜虫的MDR的影响亦不显著。#p#分页标题#e# 3结论与展望 目前中国的抗癌药用量很大，且在逐年上升。考虑到抗癌药物的排泄率和污水处理厂的去除率，抗癌药随污水处理厂出水和一些其他途径排入天然水体中，对整个天然水环境形成潜在威胁。本研究结果显示CAP对四膜虫细胞的生长抑制无显著影响，同时未观察到CAP对四膜虫的MDR有影响。提示今后的研究中需要进一步测试其他敏感水生物物种或更敏感的分子指标，同时关注CAP代谢产物5－FU的生态毒性问题，加强对抗癌药生态风险的研究和认识，为科学管理提供基础数据。
