水稻是我国主要的粮食作物之一，2009年11月27日中国通过了对转Bt抗虫水稻的生物安全认证，这一举措具有里程碑意义，对转基因作物在中国、亚洲乃至全世界的应用产生重大影响。转Bt基因抗虫水稻因其自身能合成杀虫蛋白，从而有效地降低了农药施用量，展现出广泛的应用前景。但是，随着转Bt基因抗虫作物大面积商品化推广使用，使得大量外源杀虫蛋白以植株残体、根系分泌物或花粉等形式进入土壤环境，进而延长土壤生物与转基因代谢产物的接触时间［1］。虽然Bt蛋白在短期内对土栖动物无负面作用，但由于外源Bt蛋白的杀虫特性不同，以及复合基因代谢产物在土壤中的降解及其与土壤腐殖质酸、蒙脱石或铝羟基等的聚合物多样，进而对土壤生物产生诸多直接或间接的不确定性影响［2］，这也是转基因作物生态风险评估亟待明确的问题。 跳虫是一类广泛分布的小型节肢动物，大多喜好阴凉潮湿的土壤环境以及地表枯枝落叶层等。跳虫种类和数量极其丰富，与线虫和螨类一样是土壤生态系统中的主要功能类群，，并参与物质的分解［3-4］。跳虫对土壤环境污染十分敏感，能敏感指示土壤环境的变化程度［5-7］。国外常用来开展土壤污染的生态风险评价，如利用土壤跳虫的丰富度和多样性等来开展污染物对土壤环境的影响评估［8］，利用土壤跳虫的死亡率、繁殖率、生物富集以及行为效应等作为评估被污染土壤修复成功与否的生物标志物等［9-12］。Al-Deeb等［13］对转Cry3Bb基因棉田土壤弹尾虫的调查结果显示，转基因棉田和亲本对照棉田的弹尾虫数量没有差异。国内，应用土壤动物进行土壤生态风险评价的研究很少，仅见于转Bt基因作物的环境风险研究，如Yu等［14］报道转Cry1Ab和转Cry1Ac基因棉花以及转CryⅢ基因马铃薯的外源Bt毒蛋白对土栖弹尾虫Folsomiacandida和奥甲螨Oppianitens无显著影响。白耀宇等［15］研究指出生活在转Bt水稻残体环境中的跳虫体内检测有微量Bt杀虫蛋白，但这对跳虫的发生量并无不良影响，相反，转Bt水稻稻田中跳虫数量反而显著高于对照亲本田。 与室内试验研究相比，大田试验研究是在开放的野外环境下进行的，因此，研究结果更具实用性，并能切实反映实际情况。目前，在大田层次上进行的转基因植物安全性研究报道较少，Wolfenbarger等［16］认为转基因植物对非目标生物的影响取决于作物被改造的特征及其与生态系统其它部分复杂的关系。因此，大田环境下转基因水稻的安全性是目前急需解决的问题。本研究选取不同基因型(Cry1Abvs．Cry1Ab+Cry1Ac)和不同类型(恢复系和杂交系)的转Bt水稻为研究材料，开展稻田土壤跳虫群落组成及数量动态研究，以进一步明确转Bt作物的土壤环境安全性。 1材料与方法 1．1供试转Bt水稻、 试验所用转Bt水稻为3个转Cry1A抗虫水稻品系及其对照亲本，包括:转Bt水稻恢复系“克螟稻”(Cry1Ab纯合基因型;简称KMD)及其亲本“秀水11”(简称XSD)，稻种由浙江大学原子能研究所提供;转Bt水稻恢复系“华恢1号”(Cry1Ab+CryAc融合基因型;简称HH1)及其亲本“明恢63”(简称MH63)，转Bt水稻杂交系“Bt汕优63”(Cry1Ab+CryAc融合基因型;简称Bt-SY63)及其对照亲本“汕优63”(简称SY63)，稻种均由华中农业大学植物科技学院提供。 1．2试验地布局及耕种 试验地设在山东省宁津县南京农业大学植物保护学院气候变化创新研究基地(37．64°N，116．8°E)。试验地由面积相等的6块相邻样地组成，KMD与XSD、HH1与MH63、Bt-SY63与SY63各东西向两块相邻样地，转基因及其对照亲本由西向东排列，3个水稻品系自南往北依次排列，这样由南向北，前两个水稻品系为恢复系的纯和基因型和融合基因型，后两个品系为融合基因型的恢复系和杂交系;每样地划分为4个小区，每小区5m×20m，且小区东西向和南北向玉米隔离带均为5m。水稻于5月15日旱作直播，播种前按每亩50kg氮肥、30kg磷肥和20kg钾肥施底肥，大田漫灌1次，并于水稻拔节期和孕穗期分别追施N肥(20kg/666．7m2)、P肥(12kg/666．7m2)和K肥(8kg)各1次;此外，播种后间隔3周人工除草和灌溉各1次。 1．3土壤取样、跳虫分离及其鉴定 自水稻播种后一个月，即6月11日开始，每30d进行一次土壤采样，试验于11月8日结束，共采样6次。采样时，用100mL环刀按照品种顺序逐个小区(重复)进行，每小区按S形取样方法取6环刀，每2环刀随机放入一自封袋中，做好标记后带回实验室分别进行分离鉴定。土壤跳虫的分离采用Tullgren干漏斗法，干漏斗上部为40W灯泡，干漏斗中部为金属网筛，网眼2mm，干漏斗下部用装有浓度为75%酒精的白色塑料小瓶收集跳虫［17］。将带回的每个土样混匀后，用100mL标准环刀量取一环刀(即100mL)土样置于干漏斗上，每次分离时间为48h。将分离得到的跳虫按土样标号分别用酒精清洗，然后用霍式封固液封片，玻片做好标号后置于50—60℃的烘箱中干燥1周，使虫体透明、肢体展开，以便进行分类鉴定。土壤跳虫鉴定由中国科学院动物所担任，鉴定到属，同时记录跳虫数量，转化为每平方米土壤跳虫数量，并进一步统计跳虫类群的多样性(H')、种类丰富度(SR)和均匀度(J)等指数［18］。此外，按照殷秀琴等［19］的方法，将土壤跳虫划分为优势类群(即个体数占总捕获量10%以上者)、常见类群(即个体数占总捕获量1%—10%者)和稀有类群(即个体数占总捕获量1%以下者)。同时，按照其活动位置，将土壤跳虫划分为土上生(地表活动)、真土生(土下活动)和半土生(地上地下活动)三类(表1)。 1．4统计分析 用SPSS16．0统计软件进行试验数据的分析。对6月11—11月8日期间，共计6次采样的数据采用“双因子重复测量方差分析”(即Two-wayRepeatedTimeANOVA)，分别比较2对恢复系的不同基因型(Cry1Ab纯合基因型KMDvs．Cry1Ab+Cry1Ac融合基因型HH1)或Cry1Ab+Cry1Ac融合基因型的2对育种品系(即恢复系HH1和杂交系Bt-SY63)转Bt水稻及其对照亲本大田土壤跳虫不同类群百分比组成、密度、多样性指数、种类丰富度和均匀性指数的差异。并进一步通过“群体成对T检验”(即Group-pairedTtest)统计分析调查期间转Bt水稻及其对照亲本间，以及不同水稻品种、不同功能群间以上指标数量动态的显著性差异(P＜0．05)。数据分析前，对绝对值数据进行对数转换，对百分比数据进行反正弦平方根转化，以符合正态分布假设。#p#分页标题#e# 2结果与分析 2．1不同基因型和不同育种品系转Bt水稻大田土壤跳虫群落结构 2．1．1土壤跳虫科(属)及其类群组成 2009年6月15日—11月15日期间，转Bt水稻及其对照亲本稻田共发现6科12属土壤跳虫(表1)。其中，长角跳科的长角跳属、钩圆跳科的钩圆跳属以及齿棘圆跳科的齿棘圆跳属为土上生类群;棘跳科的棘跳属、原棘跳属和Cribrochiurus，以及球角跳科的球角跳属为真土生类群;等节跳科的裔符跳属、原等跳属、等节跳属、似等跳属和类符跳属为半土生类群。由表1可见，裔符跳属和原等跳属为转Bt水稻及其对照亲本大田优势类群，长角跳属是除XSD外其它水稻大田优势类群;此外，棘跳属还是XSD大田优势土壤跳虫类群，球角跳属还是Bt-SY63大田优势土壤跳虫类群;XSD的稀有类群为齿棘圆跳属，Cribrochiurus和等节跳属，MH63的稀有类群为齿棘圆跳属和似等跳属，SY63的稀有类群为类符跳属;除了优势类群和稀有类群外，其它为常见类群。相对于纯合基因型恢复系(如齿棘圆跳属、Cribrochiurus和等节跳属)、融合基因型恢复系(如齿棘圆跳属)和融合基因型杂交系(如等节跳属)而言，转Bt水稻种植导致个别土壤跳虫稀有类群的消失(表1)。统计分析进一步显示，对转Bt水稻恢复系处理而言，不同基因型对棘跳属(F=17．25，P＜0．001)和球角跳属(F=6．95，P＜0．05)影响显著(表2);与Cry1Ab转Bt水稻相比，Cry1Ab+Cry1Ac转Bt水稻可显著降低棘跳属、球角跳属和原等跳属百分比的62．1%、56．7%和61．8%(P＜0．05;表1)，并显著增加裔符跳属百分比达88．2%(P＜0．05;表1)。对Cry1Ab+Cry1Ac处理而言，不同育种品系可显著影响钩圆跳属(F=4．76，P=0．049＜0．05)、球角跳属(F=17．02，P=0．0009＜0．001)和原等跳属(F=10．96，P=0．0079＜0．01)百分比，且转基因处理还可显著影响球角跳属百分比(F=6．63，P=0．024＜0．05;表2);与对照亲本相比，转Bt杂交稻种植可显著增加球角跳属百分比的212．3%;与转Bt水稻恢复系相比，转Bt杂交稻种植可显著提高球角跳属和原等跳属百分比的312．9%和171．6%，并显著降低裔符跳属百分比的65．5%(P＜0．05;表1)。 2．2不同基因型和不同育种品系转Bt水稻大田土壤跳虫数量差异 2．2．1土壤跳虫总发生量 对转Bt水稻恢复系处理而言，不同基因型(F=41．0，P=0．000＜0．001)及转Bt处理(F=8．7，P=0.012)都显著影响土壤跳虫总量，且存在显著的交互作用(F=5．5，P=0．038＜0．05)(表2)。其中，与对照亲本水稻相比，Cry1Ab转Bt水稻土壤跳虫累计发生量显著降低了44．4%(P＜0．05;图1D)。与Cry1Ab转Bt水稻相比，Cry1Ab+Cry1Ac转Bt水稻恢复系土壤跳虫累计发生量显著降低了51．4%(P＜0．05;图1D)。对Cry1Ab+Cry1Ac处理而言，不同育种品系间土壤跳虫发生动态差异显著(F=17．0，P=0．001;表2);其中，与转Bt水稻恢复系相比，转Bt杂交稻土壤跳虫发生量增加显著，调查期间累计发生量增加233．2%(P＜0．05;图1D)。 2．2．2土上生、真土生和半土生土壤跳虫发生量 不同基因型(F=21．2、P=0．001和F=27．1、P＜0．001)和不同育种品系(F=11．0、P=0．006和F=18．0、P=0．001)稻田真土生和半土生跳虫类群发生动态差异显著，且转Bt处理可显著影响融合基因型转Bt水稻处理真土生跳虫(F=7．3，P=0．019＜0．05)和转Bt水稻恢复系处理半土生跳虫发生动态(F=9．9，P=0．009＜0．001;表2)。与对照亲本相比，Cry1Ab转Bt水稻显著降低了半土生跳虫发生动态，其累计发生量减少达54．7%(P＜0．05;图1C);Cry1Ab+Cry1Ac转Bt水稻杂交系显著提高了真土生类群土壤跳虫发生动态，其累计发生量增加达180．4%(P＜0．05;图1B)。此外，与Cry1Ab转Bt水稻相比，Cry1Ab+Cry1Ac转Bt水稻恢复系显著降低了半土生土壤跳虫发生动态，其累计发生量降低达43．4%(P＜0．05;图1C);与Cry1Ab+Cry1Ac转Bt水稻恢复系相比，Cry1Ab+Cry1Ac转Bt杂交稻显著提高了半土生跳虫发生量，其累计发生量增幅达302．4%(P＜0．05;图1C)。 2．3土壤跳虫种类丰富度，群落多样性以及群落均匀性指标 在土壤跳虫种类丰富度方面，对转Bt水稻恢复系处理而言，不同基因型可显著影响土壤跳虫种类丰富度(F=26．38，P＜0．001;表2)。其中，与对照亲本相比，Cry1Ab转Bt水稻显著降低了土壤跳虫种类丰富度，发生期平均降幅达26．7%(P＜0．05;图2A)。此外，对Cry1Ab+Cry1Ac融合基因型处理而言，不同育种品系间土壤跳虫种类丰富度差异也达显著水平(F=20．3，P=0．001;表2)。与转Bt水稻恢复系相比，转Bt水稻杂交系显著增加了土壤跳虫种类丰富度，发生期平均增幅达54．0%(P＜0．05;图2A)。在土壤跳虫群落多样性方面，尽管不同基因型可显著影响恢复系处理稻田土壤跳虫群落多样性(F=11.2，P=0．006＜0．01;表2)，但Cry1Ab转Bt水稻与Cry1Ab+Cry1Ac转Bt水稻恢复系稻田土壤跳虫群落多样性差异不显著(P＞0．05;图2B)。对Cry1Ab+Cry1Ac处理而言，不同育种品系间土壤跳虫群落多样性差异显著(F=6．4，P=0．027＜0．05;表2);与转Bt水稻恢复系相比，转Bt杂交稻显著提高了土壤跳虫群落多样性，平均增幅达16．9%(P＜0．05;图2B)。在土壤跳虫群落均匀性方面，对转Bt水稻恢复系而言，不同基因型处理可显著影响稻田土壤跳虫群落均匀性(F=8．0，P=0．015;表2)，但Cry1Ab转Bt水稻与Cry1Ab+Cry1Ac转Bt水稻恢复系稻田土壤跳虫群落均匀性差异不显著(P＞0．05;图2C)。对Cry1Ab+Cry1Ac处理而言，不同育种品系间及转Bt水稻与其对照亲本间土壤跳虫群落均匀性差异均不显著(P＞0．05;表2和图2C)。 3讨论与展望 土壤是生态系统中物质循环和能量转化过程的重要场所，而土壤生物又是土壤质量评价的重要生物指标。特定环境下的土壤动物群落结构通常是稳定的，当环境发生变化时，群落结构也随之发生相应改变。跳虫作为土壤动物的三大功能类群之一，种类丰富，个体密度大，多样性高，是评价土壤质量最重要的指示物种之一［20-23］。本文通过研究3种转Cry1A品系水稻(即Cry1Ab纯合基因型恢复系“克螟稻”，Cry1Ab+CryAc融合基因型恢复系“华恢1号”和杂交系“Bt汕优63”)及其对照亲本(秀水11、明恢63和汕优63)稻田土壤跳虫群落组成和数量动态，以期对转基水稻恢复系不同基因型(即Cry1Ab纯合基因型和Cry1Ab+Cry1Ac融合基因型)和Cry1Ab+Cry1Ac融合基因型不同育种类型(即恢复系和杂交系)转Bt水稻土壤生态安全性做出评价。结果显示，不同基因型和不同育种方式都显著影响了大田土壤跳虫的群落组成，发生量和相关群落指数;但与对照亲本相比，转Bt基因处理对土壤跳虫的影响大都表现不显著，然而对不同生活类群的跳虫出现了不同的影响，这可能与食物源有关;其中，土上生的类群主要为植食性的，真土生的类群多为菌食性的，半土生的类群多为腐食性的。由于转基因水稻是稻田生态系统的初级生产者，产生的毒性物质通过植株残体和根系分泌物等进入土壤，与土壤腐殖质酸、蒙脱石或铝羟基等的聚合，进而延长土壤生物与转基因代谢产物的接触时间［1］，改变根际微环境，导致根际微生物群落结构发生变化［24］，最终会破坏稻田土壤食物链，因此食物源的变化最终导致了不同生活类群土壤跳虫的不同反应。James等报道转Bt基因作物的Bt蛋白可通过根系分泌物及作物残体进入土壤中，影响土壤中的无脊椎动物以及养分循环［25］。#p#分页标题#e# 与融合基因型转Bt水稻恢复系相比，融合基因型转Bt水稻杂交系显著提高了稻田球角跳属百分比。此外，与对照亲本相比，融合基因型转Bt水稻也显著提高了稻田真土生类群土壤跳虫数量。白耀宇等［15］研究结果表明，在Bt稻残体环境中生活的跳虫有微量Bt杀虫蛋白，但这对其数量的增长并无不良影响，Bt稻田中跳虫数量反而显著高于对照田的。可见，转Bt水稻大田土壤跳虫功能类群对不同基因型和不同育种类型的反应不同。纯合基因型恢复系对对大田土壤跳虫的负面作用较大，而融合基因杂交系对大田土壤跳虫不但没有不良影响，相反还能促进土壤跳虫类群数量增加。另一方面融合基因型中的杂交系较恢复系在半土生类群和总跳虫数量，以及群落多样性和均匀度上影响较小。可见，生产中转Bt水稻杂交系的推广有利于提高土壤跳虫数量和种类丰富度，增加土壤跳虫群落的稳定性，进而有利于其土壤生态功能的发挥。 本研究结果还表明，不同类型土壤跳虫对不同基因型和不同育种类型的转Bt水稻的响应不同。各种跳虫对环境扰动所表现出的不一致性可能与跳虫自身的环境适应能力及其生态可塑性，以及种间竞争能力等相关。Benedict等［26］和Sachs等［27］认为温度、土壤湿度及肥料等环境因素可影响转Bt基因植物外源蛋白的表达量。周冬生等［28］的试验结果也证明了这一点。Hagvar［29］指出环境胁迫下竞争可能对群落组成起着一定的作用。但仅仅通过土壤跳虫群落生态学研究很难对转Bt水稻的环境安全性做出正确而清晰的评价。国内外已开展了相关土壤跳虫的生态毒性测试来评价土壤污染的生态风险研究［30-31］，包括利用同工酶凝胶电泳和酶活性检测的方法［32］对酯酶同工酶进行研究，并以此作为评价转基因植物对昆虫等环境生物影响的检测和监测手段。另外，近年来，在跳虫繁殖率抑制实验评估基础上兴起的跳虫分子生态效应研究也逐渐被关注，而将土壤跳虫生物毒性测试与新技术，如跳虫芯片技术［33］等相结合进行土壤生态风险评价则是未来研究发展的重要方向。相信，随着土壤学、生态学，分子生物学和环境科学等学科间的交叉渗透和发展，对土壤跳虫生态毒理学研究将会有更深层次的认识和发展，而利用土壤跳虫作为环境指示生物将是开展转基因作物环境风险评价的重要研究手段和有利工具。