作者：康毅 刘树文 骆艳娥 但霞 单位：西北农林科技大学葡萄酒学院 陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心 西北大学化工学院
菌种保存培养基、种子培养基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母浸粉10，用HCl或NaOH溶液调节pH值为6.0，121℃灭菌21min。发酵培养基基本成分与种子培养基相同，根据实验目的不同，各成分相应改变。1.2仪器与设备SS-325型立式蒸汽灭菌锅日本TomyKocyo公司；UV-1700型紫外分光光度计日本Shimadzu公司；QYC2102C型立式双层恒温摇床上海福玛实验设备有限公司；RC5C+型高速台式冷冻离心机美国科峻仪器公司。
菌种活化及种子培养将保藏菌种接种划线，待长出单菌落后挑取单菌落划线，30℃恒温培养，24h后于4℃冰箱保存待用。从平板上刮取单菌落，接入2个装有50mL种子培养基(调节pH值为6.0，121℃灭菌21min)的250mL摇瓶中，发酵温度30℃、转速150r/min条件下培养24h后转接于2个装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，再培养24h，条件同上。摇瓶发酵培养将经转接、扩培后的液体发酵培养基摇匀，500mL摇瓶装液量为300mL，接种量3.3%，转速100r/min，发酵温度28℃。单因素试验设计指标测定生物量的测定发酵液稀释一定倍数后，使光密度(OD)值约在0.2～0.8之间，用分光光度计检测其在560nm波长处OD560nm值，所得OD560nm值乘以稀释倍数来表示生物量。甘油产量测定采用甘油试剂盒测定。数据分析实验结果为3次实验的平均值，采用OriginPro8.0和Minitab数据处理软件进行分析。
葡萄糖质量浓度的影响由图1可知，不同葡萄糖质量浓度条件下，甘油在发酵8h时产量均达到最高，而当葡萄糖初始质量浓度252g/L时，整个发酵过程中甘油产量一直维持在相对较高的水平。葡萄糖初始质量浓度108g/L时，生物量最先达到稳定期，但甘油产量并不理想；过高的葡萄糖质量浓度(252g/L)抑制了微生物生长，导致菌体生长较缓慢；葡萄糖初始质量浓度为180g/L时，菌体生长曲线最为规律且生长量最大。由图2可知，当果糖质量浓度为108g/L和180g/L时，甘油产量在发酵60h时达到最高，分别为119.47μmol/L和37.93μmol/L。而果糖质量浓度252g/L时，甘油产量在8h时达到25.29μmol/L。不同初始果糖质量浓度对S.cerevisiae菌体生长影响的差异不显著。
pH值的影响由图3可知，不同初始pH值对S.cerevisiae合成甘油的影响趋势基本相同。发酵16h时各pH值条件下的甘油产量均降到最低，之后又有所增加，48h时各pH值条件下的甘油产量达到最高。pH2.0严重抑制了S.cerevisiae的生长。综合而言，pH3.5较适宜S.cerevisiae菌体生长和合成甘油。
SO2添加量的影响由图4可知，添加20、40、60、80mg/LSO2可以促进S.cerevisiae发酵前期(≤8h)的甘油合成。当发酵进行到24h时，添加60、80、100mg/LSO2条件下的S.cerevisiae甘油产量相对添加20mg/L和40mg/LSO2时高。但是60h后，添加20mg/LSO2中条件下的S.cerevisiae甘油产量明显升高且没有下降趋势。各不同SO2质量浓度添加量条件下，菌体生长良好，差异不明显。
发酵温度的影响由图5可知，不同温度条件下，发酵进行8h时，S.cerevisiae甘油产量明显升高，16h时各发酵温度条件下甘油产量均下降并为整个发酵过程的最低值，而培养基发酵温度22℃和28℃时，菌体生物量分别结束对数期达到稳定。
Plackett-Burman试验的设计方案和结果见表2，表中的“1”表示因子所取得的高水平值，“－1”表示低水平值，试验的响应值为发酵液中甘油含量。Plackett-Burman试验的结果分析如表3所示，根据Minitab软件系统的运行规则，通过P值检验来筛选显著性因素[11]。当因子所对应的P＜0.05时，判断该因子为显著性因素，当P＜0.01时对响应值影响非常显著[12]。据此判断在本研究中pH值和SO2添加量为影响甘油产量的显著因素。实验的置信水平为95%，根据表3中的系数值，得出响应值的一次线性回归拟合方程：Y＝461＋19.3X1＋10.7X2－20.8X3－77.8X4＋104X5(R2＝0.888)。由于X1、X2、X3均为非显著性因素，因而将三者舍掉，将X4＝－1、X5＝1代入回归方程，则Y＝642.8＜655.64，因此Plackett-Burman设计中第6种组合为最优，即初始葡萄糖216g/L、果糖144g/L、发酵温度32℃、pH3.0、SO240mg/L时，得到最大甘油产量655.64μmol/L。
本实验中葡萄糖和果糖的最佳利用值分别为180g/L、108g/L，单以果糖为碳源的菌体生长量明显比葡萄糖低。有研究表明[13-14]，酵母生长速率达到最大时起始单糖条件分别为：葡萄糖175g/L、果糖100g/L、蔗糖200g/L。果糖最适于酵母高产甘油，但不能被菌体有效利用用于生长，摇床培养46h后菌体生长进入稳定期，甘油浓度却开始下降。在Yalcin等[15]的研究中，pH4.0时，两株S.cerevisiae均可获得最大细胞干质量，当pH值升高或降低均阻碍菌体生长，对另一种酿酒酵母Kalecik1而言，甘油产量随pH值上升而增加。甘油产量最大时pH值为6.46，产率最大时pH值为5.92。研究认为，高pH值条件下乙醛脱氢酶活性升高，产生的NADH促使磷酸二羟丙酮形成甘油，以维持细胞氧化还原平衡。本实验中pH值为3.5、6.0时甘油产量较高，pH值为4.5时的甘油产量较pH3.5小。pH值为2.0时甘油产量虽然一直较高，相应的菌体生长量却非常低。可能是过低的pH值增加了酵母细胞的化学压力，为了维持渗透压平衡，细胞中甘油产量随之升高。
向发酵基质中添加SO2并不能阻止乙醛还原为乙醇，反而会促进甘油的过量产生。实际生产中为了增加甘油产量，通常添加更多的SO2，增加1g/L的甘油至少要添加100mg/LSO2。本研究中发酵温度28℃较有利于S.cerevisiaeD254合成甘油和生物量。但也有研究显示，S.cerevisiae最大生长速率出现在发酵温度32℃时，22℃时酵母有最大生长量[16]。与已知研究相比，虽然各影响因素范围基本相同，但本研究中甘油产量远远低于相关研究。原因可能是，本实验所选培养基成分单一，不利于甘油产生。研究表明，基质组成对甘油产量有重大影响。在葡萄醪发酵中甘油和乙醇含量很高，残糖很低，而在葡萄糖、果糖、蔗糖等合成培养基中结果相反。葡萄醪中的微量元素和氮、磷等其他化合物可能提高了甘油和乙醇途径中酶的活性，加快甘油生成，而合成培养基缺乏这样的条件。
本研究通过优化影响S.cerevisiaeD254产甘油的因素，为提升葡萄酒品质提供了理论基础。研究中分别对不同初始质量浓度葡萄糖、果糖、pH值、发酵温度及SO2添加量下S.cerevisiaeD254产甘油量进行了比较，得出最佳初始条件为：其他因素固定条件下，葡萄糖质量浓度180g/L时酵母菌体生长平稳、生长量最高；果糖质量浓度108g/L时酵母甘油产量最高；pH值为3.5更适宜酵母菌体生长和合成甘油；在发酵温度和SO2添加量的单因素试验中也分别得出适宜发酵温度为28℃和适宜SO2添加量为20mg/L。通过单因素试验，筛选出最利于酿酒酵母D254生长和产甘油的各因素的最佳质量浓度，进行Plackett-Burman发酵条件组合试验。优化出的发酵条件组合为：初始葡萄糖质量浓度216g/L、果糖质量浓度144g/L、发酵温度32℃、pH3.0、SO2添加量40mg/L，在此条件下，S.cerevisiaeD254可以获得最大甘油产量655.64μmol/L。#p#分页标题#e#